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体外胎儿人源血管芯片模型用于研究发育性机械生物学

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DOI：

10.3791/65492

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2023年7月28日

 ,  ,  , 
1Centre for Regenerative Medicine, Institute for Regeneration and Repair, University of Edinburgh, 2Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh

本文内容

摘要

本文介绍了一种从人类多能干细胞分化获得内皮细胞的简单工作流程，随后详细描述了对其进行机械刺激的实验方案。该方法可用于研究内皮细胞发育过程中的力学生物学特性。此方法适用于对机械刺激后从培养芯片中收集的活细胞进行后续分析检测。

摘要

心脏是发育过程中首个形成功能的器官，因此在妊娠早期即启动血液循环。除了运输氧气和营养物质以确保胎儿生长外，胎儿血液循环还通过力学信号调控内皮层内发生的多种关键发育事件。生物力学信号可诱导血管结构改变，建立动静脉特化，并调控造血干细胞的发育。由于发育中组织难以获取，限制了人们对血液循环在人类早期发育中作用的理解；因此，体外（in vitro）模型成为研究血管力学生物学的关键工具。本文介绍了一种从人诱导性多能干细胞分化获得内皮细胞，并将其接种至微流控装置以研究其对力学信号响应的实验方案。该方法可在力学刺激条件下对内皮细胞进行长期培养，随后 回收内皮细胞，用于表型及功能特征分析。本研究所建立的体外（in vitro）模型将有助于阐明 介导力学信号转导的细胞内分子机制，这些机制最终协调调控人类胎儿期的血管发育过程。

引言

在胚胎发育过程中，心脏是首个建立功能的器官1，早在内皮管形成的最初阶段即可检测到收缩活动2。循环系统以及血管内血流所介导的机械信号调控着早期发育的诸多关键环节。在胎儿循环建立之前，血管系统以初级毛细血管网的形式存在；随着心脏开始功能活动，该血管网重组为静脉和动脉血管系统3。在血流启动前，动脉和静脉标志物已在全部内皮细胞中广泛表达，这反映了机械信号在动静脉分化的决定过程中所起的作用4。

血流动力学力不仅调控血管系统的发育，还在调控血细胞形成过程中发挥根本性作用。造血干细胞和祖细胞（HSPCs）起源于一种称为生血性内皮的特化内皮细胞。5,6,7,8，仅存在于胚胎发育早期的不同解剖区域。心脏缺陷模型与 体外 模型已证明，机械信号可指导并增加从生血性内皮产生造血干细胞和祖细胞（HSPC）9,10,11,12,13,14.

不同类型的流体动力学已被证明可差异性地调控细胞周期15，已知在造血性内皮中具有重要作用16,17 以及动脉细胞特化18总之，机械信号在发育过程中对细胞身份和功能具有决定性作用。新型 体外 微流控装置使我们能够克服在人类血液发育过程中研究发育力学生物学所面临的局限性 体内.

本方案的总体目标是逐步描述研究剪切应力对人源性内皮细胞影响的实验流程 体外 由人诱导性多能干细胞（hiPSCs）分化而来。本方案详细介绍了将hiPSCs分化为内皮细胞的操作步骤，以及后续将细胞接种至流体芯片以进行刺激实验的具体方法。利用该方法，可开展多种 体外-衍生的内皮细胞可通过分析其在血流作用下的取向来检测其感知剪切应力的能力。这将使其他实验室能够探究不同内皮细胞类型对剪切应力的响应及其功能后果。

方案

注意：所有细胞培养操作均须在超净工作台内的无菌条件下进行，细胞须在37 °C、含5% CO2的湿润环境中培养。所有细胞因子的配制说明（包括维持培养用的重组人bFGF（rhbFGF）以及分化方案中使用的rhBMP4、rhVEGF、rhbFGF、rhIL6、rhFLT3L、rhIGF1、rhIL11、rhSCF、rhEPO、rhTPO和rhIL3）详见补充表S1。

