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方法文章

自动化细胞处理器上的嵌合抗原受体T细胞制备

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DOI：

10.3791/65488

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2023年8月18日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell and Gene Therapy Laboratory, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Division of Oncology, Department of Pediatrics, Children’s Hospital of Philadelphia, 3Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, 4Division of Transfusion Medicine, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Children’s Hospital of Philadelphia

本文内容

摘要

本文详细介绍了用于临床的嵌合抗原受体T细胞的制备工艺，特别是使用能够进行病毒转导和T细胞培养的自动化细胞处理设备。我们提供了相关建议，并描述了在早期临床试验的工艺开发与实施过程中应注意的潜在问题。

摘要

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞是一种有前景的免疫治疗策略，可用于治疗多种恶性与非恶性疾病。CAR-T细胞是经过基因改造的T细胞，可表达一种嵌合蛋白，该蛋白能够识别并结合细胞表面靶标，从而导致靶细胞被杀伤。传统的CAR-T细胞制备方法劳动强度大、成本高昂，且可能存在污染风险。CliniMACS Prodigy是一种自动化细胞处理系统，可在封闭环境中实现临床规模的细胞治疗产品制备，最大限度降低污染风险。整个处理过程在计算机控制下半自动进行，从而 显著减少人为干预，节省时间，并降低操作变异性与错误率。

本文及视频描述了使用该设备制备CAR-T细胞的T细胞转导（TCT）过程。TCT过程包括CD4+/CD8+ T细胞富集、激活、用病毒载体进行转导、扩增以及收获。通过使用“操作矩阵”（Activity Matrix）功能，可对这些步骤的顺序和时间进行安排，从而对TCT过程进行广泛定制。我们逐步展示了符合现行药品生产质量管理规范 (cGMP) 的CAR-T细胞制备流程，并讨论了支持新药临床试验申请（Investigational New Drug, IND）所需的放行检测和非临床实验。我们演示了 采用 半自动化工艺进行临床级CAR-T细胞制备的可行性，并讨论其优缺点。最后，我们介绍了一项正在进行的由研究者发起的临床试验，该试验针对儿童B细胞恶性肿瘤 [NCT05480449]，用以说明该制备工艺在临床环境中的实际应用。

引言

表达嵌合抗原受体（CAR）的T细胞经体外改造后进行过继性转移，在治疗难治性B细胞恶性肿瘤患者中已显示出显著疗效1,2,3,4,5。然而，传统的CAR-T细胞制备方法劳动强度大、耗时长，且需要由经验丰富的技术人员执行高度专业化的操作步骤。例如，自体CAR-T细胞产品的传统制备流程包括：通过密度梯度离心、离心淘析 或磁性分离富集T细胞，随后在无菌培养瓶中使用病毒载体进行细胞活化与转导，再于生物反应器中扩增，最后收获并制剂。近年来已出现多种旨在部分实现该流程自动化的系统。例如，Miltenyi CliniMACS Prodigy（下文简称“处理器”）是一种自动化细胞处理装置，可自动完成上述多个步骤6,7,8,9。有关传统与自动化CAR-T细胞制备方法的深入讨论，可参见近期发表的一篇综述文章10。

该处理器在CliniMACS Plus功能基础上进行拓展，CliniMACS Plus为经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于造血祖细胞处理的医疗器械。该处理器包含一个细胞培养单元，可实现 细胞的自动化洗涤、分馏与培养图1）。T细胞转导（TCT）过程是处理器设备中的一个预设程序，可大体复制人工CAR-T细胞制备流程。TCT允许通过图形用户界面（ "活性矩阵，" 图2）。由于该处理器可自动完成多个步骤，并将多种设备的功能整合到一台机器中，因此对技术人员的培训要求和专业故障排除能力的需求较低。由于所有步骤均在封闭的一次性管路系统中进行，该处理器可在空气处理设施要求低于开放式生产工艺所需标准的环境中运行。例如，我们正在ISO 8级（相当于欧盟C级）洁净室认证的设施中操作该处理器。

