本文详细介绍了用于临床的嵌合抗原受体T细胞的制备工艺，特别是使用能够进行病毒转导和T细胞培养的自动化细胞处理设备。我们提供了相关建议，并描述了在早期临床试验的工艺开发与实施过程中应注意的潜在问题。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
嵌合抗原受体（CAR）-T细胞是一种有前景的免疫治疗策略，可用于治疗多种恶性与非恶性疾病。CAR-T细胞是经过基因改造的T细胞，可表达一种嵌合蛋白，该蛋白能够识别并结合细胞表面靶标，从而导致靶细胞被杀伤。传统的CAR-T细胞制备方法劳动强度大、成本高昂，且可能存在污染风险。CliniMACS Prodigy是一种自动化细胞处理系统，可在封闭环境中实现临床规模的细胞治疗产品制备，最大限度降低污染风险。整个处理过程在计算机控制下半自动进行，从而 显著减少人为干预，节省时间，并降低操作变异性与错误率。
本文及视频描述了使用该设备制备CAR-T细胞的T细胞转导（TCT）过程。TCT过程包括CD4+/CD8+ T细胞富集、激活、用病毒载体进行转导、扩增以及收获。通过使用“操作矩阵”（Activity Matrix）功能，可对这些步骤的顺序和时间进行安排，从而对TCT过程进行广泛定制。我们逐步展示了符合现行药品生产质量管理规范 (cGMP) 的CAR-T细胞制备流程，并讨论了支持新药临床试验申请（Investigational New Drug, IND）所需的放行检测和非临床实验。我们演示了 采用 半自动化工艺进行临床级CAR-T细胞制备的可行性，并讨论其优缺点。最后，我们介绍了一项正在进行的由研究者发起的临床试验，该试验针对儿童B细胞恶性肿瘤 [NCT05480449]，用以说明该制备工艺在临床环境中的实际应用。
引言
表达嵌合抗原受体（CAR）的T细胞经体外改造后进行过继性转移，在治疗难治性B细胞恶性肿瘤患者中已显示出显著疗效1,2,3,4,5。然而，传统的CAR-T细胞制备方法劳动强度大、耗时长，且需要由经验丰富的技术人员执行高度专业化的操作步骤。例如，自体CAR-T细胞产品的传统制备流程包括：通过密度梯度离心、离心淘析 或磁性分离富集T细胞，随后在无菌培养瓶中使用病毒载体进行细胞活化与转导，再于生物反应器中扩增，最后收获并制剂。近年来已出现多种旨在部分实现该流程自动化的系统。例如，Miltenyi CliniMACS Prodigy（下文简称“处理器”）是一种自动化细胞处理装置，可自动完成上述多个步骤6,7,8,9。有关传统与自动化CAR-T细胞制备方法的深入讨论，可参见近期发表的一篇综述文章10。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有研究均在遵守机构指南并经医院机构审查委员会（IRB）批准的情况下进行，所有受试者均已签署知情同意书，同意在试验背景下公开所收集的数据。
注意：方案的第一部分提供 CAR-T 制造流程的高级概述。其余部分提供逐步操作说明。 该方案描述了使用TCT软件版本1.4的工作流程，此版本为撰写本文时的最新版本。其他版本的TCT软件用户界面可能有所不同。
1. 流程时间线及概述（表1）
- 于周一（第 -1 天）进行操作前的准备工作，执行预检程序。确保处理器及其他设备正常运行，并确认整个生产过程中所需的所有试剂和耗材均已备齐且在有效期内。
- 在第 0 天，将管路套装安装至仪器上。在干浴设备中解冻先前冷冻保存的 T 细胞，并通过无菌焊接将其连接至仪器上的管路套装。
注意：本方案假设自体 T 细胞已通过单采术采集、冷冻保存并储存至生产开始。虽然可以使用新鲜采集的 T 细胞，但这会增加操作复杂性，因为需要协调单采术与 CAR-T 细胞生产的安排。我们强烈建议使用干浴解冻法而非水浴法，以最大限度降低细菌污染风险。 - 使用 CD4 和 CD8 试剂（见材料表）对 T 细胞进行标记，并通过磁珠分选法进行富集。
注意：可选择省略 T 细胞富集步骤，或在将细胞加载到处理器之前完成富集。详见方案第 5 节。
<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
NCT05480449 试验前三次 CAR-T 细胞制备运行的结果如下表 3 所示。每次运行的起始材料、载体、培养细胞因子以及 AB 血清浓度均保持一致。产物在第 7 或第 8 天收获。平均每日细胞增长率为 46%（总细胞数增加），表明 TCT 工艺在促进细胞扩增方面是有效的。这些结果提示，该处理器能够生产出一致且可重复的 CAR-T 细胞产品。
最终产品检测结果汇总于表4，表明CAR-T细胞符合质量控制标准。细胞活力介于88%至94%之间，CD3 T细胞纯度为89%-93%。重要的是，内毒素、支原体、无菌性、复制型慢病毒以及残留白血病细胞均未检出。这些结果证实TCT工艺可生产出符合临床应用监管标准的高质量CAR-T细胞。