1. hiPSC 的培养——细胞的解冻、维持与冻存

  1. 维持培养基、生长因子及其他试剂的制备
    1. 通过向DMEM/F-12基础培养基（见材料表）中加入全部hESC无血清培养基添加剂、36 mL的25%牛血清白蛋白（BSA）以及1 mL的55 mM β-巯基乙醇，配制培养基。
    2. 将1 mg的Rho激酶抑制剂（iRock）溶于1 mL DMSO中，分装为每份50 µL，并于-20 °C保存。
      注：这些分装样品可在-20 °C保存1年。解冻后可在4 °C保存1周。
    3. 将玻连蛋白（VTN-N）溶液置于冰上解冻，并在-80 °C保存前按每管60 µL分装。使用前，将60 µL储备液加入6 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中稀释，终浓度为5 µg/mL。
  2. hiPSC细胞系的复苏
    注：人多能干细胞系 SFCi55此前由本实验室自主建立，并已广泛用于向多种细胞类型及不同胚层谱系的分化研究19,20,21,22。
    1. 用1 mL VTN-N溶液对6孔板中的一个孔进行包被，37 °C孵育1小时。
      ​注：包被后的培养板可在4 °C保存最多1周。
    2. 用移液器吸除VTN-N溶液，加入1 mL预热的培养基，并补充20 ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhbFGF）（补充表S1）。
    3. 将含有hiPSCs的冻存管在水浴中快速解冻，并将细胞转移至5 mL预热的培养基中。
    4. 室温下以300 × g离心3分钟。
    5. 将细胞沉淀重悬于0.5 mL补充有20 ng/mL rhbFGF的培养基中。
    6. 将细胞转移至已包被且含有1 mL培养基的孔中。
    7. 向含细胞的孔中加入5 µL iRock，终体积为1.5 mL。
    8. 将细胞置于培养箱中培养，每周工作日每天更换培养基，并在周末进行双倍喂养，即加入两倍正常体积的培养基，以确保细胞在周末期间获得足够营养。
      注：细胞仅在iRock存在条件下培养24小时。
  3. hiPSCs的维持与传代
    1. 每日更换新鲜预热的培养基，补充20 ng/mL rhbFGF。
    2. 当细胞融合度达到约80%时进行传代，通常每周两次。
      1. 传代时，按照步骤1.2.1和1.2.2所述方法用VTN-N对培养板进行包被。
      2. 吸除含细胞孔中的培养基，并用DPBS洗涤细胞。
      3. 吸除DPBS，每孔加入1 mL解离试剂（见材料表），孵育1分钟。
      4. 吸除解离试剂，继续孵育3分钟，用力在每侧轻敲培养板10次。
        注：解离步骤的孵育时间和敲击操作可能需要根据细胞类型进行优化。
      5. 向孔中加入1 mL培养基，用巴斯德移液管轻轻吹打一次，确保收集到大部分细胞克隆。
      6. 将150 µL细胞悬液接种至每个新孔，传代比例为1孔传6孔。
        ​注：刚复苏新冻存管时，建议以较低比例（如1:1或1:2）传代1至2次，使细胞进入稳定增殖阶段后再采用1:6的比例传代。
      7. 将细胞置于培养箱中培养，工作日每日更换培养基，周末进行一次双倍喂养。
  4. hiPSC细胞系的冻存
    注：为确保建立一批恒定低代次的冻存细胞库以供后续培养起始使用，应在细胞复苏后的前两次传代内完成冻存。当细胞融合度达到约80%时进行冻存。
    1. 更换为新鲜预热的培养基，补充20 ng/mL rhbFGF和5 µL iRock，孵育至少1小时。
    2. 按照步骤1.3.2.2–1.3.2.5所述方法使细胞脱离。
    3. 将脱离的细胞收集至含有5 mL培养基的15 mL离心管中。
    4. 室温下以300 × g离心3分钟。
    5. 吸除上清液，加入1 mL冷冻保存液（见材料表）。
    6. 用巴斯德移液管轻轻吹打细胞，使其与冷冻保存液充分混匀。
      ​注：避免过度吹打，以免导致细胞团块解离。
    7. 将细胞悬液平均分装至两个冷冻保存管中，每管0.5 mL。
    8. 将冻存管转移至预冷至4 °C的冷冻保存盒中。
    9. 将装有细胞的容器置于-80 °C冰箱中24小时，之后转移至液氮中进行长期保存。