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图1：使用T细胞转导系统制备CAR-T细胞。 图中显示的是已安装管路系统的处理器 。该管路系统可通过无菌焊接连接其他组件，例如含有处理缓冲液、培养基和慢病毒载体的袋子。当将白细胞分离产物加入应用袋后，可使用T细胞分选磁珠对其进行标记，随后通过分离柱，并转移至再应用袋中。分选出的细胞随后被引导至仪器的培养单元进行培养，并用活化试剂进行活化（见材料表）。最终产物被收集在目标细胞袋中。在整个过程中，可无菌方式取出样品用于质量控制。圆圈内的灰色数字代表处理器上编号的阀门，用于控制液体在管路系统中的流向。经11许可转载。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：操作矩阵。 在T细胞筛选与激活后，CAR-T细胞制备过程的其余步骤均可完全自定义。可添加或删除操作 ，并为其安排适当的日期和时间，同时可设定操作完成后的培养体积（体积）。例如，“转导”操作被设定为在第1天上午10:00开始，操作结束时的培养体积设为100 mL。操作矩阵可在整个培养期间随时编辑。该过程的状态可通过加工设备的集成屏幕进行实时监控。 请点击此处查看该图的放大版本。

本文旨在详细介绍使用该仪器制造CAR-T细胞的完整流程，并提供关于过程控制和产品放行检测的指导，这些检测很可能是监管机构批准新药临床试验申请（IND）所要求的。本方案基本遵循供应商推荐的方法，是目前处于单中心研究者发起的I/II期临床试验中评估的IND 28617号申请的基础方案。该临床试验旨在评估使用该仪器制备靶向CD19的人源化自体CAR-T细胞治疗B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）或B系淋巴母细胞淋巴瘤（B-Lly）患者的安全性和有效性[NCT05480449]。试验始于2022年9月，计划招募最多89名年龄在0至29岁之间的B-ALL或B-Lly患者。本文报告了该试验中部分细胞制备的结果。

需要指出的是，尽管本文以可遵循的操作步骤形式呈现为一份实验方案，但应将其视为供他人启动优化自身CAR-T细胞生产工艺的起点。本方案可能存在的部分变异包括：使用新鲜T细胞而非冻存T细胞作为起始材料；采用不同的T细胞富集方法或完全省略富集步骤；使用不同的培养基和细胞因子组合（例如IL7/IL15替代IL2）；调整人AB血清的浓度或完全省略；改变转导时间点；采用“多重转导”（multi-hit transductions）；调整振荡条件、培养体积和换液频率；采用不同的基因转移方法，包括核酸电穿孔或非慢病毒载体；使用不同的终末配制缓冲液和/或冷冻保护剂；以及直接输注新鲜CAR-T细胞，而非冻存后择期回输。这些变异可能对治疗产品的细胞组成和生物学活性产生显著影响。

总体流程步骤操作日期技术细节
细胞富集第0天CD4+/CD8+ T细胞筛选 
细胞激活T细胞培养接种与激活
细胞转导第1天慢病毒转导（100 mL培养体积） 
细胞扩增（随后进行细胞制剂制备）第2天--
第3天培养物洗涤（1个循环）；启动摇床；培养体积增加至200 mL
第4天--
第5天补料（50 mL）；培养体积达到最终体积250 mL
第6天过程取样；换液（-125 mL / +125 mL）
第7天换液（-150 mL / +150 mL）或收获细胞 
第8天过程取样；换液（-150 mL / +150 mL）或收获细胞
第9天换液（-180 mL / +180 mL）或收获细胞
第10天过程取样；换液（-180 mL / +180 mL）或收获细胞
第11天换液（-180 mL / +180 mL）或收获细胞
第12天换液（-180 mL / +180 mL）或收获细胞
第13天收获细胞

表1：工艺时间线及概述。 本表格总结了当前一项临床试验 [NCT05480449] 中采用的T细胞转导（TCT）工艺步骤。该工艺从第0天开始，首先通过 CD4+/CD8+ 选择 进行T细胞富集， 接种培养并激活；第1天进行转导。细胞静置48小时后，进行培养液洗涤，将培养体积增加至200 mL，并采用摇动机制进行振荡培养。第6天采集第一个过程中的样品。当获得的细胞数量足以提供至少三个完整剂量的CAR-T细胞（若患者体重<50 kg，则为5 × 106 CAR-T细胞/kg；否则为2.5 × 108 CAR-T细胞）并完成质量控制检测（约需2 × 106 CAR-T细胞）；或当培养总细胞数达到4-5 × 109 个时，即可收获细胞。缩写：TCT = T细胞转导；CAR-T = 嵌合抗原受体T细胞；MACS = 磁珠激活细胞分选。