本实验建立了三个流式细胞术检测方案（图3）。其中包括用于检测富集前后CD4+和CD8+ T细胞百分比的CD4/CD8检测方案，用于评估转导效率的CD19 CAR-T检测方案，以及用.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
CAR-T细胞疗法已成为治疗B细胞及其他恶性肿瘤的一种前景广阔的治疗策略。然而，传统的CAR-T细胞制备方法存在若干局限性，例如成本高昂、生产过程劳动密集，以及开放式操作步骤增加了污染风险。近年来，已出现多种半自动化平台，包括Miltenyi CliniMACS Prodigy（ "处理器")，已应运而生以解决这些局限性。T细胞转导（TCT）过程被整合至本文所述的处理器中，涵盖在封闭系统内完成T细胞富集、激活、病毒转导、培养扩增及收获等步骤。目前，其他竞争性的自动化细胞处理平台使用范围较窄，但可能在培养参数的实时监测方面更具优势。 有利的设备或材料成本，或更小的占用空间，这可能使其能够在生物安全柜中使用，而无需专用的洁净室空间。选择最适合特定应用和环境的平台至关重要。
细胞和基因治疗（如CAR-T细胞治疗）的一个显著局限性在于商业产品的高成本，这限制了患者获得挽救生命的治疗。这种情况在资源匮乏的地区和非发达国家尤为突出。我们发现，当在具备现有符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的洁净室设施的学术型医院环境中，结合干细胞实验室的条件，并由可执行部分中间过.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
S.K.、S.G. 和 Y.W. 已获得 Miltenyi Biotec 的科研资助。
致谢
作者谨此感谢多位个人和机构对本研究工作的贡献。细胞与基因治疗实验室以及宾夕法尼亚大学转化与相关研究实验室在工艺开发及新药临床试验申请（IND）准备工作方面提供了宝贵的支持。Melissa Varghese 和 Amanda DiNofia 为本论文所依托的工艺开发及 IND 申报准备工作做出了贡献。本研究得到了费城儿童医院细胞与基因治疗协作项目加速资助计划（Acceleration Grant）的支持。作者还感谢 Miltenyi Biotec 在技术和科研方面提供的支持。图1的版权属于 © 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG；保留所有权利。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12 x 75 硼硅酸盐管 | 查尔斯河实验室 | TL1000 | |
| 20 mL 试剂袋 | Miltenyi Biotec | 170-076-631 | |
| 50 mL 一次性离心管 | Fisher | 05-539-10 | |
| 150 mL 转移套装 | Fenwal | 4R2001 | |
| 2,000 mL 转移套装 | Fenwal | 4R2041 | |
| 7AAD | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| 酒精消毒 | 泰科/医疗 | ||
| 袋通路 | Medline | 2300E-0500 | |
| CD19 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-643 | |
| CD19 CAR 检测试剂 生物素 | Miltenyi Biotec | 130-129-550 | |
| CD19 PE | BD | 555413 | |
| CD3 APC | BD | 340440 | |
| CD4 VioBright FITC REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-229 | |
| CD45 VioBlue REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-637 | |
| CD8 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-681 | |
| Cellometer 10微米参考微球 | Nexcelom | B10-02-020 | |
| Cellometer 15微米参考微球 | Nexcelom | B15-02-010 | |
| Cellometer 5微米参考微球 | Nexcelom | B05-02-050 | |