2. 将人诱导多能干细胞分化为内皮细胞

  1. 分化培养基、细胞因子和生长因子的制备
    1. 根据表1配制无血清分化培养基（SFD）。从分化第0天至第5天使用该培养基。
    2. 通过向34 SFM基础培养基中添加34营养补充剂和5 mL L-谷氨酰胺补充剂，配制CD34+细胞用无血清培养基（SFM-34）（见材料表）。从分化第6天起使用该培养基。
    3. 将1 mg CHIR99021溶于716 µL DMSO中，配制成3 mM溶液。室温孵育至完全溶解；如需要，可在37 °C快速加热。分装为20 µL每份，于-20 °C保存不超过6个月。解冻后立即使用，不得再次冷冻或长期储存。
    4. 按照补充表S1中的说明重悬细胞因子。将所有细胞因子分装后储存于-80 °C。
  2. 内皮细胞分化
    注意：每天分化过程中，根据表2中描述的细胞因子混合物，为每个6孔板（每孔3 mL）准备18 mL预热的SFD培养基。
    1. 第0天——形成拟胚体（EBs）
      1. 根据表2，为每个6孔板（每孔3 mL）配制含细胞因子混合物1的18 mL SFD培养基。
      2. 在防细胞黏附的6孔板的每孔中加入2 mL预热的含细胞因子混合物1的SFD培养基（见材料表）。
      3. 按照步骤1.3.2.2–1.3.2.4所述操作形成拟胚体。
        注意：开始分化时，确保hiPSCs融合度为70–80%。
      4. 向每孔脱离的细胞团块中加入1 mL预热的含细胞因子混合物1的SFD培养基。
      5. 使用巴斯德吸管轻轻将细胞团块以1:1比例转移至防细胞黏附孔板的单个孔中，用于拟胚体形成。
      6. 将板放入培养箱后，前后、左右轻轻移动，使拟胚体在孔内均匀分散。
    2. 第1天——更换拟胚体培养基
      ​注意：仅当分化第1天时，悬浮液中存在大量单个细胞与拟胚体共存的情况下，才需要执行此步骤。
      1. 根据表2，为每个6孔板（每孔3 mL）配制含细胞因子混合物1的18 mL SFD培养基。
      2. 轻轻晃动含拟胚体的孔板，使其聚集至孔中央，然后用巴斯德吸管收集至15 mL离心管中。
        注意：若拟胚体呈串状聚集，收集前可用P1000移液器反复吹打以分离。
      3. 静置5–10分钟，使拟胚体沉降至管底。
        注意：若拟胚体过小，可在100 × g条件下离心5分钟以助其沉降。
      4. 用无菌水或DPBS清洗防细胞黏附孔板，去除任何单个细胞或碎片。
      5. 小心缓慢地吸除上清液，避免扰动拟胚体。
      6. 向防细胞黏附孔板的每孔中加入2 mL含细胞因子混合物1的SFD培养基。
      7. 使用含细胞因子混合物1的SFD培养基重悬拟胚体，每孔起始使用1 mL培养基——对于6孔板，共加入6 mL培养基。
      8. 将拟胚体以每孔1 mL体积转移至已含2 mL SFD培养基的防细胞黏附孔板中。
      9. 将板放入培养箱后，前后、左右轻轻移动，使拟胚体在孔内均匀分散。
    3. 第2天——添加CHIR99021
      1. 将拟胚体轻轻晃至孔中央，并根据表2沿孔壁加入CHIR99021，避免直接接触细胞。
        注意：若第1天未更换培养基，则应更换全部培养基而非仅添加CHIR99021。此时需根据表2为每个6孔板（每孔3 mL）配制含细胞因子混合物2的18 mL SFD培养基。
      2. 将板放入培养箱后，前后、左右轻轻移动，使拟胚体在孔内均匀分散。
    4. 第3天——更换拟胚体培养基并添加细胞因子混合物3
      1. 根据表2，为每个6孔板（每孔3 mL）配制含细胞因子混合物3的18 mL SFD培养基。
      2. 按照步骤2.2.2.2–2.2.2.4所述方法收集拟胚体。
      3. 向防细胞黏附孔板中每孔加入预热的2 mL含细胞因子混合物3的SFD培养基。
      4. 小心吸除拟胚体上清液，每孔加入1 mL含细胞因子混合物3的SFD培养基。
      5. 按照步骤2.2.2.8–2.2.2.9所述方法将拟胚体分配至各孔中。
    5. 第6天——更换为SFM-34培养基并添加细胞因子混合物4
      1. 根据表2，为每个6孔板（每孔3 mL）配制含细胞因子混合物4的18 mL SFD培养基。
      2. 按照步骤2.2.2.2–2.2.2.4所述方法收集拟胚体。
      3. 向防细胞黏附孔板中每孔加入2 mL预热的含细胞因子混合物4的SFM-34培养基。
      4. 小心吸除拟胚体上清液，每孔加入1 mL含细胞因子混合物4的SFM-34培养基。
      5. 按照步骤2.2.2.8–2.2.2.9所述方法将拟胚体分配至各孔中。

3. CD34+ 细胞的分离及接种至芯片

注意：CD34+ 细胞通过使用 CD34 磁珠试剂盒（参见材料表）进行阳性分离法获得，该试剂盒包含与单克隆小鼠抗人 CD34 抗体偶联的 CD34 磁珠以及 FcR 阻断试剂（人 IgG）。通过流式细胞术分析分离前后细胞的染色情况，以验证柱分离效率，这一点非常重要。以下将说明进行该分析时需要取样的时间点。