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方案

所有研究均在遵守机构指南并经医院机构审查委员会（IRB）批准的情况下进行，所有受试者均已签署知情同意书，同意在试验背景下公开所收集的数据。
注意：方案的第一部分提供 CAR-T 制造流程的高级概述。其余部分提供逐步操作说明。 该方案描述了使用TCT软件版本1.4的工作流程，此版本为撰写本文时的最新版本。其他版本的TCT软件用户界面可能有所不同。

1. 流程时间线及概述（表1）

  1. 于周一（第 -1 天）进行操作前的准备工作，执行预检程序。确保处理器及其他设备正常运行，并确认整个生产过程中所需的所有试剂和耗材均已备齐且在有效期内。
  2. 在第 0 天，将管路套装安装至仪器上。在干浴设备中解冻先前冷冻保存的 T 细胞，并通过无菌焊接将其连接至仪器上的管路套装。
    注意：本方案假设自体 T 细胞已通过单采术采集、冷冻保存并储存至生产开始。虽然可以使用新鲜采集的 T 细胞，但这会增加操作复杂性，因为需要协调单采术与 CAR-T 细胞生产的安排。我们强烈建议使用干浴解冻法而非水浴法，以最大限度降低细菌污染风险。
  3. 使用 CD4 和 CD8 试剂（见材料表）对 T 细胞进行标记，并通过磁珠分选法进行富集。
    注意：可选择省略 T 细胞富集步骤，或在将细胞加载到处理器之前完成富集。详见方案第 5 节。
  4. 在完成 CD4+/CD8+ 细胞富集后，取样进行细胞计数。以 70 mL 培养基（见材料表）作为初始体积，加入 5% 人 AB 血清和重组人 IL-2（25 ng/mL），接种 1–2 × 108 个细胞进行培养。
  5. 向培养体系中加入一管激活试剂（一种与抗 CD3 和抗 CD28 抗体偶联的胶体聚合物纳米基质；见材料表），以激活 T 细胞，并在 37 ºC、5% CO2 条件下静置培养 24 小时。如有需要，可将剩余的 CD4+/CD8+ 细胞冷冻保存作为备用。
    注意：若生产失败，剩余的 CD4+/CD8+ 分选细胞可作为起始材料使用。如果失败仅为技术性原因（如污染或操作失误），且仍有足够数量的细胞，则可考虑使用剩余细胞进行新一轮生产。若起始材料质量存在问题，则可能需要重新进行单采术；但最终应由临床医生决定。无论何种情况，生产失败均为重大事件，应进行调查，并通知申办方及可能的监管机构。
  6. 激活 24 小时后，以适当的感染复数（MOI）用慢病毒载体对 T 细胞进行转导。
    注意：在启动临床产品生产前，必须确定慢病毒载体滴度并建立合适的 MOI。应通过小规模实验测定载体滴度，即在不同载体浓度下对人原代 T 细胞进行转导。选择合适 MOI 时需考虑的因素包括载体成本、期望的转导效率以及可接受的载体拷贝数。本方案采用 30–50% 的 MOI，以降低载体使用成本，并使每个转导细胞的平均载体拷贝数低于 8 拷贝。
  7. 在第 3 天，启动“培养洗涤”程序，并开始低速搅拌，将培养体积增加至 200 mL。
  8. 在第 5 天，向培养体系中添加 50 mL 培养基，使总体积增至 250 mL。
  9. 在培养第 6 天，从培养物中取样，通过流式细胞术检测 CAR-T 细胞比例。利用该数据评估培养物的生长速率，并确定最佳收获时间。
    注意：每次过程取样需取 3 mL 用于检测，共移除 7 mL 培养液体积。
  10. 从第 7 天至第 13 天，若培养尚未终止，则每隔一天最多再取两个过程样品，并每日更换培养基以支持细胞生长。当总有核细胞（TNC）计数达到 5 × 109，和/或已有足够细胞用于所需剂量及放行检测时，即可收获产物。
  11. 在收获当天，从处于活跃生长期的培养物中取一个过程样品。该样品用于支原体、内毒素、复制型慢病毒（RCL）检测、载体拷贝数（VCN）检测、细胞计数、细胞大小分析、流式细胞术及革兰染色检测。
  12. 启动最终收获程序，该程序将移除培养基 ，并使用最终配制缓冲液（含 4% 人血清白蛋白的无菌等渗晶体 溶液；见材料表）对细胞进行洗涤。收获完成后，目标细胞袋中将含有 100 mL 细胞产物，溶于 最终配制缓冲液中。将二甲基亚砜（DMSO）加入至终浓度为 10%（v/v），分装为单剂量，并使用程序控速冷冻仪进行冷冻保存。