| Cellometer 载玻片 | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| CliniMACS CD4 GMP 微珠 | Miltenyi Biotec | 276-01 | CD4试剂 |
| CliniMACS CD8 GMP 微珠 | Miltenyi Biotec | 275-01 | CD8试剂 |
| CliniMACS PBS/EDTA缓冲液 | Miltenyi Biotec | 130-021-201 | 缓冲液 |
| DMSO | 奥里根 | CP-10 | |
| 50 mL 冻存袋 | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | |
| 冻存管，1.8 mL | Nunc | 12565171N | |
| 冻存管，4.5 mL | Nunc | 12565161N | |
| 人AB型血清 | Valley Biomedical | 经无菌过滤、热灭活 | |
| 人血清白蛋白 25% | Grifols | 68516-5216-1 | |
| 人血清白蛋白 5% | Grifols | 68516-5214-1 | |
| MACS GMP 重组人 IL-2 | Miltenyi Biotec | 170-076-148 | 细胞因子 |
| MACS GMP T细胞激活剂 | Miltenyi Biotec | 200-076-202 | 激活试剂 |
| MycoSeq 支原体检测试剂盒 | Life Technologies | 4460623 | |
| 针头，皮下注射用 14G | Medline | SWD200573 | |
| 针头，SlideSafe 18G | BD | B-D305918 | |
| 移液器吸头，2-200 μL，独立包装 | Eppendorf | 022492209 | |
| 移液器吸头，50-1000 μL，独立包装 | Eppendorf | 022492225 | |
| 10 mL 移液管 | Fisher | 13-678-27F | |
| 25 mL 移液管 | Fisher | 13-675-30 | |
| 移液管 5 mL | Fisher | 13-678-27E | |
| Plasmalyte-A | 巴克斯特 | 2B2544X | 电解质溶液 |
| Prodigy TS520 管路套装 | Miltenyi Biotec | 170-076- 600 | 管路套装 |
| 无菌区域 | Medline | NON21001 | |
| 链霉亲和素 PE-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-106-793 | |
| 1 mL 注射器 | BD | 309628 | |
| 10 mL 注射器 | BD | 302995 | |
| 3 mL 注射器 | BD | 309657 | |
| 30 mL 注射器 | BD | 302832 | |
| 50 mL 注射器 | BD | 309653 | |
| TexMACS GMP 培养基 | Miltenyi Biotec | 170-076-306 | 培养基 |
| 三重采样适配器 | Miltenyi Biotec | 170-076-609 | |
| 病毒载体 | CHOP 临床载体中心 | huCART19 | |
| <强>仪器设备 | |||
| 生物安全柜 | The Baker Co | ||
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom | ||
| CliniMACS Prodigy | Miltenyi Biotec | 200-075-301 | 处理器 |
| 程序降温仪 | 普拉纳/克里奥保存 | ||
| Endosafe nexgen-PTS150K | 查尔斯河实验室 | ||
| 梅特勒天平 | Mettler | ||
| 冷藏离心机 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 冷藏离心机 | Fisher Sci | ||
| SCD 无菌管路焊接仪 | Terumo | ||
| 塞布拉试管封口机 | Sebra | ||
| Varitherm | 巴克 | 干燥解冻装置 | |
| XN-330 血液分析仪 | 希森美康 |
参考文献
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Shah, N. N., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