  1. 准备材料和试剂。
    1. 通过将5 mL的5% BSA溶液和200 µL的0.5 M EDTA加入45 mL的DPBS中，配制洗涤缓冲液，得到PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA。每次分离前新鲜配制，过滤除菌后冷藏保存至使用。
    2. 用DPBS Ca2+ Mg2+将rhLaminin 521按1:50稀释，制备层粘连蛋白溶液，并将适量体积的该溶液加入所用流体芯片中进行包被，于培养箱中孵育2小时，以备后续接种细胞。
      注意：可使用其他基质进行包被，应针对特定细胞类型或实验进行测试。
    3. 在18 mL SFM-34培养基中加入Mix 4细胞因子（见表2），配制Mix 4 SFM-34培养基，并将混合液置于50 mL离心管中，管盖略微松开后放入培养箱，以促进气体交换。
    4. 将选定的灌注装置及其他将使用的管路放入培养箱中脱气。
  2. 第8天——EB的解离与CD34+细胞分离
    1. 按照步骤2.2.2.2–2.2.2.5所述方法收集EB。
    2. 每孔收集的EB加入1 mL细胞解离试剂（若收集了6孔，则加入6 mL）。
    3. 将含细胞解离试剂的EB悬液每孔回加1 mL至防粘附培养板的各孔中。
    4. 在培养箱中孵育10分钟。
    5. 使用P1000移液器轻轻吹打EB，使其在孔内上下移动，不超过10次。
    6. 重复步骤3.2.4–3.2.5，共进行3次。
      注意：若EB难以解离，可总共重复上述步骤4次。
    7. 每孔解离后的EB加入5 mL洗涤缓冲液。
    8. 将细胞悬液通过40 µm滤网收集至50 mL离心管中。取10 µL细胞悬液用于细胞计数。
      注意：为检测分离效率，将105个细胞/管分别转移至两个不同离心管中（未染色对照管和分选前测试样本），后续用于流式细胞术分析（见步骤4.3.9–4.3.13）。对于6孔板，过滤后应收集约106个细胞。
    9. 以300 × g离心10分钟，沉淀细胞。
    10. 用300 µL洗涤缓冲液重悬细胞，轻轻吹打数次，确保无细胞团块。随后按照试剂厂商说明书操作（见材料表）。
  3. 将CD34+细胞接种至流体芯片
    注意：本方案所用流体芯片的通道高度为0.6 mm，长度为50 mm，总生长面积为2.5 cm2（补充图S1）。此类芯片接种总体积为150 µL细胞悬液。可使用不同规格芯片，接种体积和细胞密度应根据生长面积进行调整。根据所用细胞系及其生长特性，可能需要进一步优化。
    1. 将分离得到的CD34+细胞重悬于300 µL预热的含Mix 4细胞因子的SFM-34培养基中。
    2. 取10 µL细胞悬液进行细胞计数。
    3. 将2.5 × 105个细胞重悬于终体积为150 µL的含细胞因子SFM-34培养基中，并加入0.5 µL iRock。
      注意：为检测分离效率，将105个细胞/管转移至一个离心管中（分选后测试样本），后续用于流式细胞术分析（见步骤4.3.9–4.3.13）。
    4. 将P200移液器吸头插入通道边缘的储液区，缓慢吸出芯片中的层粘连蛋白溶液。
      注意：若液体难以吸出，可缓慢抬起芯片一侧，帮助液体流向对侧储液区。
    5. 平稳地将细胞悬液加入通道中，确保不产生气泡。
      ​注意：步骤3.3.4–3.3.5应快速而轻柔地操作，避免层粘连蛋白干燥及芯片通道内形成气泡。若产生气泡，可抬起芯片一侧并轻敲载片，使气泡移动至储液区；气泡到达后会上升至气液界面，不应重新进入通道。
    6. 将芯片转移至培养箱中过夜培养，使细胞完全贴壁并呈现伸长形态。
    7. 待细胞完全贴壁后，参照步骤3.3.4吸除培养基，并更换为200 µL含细胞因子的SFM-34培养基。
    8. 此后每日更换培养基，直至细胞达到90%–100%汇合度。