2. 第-1天：准备与飞行前检查

  1. 确认 CO2 气体和压缩空气充足，能够使每条管路的入口压力至少达到 20 psi。
  2. 打开处理器并确认启动时无任何错误。如有需要，将时钟设置为正确时间，然后关闭处理器。
  3. 确保已知T细胞起始材料的细胞计数、体积以及总CD4+和总CD8+细胞计数。
  4. 确保整个生产过程中所需的病毒载体、试剂和耗材数量充足。
  5. 将一瓶人AB型血清放入冰箱，过夜解冻。

第3天：管路装置安装

  1. 配制 3 L 处理缓冲液（含 0.5 % (w/v) 人血清白蛋白 (HSA) 的磷酸盐缓冲液/乙二胺四乙酸 (PBS/EDTA) 缓冲液）。
  2. 配制 2 L 培养基（2 L 基础培养基中加入 100 mL 人 AB 血清，终浓度为 5%，并加入两瓶重组人 IL2，每瓶 25 µg；有关这些试剂的更多信息，请参见 材料表）。将 10 mL 培养基转移至一个 20 mL 试剂袋中，并于 4 ºC 条件下过夜保存。
  3. 打开仪器，从触摸屏界面中选择 T 细胞转导工艺 (TCT)。点击 运行 以启动 TCT 工艺；根据屏幕上的指示和提示，由仪器引导用户完成操作流程。
  4. 在 参数输入 界面中，根据提示输入操作员姓名缩写、管路组件批号及其有效期。
  5. 工艺设置 界面提供四种不同的工艺选项。请选择完整工艺 (1)。
    注：其他可选工艺包括从 CD4+/CD8+ 筛选的 T 细胞开始（见下文第 5 节）以及重启先前中止的生产运行。
  6. 根据提示，选择两瓶分选试剂，以匹配 CD4+/CD8+ 分选方法。
  7. 按照屏幕上的说明安装管路组件。确保所有鲁尔接头均拧紧，且管路组件无任何缺陷。
  8. 按照屏幕上的说明启动自动上部和下部完整性测试。
    注：完整性测试失败可能由管路组件故障、安装不当或仪器蠕动泵缺陷引起。我们强烈建议在生产运行中至少额外准备一套管路组件备用。同时建议由第二位技术人员核实管路组件的正确安装。
  9. 按照屏幕上的说明连接培养基和处理缓冲液袋。
  10. 开始自动预冲管路组件。
    注：TCT 工艺必须在预冲后 3 小时内继续进行。请确保 T 细胞起始材料已准备就绪。

4. T细胞富集

  1. 当出现转移细胞产品界面时，开始解冻冻存的 T细胞产品。
    注意：可加入管路系统中的T细胞体积应在50至280 mL之间。目标细胞（CD4+与CD8+细胞之和）的最大数量为3 × 109，总核细胞（TNC）计数上限为2 × 1010。
  2. 将解冻后的细胞转移至一个150 mL转移袋中。通过无菌焊接将转移袋与管路系统的应用袋连接。
  3. 使用质量控制（QC）袋从应用袋中取出样本，并进行细胞计数。
  4. 连接CD4和CD8试剂瓶。
  5. 启动分选（T细胞富集）过程。
  6. 富集完成后，从再应用袋的QC袋中取出CD4+/CD8+分选细胞样本，用于细胞计数、流式细胞术及细胞大小分析。
    ​注意： 需要获得细胞计数 结果后，方可进行下一步操作。

5. 替代方案：从 CD4+/CD8+ 筛选细胞开始

  1. 按照步骤 3.2 所述制备培养基。无需处理缓冲液。
  2. 打开处理器并选择 使用TS装置进行T细胞培养（3） 在 流程设置 屏幕。按照屏幕上的说明和提示操作。
  3. 根据屏幕上的指示，使用培养基而非处理缓冲液对管路套装进行预灌注。
  4. 当 "准备培养-连接细胞产品" 屏幕出现后，开始解冻经CD4+/CD8+筛选的T细胞。
    注意：该流程所需的T细胞（CD4+和CD8+ T细胞之和）最低数量为1.0 × 108.
  5. 将细胞转移至150 mL转移袋中，并用培养基稀释至终体积50 mL。
  6. 将细胞悬液无菌焊接至仪器的重复应用袋。
  7. 从重应用袋的质控袋中取出一份CD4+/CD8+分选细胞样本，用于细胞计数和细胞大小分析。

6. 活动矩阵的培养设置与程序编制

  1. 输入细胞浓度和期望的起始数量（1-2 × 108 个T细胞）。
    注意：仪器将自动从回输袋中泵入适量体积至培养室，并将最终体积调整为70 mL。
  2. 根据屏幕上的说明连接一瓶激活试剂。
  3. 输入5%作为CO2浓度，输入39 °C作为培养室温度。
    注意：制造商建议输入39 °C，或根据仪器校准的特定温度值。
  4. 设置活动矩阵。以增强型喂养程序为起点，根据用户自定义要求修改程序中的各个步骤（图2）。
    1. 确保转导操作的时间为接种后24小时（第1天）。
    2. 确保培养洗涤操作的时间为转导后48小时（第3天）。
    3. 将启动摇床（摇床类型2）的时间设置为培养洗涤开始后30分钟。
    4. 删除所有培养基袋更换和废液袋更换操作。
  5. 在屏幕上点击确定以开始培养。
  6. 如有需要，可将应用袋中剩余的CD4+/CD8+分选细胞冻存，以备将来使用。

第7天：T细胞转导

  1. 根据所需的MOI计算所用慢病毒载体的体积。
  2. 取出储存于4℃、含有10 mL培养基的20 mL试剂袋 ºC过夜（步骤3.2）。解冻载体小瓶，并将7.1中计算的体积转移至20 mL试剂袋中。
    注意：我们建议冷冻任何 用于保留或研发的剩余载体
  3. 修改活动矩阵以设置时间 转导 至未来2分钟。当出现提示时，触摸 好的 开始转导实验操作。
  4. 根据屏幕上的说明，将载体袋与管路组进行无菌焊接。
  5. 根据转导实验实际开始的时间调整活动矩阵。
    注意：建议在接种后20-24小时内开始转导，以确保实际操作可在正常工作时间内进行。
    1. 确保时间 培养液洗涤 转导后48小时（第3天）。
    2. 设置时间 激活Shaker （2型摇床）至培养清洗后30分钟（第3天）。
    3. 确保时间 培养基更换 是在下午（1点） 第6天

第8天：首次中间过程取样

  1. 点击Sample 按钮，并按照屏幕上的指示从正在培养的细胞中获取质控样本。
  2. 进行细胞计数、流式细胞术和细胞大小分析。送检1 mL样本进行革兰染色。
    注意：应每隔一天左右重复一次细胞计数，以监测培养物的生长情况。
  3. 再配制2 L培养基（参见步骤3.2）。
  4. 在活动矩阵中添加一项Medium Bag Exchange操作，设定为从当前时间起2分钟后开始。将Media Exchange操作调整为从当前时间起20分钟后开始。按照屏幕上的指示进行操作。
    注意：Media Exchange是指更换培养腔中的培养基，Medium Bag Exchange是指更换悬挂在仪器上的培养基袋。