4. 连续流动在内皮细胞中的应用——芯片上的主动脉

  1. 准备材料和试剂。
    1. 根据表2，向18 mL SFM-34培养基中添加Mix 4细胞因子，配制Mix 4 SFM-34培养基，并将其置于50 mL离心管中，管盖略微松开后放入培养箱，以促进气体交换。
    2. 将选定的灌注组件及流体系统中使用的任何管路放入培养箱中进行脱气。
  2. 流体系统组装
    1. 按照制造商的操作说明将灌注组件安装到设备中。
      ​注意：请记得在系统中使用夹子。若使用滑动夹子，需在将管路连接至芯片前先将其套在管路上。
    2. 安装新的流体芯片，并加入含细胞因子的SFM-34培养基，确保在生物安全柜内无菌条件下填满两个储液槽。
    3. 运行去气泡程序并执行校准步骤。
    4. 将连接有灌注组件的流体单元从培养箱中取出，转移至生物安全柜；同时将含细胞的芯片也从培养箱中取出。
    5. 在测试芯片两侧的管路上使用夹子夹紧。
    6. 将管路从测试芯片上拆下。
      注意：检查管路末端鲁尔接头处是否存有气泡。若可见气泡，需使用P200移液器小心吸除，必要时补充培养基，确保接头完全充满培养基。
    7. 将含细胞的芯片与管路连接。
    8. 移除或打开夹子。
    9. 将系统转移回培养箱，并将空气泵连接至流体单元。
    10. 使用泵专用软件（补充图S2）启动预设程序，按照表3中描述逐步增加剪切应力。
      注意：根据具体实验需求，刺激程序可能需要优化。此处描述的是逐步增加剪切应力至最终值5 dyn/cm2，该值模拟了胎儿循环开始时背主动脉壁所受的剪切应力9。无论最终采用的剪切应力值如何，都必须随时间逐步增加，以使细胞能够适应剪切力，避免细胞从芯片上脱落。若所选刺激程序超过3天，应通过添加1 mL含Mix 4细胞因子的SFM-34培养基（相当于通常加入18 mL培养基中的细胞因子量）补充细胞因子。操作时，可短暂暂停泵程序，并向流体组件中的两个注射器各加入500 µL补充培养基。
  3. 用于分析的细胞收集
    1. 将解离缓冲液在水浴中预热。
    2. 将流体单元从培养箱中取出并移至生物安全柜中。
    3. 在芯片两侧的管路上使用夹子夹紧，并将管路从芯片的储液槽上拆下。
    4. 轻柔地从芯片中移除培养基，并用含Ca2+ Mg2+ 的DPBS洗涤细胞。
      注意：若细胞开始脱落，可省略此PBS洗涤步骤。
    5. 轻柔加入150 µL解离缓冲液，在37 °C孵育3分钟。
      注意：在显微镜下观察细胞是否已完全解离为单细胞；若未完全解离，可额外孵育2分钟。在吸除培养基前，必须确保细胞已完全从微通道脱离，因为该芯片不允许通过移液操作辅助细胞脱落。也可使用其他解离溶液，如胰蛋白酶或EDTA缓冲液。
    6. 从一个储液槽中收集含有细胞的解离缓冲液，转移至15 mL离心管中，并用DPBS冲洗通道一次，以收集所有脱落的细胞。
    7. 向含细胞的15 mL离心管中加入1 mL洗涤缓冲液，并 取10 µL进行细胞计数。
    8. 将细胞悬液分装至流式细胞术检测管中，每管含105个细胞。
    9. 在300 × g条件下离心5分钟。
    10. 配制染色液，每管准备50 µL染色液。分别以1:100和1:200稀释比例加入CD34 PerCP-efluor710或CD34-PE抗体。
    11. 将细胞重悬于50 µL染色液中，在4 °C孵育30分钟。
    12. 加入2 mL洗涤缓冲液洗涤细胞，在300 × g条件下离心5分钟。
    13. 将细胞沉淀重悬于100 µL染色液中，使用流式细胞仪获取数据。
      注意：也可直接在芯片中裂解细胞以提取RNA，使用150 µL RNA裂解缓冲液；或使用含4%多聚甲醛的DPBS在室温下固定10分钟，用于成像分析。
  4. 细胞取向分析
    1. 使用FIJI23（补充图S3）分析图像，定量细胞取向的变化。
      1. 从分析 | 工具 | 感兴趣区域（ROI）管理器菜单中打开感兴趣区域（ROI）管理器。
      2. 使用多边形选区工具手动绘制细胞轮廓，并通过点击添加或使用CTRL+T快捷键将其加入ROI管理器。
      3. 在分析 | 设置测量值菜单中选择“拟合椭圆”测量，以测定每个ROI的取向。
      4. 通过ROI管理器中的更多... 多重测量命令，将测量应用于所有ROI。
        注意：此步骤将为每个ROI拟合一个椭圆，并生成包含主轴、次轴长度及角度的表格。
      5. 将表格导出为CSV文件，以便导入其他软件进行绘图。
        注意：用于绘图的脚本可在 https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf885
        0ddc 获取。