9. 收获日（第7至13天中的任意一天）：收获与冷冻保存

  1. 触碰 样本 按钮，并按照屏幕上的说明从活性培养物中获取质控样本。
  2. 将质控样品分为三份，每份1 mL。取1 mL用于流式细胞术、细胞计数和细胞大小分析；取1 mL用于支原体、载体拷贝数、复制型慢病毒和内毒素检测；将最后1 mL送检革兰染色。
  3. 配制终末制剂缓冲液（一种无菌等渗晶体溶液，添加4% HSA，置于2 L袋中，参见 材料表）。留出100 mL该缓冲液，用于后续步骤中配制冷冻保护液。
  4. 修改活动矩阵以设定时间 培养结束 向未来2分钟处移动，并删除所有其他剩余操作。按照屏幕提示将终末配制缓冲液连接至管路组件，并开始收集。
    注意：处理器将自动将细胞转移至目标细胞袋中，体积为100 mL。
  5. 从靶细胞袋的质控袋中取 0.5 mL 样本，进行细胞计数。
  6. 密封靶细胞袋并将其从管路装置上取下。将CAR-T产品按适当剂量分装，并在程序降温仪中进行程序性冷冻保存。将细胞置于液氮气相中长期储存。 液氮储存罐的气相，温度≤ -150 ºC.
    注意：最终制剂的配制和分装剂量需根据具体方案而定。此处提供一个示例，即三份等量的CAR-T细胞及质量控制（QC）冻存管进行冷冻保存。详见第10节。
  7. 从仪器下载过程数据，取下并处理管路组件，然后执行关机程序。

10. CAR-T 细胞的冷冻保存

注意：本方案假设CAR-T细胞在制备完成后即进行冷冻保存，直至患者准备就绪后进行输注。虽然可以直接输注新制备的CAR-T细胞，但这会增加操作上的复杂性，因为需要将CAR-T细胞的制备过程与输注时间精确协调。一旦制备失败，可能会带来严重问题。特别是当临床方案要求在CAR-T细胞输注前进行淋巴细胞清除化疗时，我们强烈建议进行冷冻保存，因为制备失败可能导致患者接受不必要的化疗。监管机构可能要求研究人员在输注前证明产品已通过所有放行检测，若无冷冻保存环节，这一要求可能难以实现。

  1. 从收集的最终100 mL产物中，确定并移除用于满足所需CAR-T剂量、质量控制（QC）冻存管以及进行额外放行检测（例如活力检测）、留样和无菌检测所需的体积。
    注意：制定最终产物分装的完整明确策略至关重要。我们建议在材料充足的情况下，制备多个剂量的产物，以便进行再次输注。每个袋装产物体积为10–20 mL时，可实现快速解冻并便于通过注射器推注输注。建议将每袋产物填充至目标CAR-T细胞剂量（例如，每公斤体重5 × 106个CAR-T细胞或每袋2.5 × 108个CAR-T细胞），以避免在输注当天进行剂量计算。同时建议至少冻存四支QC样品，并考虑可能存在的剩余材料；我们建议保留这些材料，因其可用于研发目的。
  2. 离心细胞以减少体积。
  3. 使用步骤9.3中预留的最终配制缓冲液，将产物重悬至目标最终体积的一半。
  4. 通过在最终配制缓冲液中配制20% DMSO溶液，制备2倍浓度的冷冻保护剂。
    注意：冷冻保护剂的配方和DMSO浓度可根据需要调整。
  5. 以等体积加入2倍浓度冷冻保护剂，使最终DMSO浓度为10%。
    注意：应尽量缩短产物与冷冻保护剂接触的时间。
  6. 填充剂量袋和QC冻存管，并送检1 mL用于无菌检测。
    注意：监管机构通常要求对最终产物进行为期14天的无菌检测。然而，快速无菌检测方法正在出现；目前，药典规定的14天方法仍最为常用。
  7. 使用程序控速冷冻仪进行产物冷冻保存。
    注意：程序控速冷冻仪的程序应经过验证，确保降温速率为约-1 ºC/min，降至约-45 ºC，并对共晶点进行补偿。
  8. 将产物储存于液氮超低温冰箱的气相中，温度不高于-150 °C。

11. 手术操作性能的评估

注意：在整个TCT过程中，需从活性培养物中多次采集质量控制（QC）样本。表2提供了一个表格，可帮助读者 整理结果以供参考，并计算操作性能指标。以下术语由一个字母和一个数字组成（例如“B4”），指的是该 表格中对应的单元格。性能计算中使用的数值如下：B3 = 富集前的总有核细胞（TNC）数；B4 = 富集后的TNC数；E2 = 初始单采产品中CD4+和CD8+ T细胞之和占总细胞数的百分比；E4 = 富集后CD4+和CD8+ T细胞之和占总细胞数的百分比；G2 = 初始产品中CD19+细胞占总细胞数的百分比；G4 = CD4+/CD8+富集后CD19+细胞占总细胞数的百分比；B10 = 收获当天活性培养物中的TNC数。