结果

本文介绍了一种由人诱导多能干细胞（hiPSCs）来源的内皮细胞进行分化及机械刺激的实验方案，可用于研究这些细胞对机械信号的响应（图1）。该方案可获得具有功能性机械敏感性的内皮细胞。本文提供了代表性结果，并描述了预期的表型特征，以评估细胞在分化过程中对细胞因子刺激的响应情况。

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图1：分化与机械刺激实验方案示意图。 分化方案示意图，显示不同细胞因子混合物的处理时间、CD34+ 细胞分离、流体芯片接种以及机械刺激后细胞的最终分析。请点击此处查看此图的放大版本。

hiPSCs 的培养
必须从处于自我更新状态且生长良好的 hiPSCs 开始本实验方案。判断培养质量的一个良好指标是细胞的生长速度。解冻后，细胞可能需要 2–3 周才能达到适合分化的理想生长阶段。当细胞能够以 1:6 的比例每周传代两次，并在传代当天几乎达到完全汇合时，即可在传代当天开始诱导分化。

将人诱导多能干细胞分化为内皮细胞
分化的第一步是形成拟胚体（embryoid bodies, EBs），该步骤依赖于细胞系，可能需要针对所使用的特定细胞系进行一定优化。在方案步骤1.3.2.2–1.3.2.4中描述的解离过程，可通过缩短或延长解离试剂的孵育时间，以及调整巴斯德吸管吹打解离的程度来进行修改。此外，除使用切割工具或P100吸头进行物理性解离菌落外，也可选用其他解离试剂完成此步骤。高质量的EBs在分化第2天时边缘清晰，在显微镜下观察呈现透亮且明亮的形态；较暗的区域可能提示EBs内部出现细胞死亡（图2）。

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图2：类胚体 形态学。 （A）第2天的类胚体，显示边界清晰、大小均一。 （B）第2天质量较差的类胚体，显示广泛的细胞死亡，导致结构解体。比例尺 = 500 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

在第2天，向EBs中添加CHIR99021可抑制GSK-3蛋白，从而激活Wnt信号通路。不同细胞系对CHIR处理的反应各异，应通过使用不同浓度的CHIR处理并量化第8天获得的CD34+细胞数量来测试其效果（图3）。

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图3：不同CHIR处理下的内皮细胞分化。 在分化第8天通过CD34膜表达量测定内皮细胞分化情况，并采用流式细胞术进行定量分析，CHIR处理时间为第2天，浓度分别为（A）3 µM、（B）5 µM 和（C）7 µM。流式细胞术数据使用五激光细胞仪及专用软件获得（见材料表）。请点击此处查看该图的放大版本。

CD34+ 细胞分离
使用磁珠进行 CD34+ 细胞富集后，必须验证洗脱液中 CD34+ 细胞比例至少达到 80%。为确保足够的纯度，可取磁性分离获得的细胞样本通过流式细胞术进行分析，并需注意使用与磁珠富集所用抗体不同克隆号的抗体。本实验中使用了 4H11 克隆号抗体，富集后纯度约为 85%（图 4）。

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图4：磁性分选富集前后CD34的膜表达情况。 对第8天解离的类胚体（灰色）及磁性富集后的细胞（绿色）进行CD34表达染色，并通过流式细胞术分析，结果显示分选后实现了有效的富集。流式细胞术数据采用五激光流式细胞仪及专用软件获得（见材料表）。请点击此处查看该图的放大版本。

将细胞接种至流体通道
在将细胞接种至流体通道时，追踪内皮细胞的黏附与增殖至关重要。接种后，细胞完全黏附至通道约需 5 小时（图 5A）。在此阶段，也可尝试其他包被溶液以改善细胞黏附效果。为验证所用细胞具有机械敏感性，即能够响应机械刺激，可随时间检测细胞的取向变化。刺激前的细胞呈随机取向（图 5A 和 图 5C），而在流体剪切力作用下，细胞会重新排列并平行于流动方向（图 5B、C）。本文所述方案允许从通道中回收细胞以进行后续分析，例如流式细胞术，用于研究其膜表面免疫表型，从而确认受刺激细胞的内皮细胞特性（图 5D、E）。

figure-results-5
图5：hiPSCs来源的内皮细胞的力学响应性。（A）接种后48小时分离的CD34+细胞形成的融合层。（B）动态培养3天后内皮细胞的重新取向。（C）动态培养5天后内皮细胞的取向分析。（D）在流动条件下培养5天后细胞的CD34表达谱。（E）从流体通道中回收的细胞群体中CD34+细胞的百分比。图像使用倒置培养箱显微镜拍摄；流式细胞术数据使用五激光流式细胞仪及专用软件获得（见材料表）。比例尺 = 100 µm（A,B）。请点击此处查看该图的高清版本。

试剂储存浓度添加体积终浓度
Iscove’s 改良 Dulbecco’s 培养基 (IMDM)-333 mL-
Ham’s F-12 营养混合物 (F-12)-167 mL-         
N-2 补充剂 (100x)100 x5 mL1x
B-27 补充剂 (50x) 50 x10 mL1x
抗坏血酸10 mg/mL1.25 mL25 µg/mL
α-巯基甘油 (MTG)11.5 M19.5 µL448.5 µM
人血清白蛋白100 mg/mL2.5 mL0.5 mg/mL
全转铁蛋白100 mg/mL0.75 mL150 µg/mL

表1：无血清分化（SFD）培养基的成分与配制方案（500 mL）。

分化天数细胞因子混合物细胞因子终浓度
第0–2天混合物1BMP420 ng/mL
第2天混合物2CHIR990217 μM
从第3天起混合物3和4VEGF15 ng/mL
bFGF5 ng/mL
从第6天起混合物4IL610 ng/mL
FLT3L10 ng/mL
IGF125 ng/mL
IL115 ng/mL
SCF50 ng/mL
EPO3 U/mL
TPO30 ng/mL
IL330 ng/mL

表2：用于内皮细胞分化的细胞因子混合物、添加至SFD培养基的天数及终浓度。

剪切应力 (dyn/cm2) 时间 (h)
0.51
11
1.51
21
2.51
31
3.51
41
4.51
5直至实验结束

表3：动态培养的剪切应力值及其施加时间。

补充图 S1：本实验方案所用芯片和管路的几何形状与尺寸。 请点击此处下载该文件。

补充图 S2：控制气泵的软件操作分步指南，包含每一步的详细说明。 请点击此处下载该文件。

补充图 S3：使用 FIJI 进行取向分析的指南，展示细胞形态的绘制、椭圆拟合及最终测量结果。 请点击此处下载该文件。

补充表 S1：分化方案中所用细胞因子的单位大小、重悬体积及储存浓度。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文所述方案可用于从人多能干细胞生成机械敏感性内皮细胞，并研究这些细胞对由可控剪切应力介导的机械刺激的响应。该方案完全基于细胞因子，且与cGMP级试剂完全兼容，具有转化为细胞治疗用细胞生产的潜力。

人诱导多能干细胞（hiPSCs）的建立为研究胚胎发育早期阶段提供了重要的模型，使得科学家能够研究那些在体内难以观察的过程in vivo24。事实上，目前可用于研究的人类胚胎组织均来自无循环系统的胚胎，这可能对由机械信号调控的分子特征产生显著影响。本文所述的方法可实现活体成像以及对细胞剪切应力响应的实时研究。将hiPSCs与微流控技术相结合，构建出一种研究模型，克服了在循环系统启动并重塑心血管及血液系统发育过程中，胎儿组织来源有限且难以获取的局限性3,9,10,25。

本方案的一个局限性在于，由此方案获得的内皮细胞可能无法反映发育组织中不同类型内皮细胞的多种特性。为克服这一局限，在流体刺激前的分化过程中，可能需要使用特定的细胞因子组合，以获得所需的特定身份或组织特异性表型26。在分离步骤中，可通过更精细的免疫表型分析来实现内皮细胞亚群的分离。本方案仅依据CD34的表达来分离内皮细胞，从而可采用柱分离法而非荧光激活细胞分选（FACS），这有助于减少细胞死亡和污染风险。此外，本方案专门设计用于研究层流介导的剪切应力的作用。若需研究其他机械刺激（如拉伸或压缩）或其他类型流体流动（如紊乱流或扰动流）的影响，则需采用其他流体动力学方法。

我们先前已证明，由iPSC衍生的内皮细胞可模拟异质性的动静脉细胞身份27 类似于在胎儿背主动脉中观察到的现象28,29,30这一点在血管发育和细胞命运决定过程中尤为重要，因为这些过程已知受血流调控。在不同模型中的研究表明，血流缺失会导致动静脉特化异常11,14,31机械信号与细胞命运决定之间的关联机制仍不清楚，而本文所述的技术流程可实现更精细的功能研究，这些研究此前无法开展 体内.