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表2：操作性能评估表。 本表格用于帮助整理操作过程中所需的检测结果，以计算操作性能统计参数。表格的行代表在操作不同时间点分析的样本，以数字1-11标记。第6至第9行 可用于记录培养第6天后至收获当天之前所采集样本的结果。列表示测定参数，以字母A-H标记。灰色阴影区域不适用。部分其他区域是否适用，取决于操作中是否进行CD4+/CD8+富集以及培养时长。建议在不适用的区域填写“N/A”。缩写：TNC = 有核细胞总数；QC = 质量控制。请点击此处下载本表格。

  1. 通过使用公式（计算富集后CD4+与CD8+ T细胞总数除以富集前CD4+与CD8+ T细胞总数）来计算分选后CD4+/CD8+细胞的回收率1).
    CD4+/CD8+ T细胞恢复 = figure-protocol-2    (1)
  2. 通过将CD4+/CD8+富集后CD19+细胞的总数除以富集前CD19+细胞的总数，计算CD19+细胞的耗竭程度。由于该数值预期为 非常小，报告该分数的对数值，如公式（2):
    记录CD19细胞耗竭 = log10 figure-protocol-3    (2)
  3. 通过使用公式（将收获时活跃培养物中的细胞总数除以接种的细胞数量）来计算总倍增数。3):
    总倍数增长 = figure-protocol-4    (3)
  4. 通过使用公式（以收获当天的总倍数增长量的根值）计算平均每日生长量4):
    平均每日生长量 = 收获天数 √ 总倍数增长    (4)

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结果

NCT05480449 试验前三次 CAR-T 细胞制备运行的结果如下表 3 所示。每次运行的起始材料、载体、培养细胞因子以及 AB 血清浓度均保持一致。产物在第 7 或第 8 天收获。平均每日细胞增长率为 46%（总细胞数增加），表明 TCT 工艺在促进细胞扩增方面是有效的。这些结果提示，该处理器能够生产出一致且可重复的 CAR-T 细胞产品。

最终产品检测结果汇总于表4，表明CAR-T细胞符合质量控制标准。细胞活力介于88%至94%之间，CD3 T细胞纯度为89%-93%。重要的是，内毒素、支原体、无菌性、复制型慢病毒以及残留白血病细胞均未检出。这些结果证实TCT工艺可生产出符合临床应用监管标准的高质量CAR-T细胞。

本实验建立了三个流式细胞术检测方案（图3）。其中包括用于检测富集前后CD4+和CD8+ T细胞百分比的CD4/CD8检测方案，用于评估转导效率的CD19 CAR-T检测方案，以及用...

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讨论

CAR-T细胞疗法已成为治疗B细胞及其他恶性肿瘤的一种前景广阔的治疗策略。然而，传统的CAR-T细胞制备方法存在若干局限性，例如成本高昂、生产过程劳动密集，以及开放式操作步骤增加了污染风险。近年来，已出现多种半自动化平台，包括Miltenyi CliniMACS Prodigy（ "处理器")，已应运而生以解决这些局限性。T细胞转导（TCT）过程被整合至本文所述的处理器中，涵盖在封闭系统内完成T细胞富集、激活、病毒转导、培养扩增及收获等步骤。目前，其他竞争性的自动化细胞处理平台使用范围较窄，但可能在培养参数的实时监测方面更具优势。 有利的设备或材料成本，或更小的占用空间，这可能使其能够在生物安全柜中使用，而无需专用的洁净室空间。选择最适合特定应用和环境的平台至关重要。

细胞和基因治疗（如CAR-T细胞治疗）的一个显著局限性在于商业产品的高成本，这限制了患者获得挽救生命的治疗。这种情况在资源匮乏的地区和非发达国家尤为突出。我们发现，当在具备现有符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的洁净室设施的学术型医院环境中，结合干细胞实验室的条件，并由可执行部分中间过...