该实验流程描述了利用市售的流体通道对源自人诱导多能干细胞（hiPSCs）的内皮细胞进行培养和刺激的方法，避免了传统广泛使用的聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置所需的模具制备步骤12。此外，使用PDMS芯片使得受刺激细胞的收集尤为困难，而本方案可轻松从通道中回收细胞。这显著提高了分析能力，便于后续开展蛋白质组学和转录组学分析、流式细胞术以及功能检测，这些检测可能需要进一步的培养或in vivo实验。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得了欧洲血液学协会2021年研究高级资助、美国血液学会2021年全球研究奖，以及由惠康信托基金和爱丁堡大学资助的内部战略支持基金ISSF3的资助。我们感谢流式细胞术平台的Fiona Rossi在流式细胞术分析中提供的支持。为了开放获取的目的，作者已对本投稿所产生的任何作者接受稿版本应用了知识共享署名（CC BY）许可。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.6 Luer 未涂层载玻片ibidiIB-80186
25% BSALife TechnologiesA10008-01
6孔板Greiner Bio-one657160
AccutaseLife TechnologiesA1110501引用为解离试剂
抗坏血酸MerckA4544-100G
吸液移液管Sardtedt86.1252.011
B27 添加剂Life Technologies17504044引用为神经元细胞培养添加剂（50倍浓缩）
BD FACS DIVABD BiosciencesVersion 8.0.1引用为流式细胞术软件
BD LSR Fortessa 5 激光系统BD Biosciences
bFGFLife TechnologiesPHG0021
CD34 磁珠试剂盒Miltenyil Biotec30-046-702
CD34 PE 克隆 4H11Invitrogen12-0349-42
CD34 PerCP-eFluor 710 克隆 4H11Invitrogen44-0349-42
Cellstar 防细胞黏附表面 6 孔板Greiner Bio-one657970引用为防细胞黏附板
CHIR99021Cayman Chemicals 13122-1mg-CAY
Cryostor CS10  细胞冻存液MerckC2874-100ML引用为冻存溶液
二甲基亚砜VWR200-664-3引用为 DMSO
DMEM/F-12Life Technologies10565-018
DPB Ca2+ Mg2+Life Technologies14080055
DPBSLife Technologies14200075
EASY Strainer 40 μmGreiner Bio-one542040
EDTALife technologies15575020
FcR 封闭试剂Miltenyil Biotec130-059-901
FijiVersion 1.53c
Flow JoVersion 10.7.1引用为流式细胞术分析软件
FLT3LPeprotech300-19-10uG
流体单元ibidi10903
GlutaMaxLife Technologies35050038引用为 L-谷氨酰胺添加剂
Ham F-12 Life Technologies11765054
全转铁蛋白MerkT0665-500MG
人血清白蛋白Fujifilm UK LTD9988
Ibidi 泵系统ibidi10902引用为泵系统
IMDMLife Technologies12440053
倒置显微镜ioLight/Thisle ScientificIOL-IO-INVERT引用为倒置式培养箱内显微镜
冻干 BSA MerckA2153-100G
MiniMACS 分离器Miltenyil Biotec130-042-102引用为磁力分离器
MS 柱Miltenyil Biotec130-042-201引用为磁性分离柱
MTGMerckM6145-25ML
N2 添加剂Life Technologies17502048
泵系统笔记本ibidi10908
多聚甲醛 37-41%Fisher ChemicalsF/1501/PB15
移液吸头Greiner Bio-one612398
青霉素/链霉素Gibco15070063
灌注装置 黄/绿色：50 cm，内径 1.6 mm，10 mL 储液槽IbidiIB-10964引用为灌注装置
聚苯乙烯圆底管Falcon352008引用为流式细胞术管
Prism 9Verison 9.4.0
泵控制软件ibidiversion 1.6.1引用为泵软件
ReLeSRStem cell tecchonologies5872引用为解离溶液
rhBMP4R&D314-BP-010
rhEPOR&D287-TC-500
rhIGF1Peprotech100-11-100uG
rhIL11Peprotech200-11-10uG
rhIL3Peprotech200-03-10uG
rhIL6R&D206-IL-010
rhLaminin-521Life technologiesA29248引用为层粘连蛋白
rhSCFLife TechnologiesPHC2111
rhTPOR&D288-TPN-025
rhVEGFR&D293-VE-010
RLT 裂解缓冲液Qiagen79216
用于 µ-载玻片的串联连接器：无菌，无菌ibidiIB-10830
StemPro-CD34 SFM 培养基Life Technologies10639011引用为 CD34+ 细胞无血清培养基（SFM-34）
StemPro-CD34 营养添加剂 Life Technologies10641-025引用为 34 营养添加剂
StemPro hESC SFMLife TechnologiesA1000701引用为培养基 
StemPro 添加剂Life TechnologiesA10006-01
重组人截短型纤连蛋白（VTN-N）InvitrogenA31804
Y-27632 二盐酸盐Tocris1254引用为 iRock
β-巯基乙醇Gibco21985023

参考文献

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CD34

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