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披露

S.K.、S.G. 和 Y.W. 已获得 Miltenyi Biotec 的科研资助。

致谢

作者谨此感谢多位个人和机构对本研究工作的贡献。细胞与基因治疗实验室以及宾夕法尼亚大学转化与相关研究实验室在工艺开发及新药临床试验申请（IND）准备工作方面提供了宝贵的支持。Melissa Varghese 和 Amanda DiNofia 为本论文所依托的工艺开发及 IND 申报准备工作做出了贡献。本研究得到了费城儿童医院细胞与基因治疗协作项目加速资助计划（Acceleration Grant）的支持。作者还感谢 Miltenyi Biotec 在技术和科研方面提供的支持。图1的版权属于 © 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG；保留所有权利。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12 x 75 硼硅酸盐管查尔斯河实验室TL1000
20 mL 试剂袋Miltenyi Biotec170-076-631
50 mL 一次性离心管Fisher05-539-10
150 mL 转移套装Fenwal4R2001
2,000 mL 转移套装Fenwal4R2041
7AADFisher ScientificBDB559925
酒精消毒泰科/医疗
袋通路Medline2300E-0500
CD19 APC-Vio770 REAfinityMiltenyi Biotec130-113-643
CD19 CAR 检测试剂 生物素Miltenyi Biotec130-129-550
CD19 PEBD555413
CD3 APCBD340440
CD4 VioBright FITC REAfinityMiltenyi Biotec130-113-229
CD45 VioBlue REAfinityMiltenyi Biotec130-110-637
CD8 APC-Vio770 REAfinityMiltenyi Biotec130-110-681
Cellometer 10微米参考微球NexcelomB10-02-020
Cellometer 15微米参考微球NexcelomB15-02-010
Cellometer 5微米参考微球NexcelomB05-02-050
Cellometer 载玻片NexcelomCHT4-SD100-002
CliniMACS CD4 GMP 微珠Miltenyi Biotec276-01CD4试剂
CliniMACS CD8 GMP 微珠Miltenyi Biotec275-01CD8试剂
CliniMACS PBS/EDTA缓冲液Miltenyi Biotec130-021-201缓冲液
DMSO奥里根CP-10
50 mL 冻存袋Miltenyi Biotec200-074-400
冻存管，1.8 mLNunc12565171N
冻存管，4.5 mLNunc12565161N
人AB型血清Valley Biomedical经无菌过滤、热灭活
人血清白蛋白 25%Grifols68516-5216-1
人血清白蛋白 5%Grifols68516-5214-1
MACS GMP 重组人 IL-2Miltenyi Biotec170-076-148细胞因子
MACS GMP T细胞激活剂Miltenyi Biotec200-076-202激活试剂
MycoSeq 支原体检测试剂盒Life Technologies4460623
针头，皮下注射用 14GMedlineSWD200573
针头，SlideSafe 18GBDB-D305918
移液器吸头，2-200 μL，独立包装Eppendorf022492209
移液器吸头，50-1000 μL，独立包装Eppendorf022492225
10 mL 移液管Fisher13-678-27F
25 mL 移液管Fisher13-675-30
移液管 5 mLFisher13-678-27E
Plasmalyte-A巴克斯特2B2544X电解质溶液
Prodigy TS520 管路套装Miltenyi Biotec170-076- 600管路套装
无菌区域MedlineNON21001
链霉亲和素 PE-Vio770Miltenyi Biotec130-106-793
1 mL 注射器BD309628
10 mL 注射器BD302995
3 mL 注射器BD309657
30 mL 注射器BD302832
50 mL 注射器BD309653
TexMACS GMP 培养基Miltenyi Biotec170-076-306培养基
三重采样适配器Miltenyi Biotec170-076-609
病毒载体CHOP 临床载体中心huCART19
<强>仪器设备
生物安全柜The Baker Co
Cellometer Auto 2000Nexcelom
CliniMACS ProdigyMiltenyi Biotec200-075-301处理器
程序降温仪普拉纳/克里奥保存
Endosafe nexgen-PTS150K查尔斯河实验室
梅特勒天平Mettler
冷藏离心机赛默飞世尔科技
冷藏离心机Fisher Sci
SCD 无菌管路焊接仪Terumo
塞布拉试管封口机Sebra
Varitherm巴克干燥解冻装置
XN-330 血液分析仪希森美康

参考文献

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CAR T T CD4 CD8
自动化细胞处理器上的嵌合抗原受体T细胞制备
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