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方法文章

从人多能干细胞生成功能性胰岛素分泌胰腺细胞的优化方案

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DOI：

10.3791/65530

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2024年2月2日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Metabolism, Digestion and Reproduction, Faculty of Medicine, Cell Biology and Functional Genomics, 2Departments of Pediatrics, Naomi Berrie Diabetes Center, Obstetrics and Gynecology, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University Irving Medical Center, Columbia University, 3Department of Diabetes, Imperial College Healthcare NHS Trust, 4Faculté de Médicine, Université de Montréal, 5Lee Kong Chian Imperial Medical School, Nanyang Technological University

通讯作者： Ines Cherkaoui <i.cherkaoui20@imperial.ac.uk>, Guy A. Rutter <guy.rutter@umontreal.ca>

本文内容

摘要

本文介绍了一种定向分化及功能分析类β细胞的方法。我们描述了在生成胰岛素分泌型胰腺细胞前，人多能干细胞所需的最佳培养条件和传代方法。该六阶段分化过程从定型内胚层形成开始，最终获得能够响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素的功能性类β细胞。

摘要

人类多能干细胞（hPSCs）可分化为任何类型的细胞，因此是获取人胰腺β细胞的优良替代来源。hPSCs可以是来源于胚泡的胚胎干细胞（hESCs），也可以是通过重编程技术直接由体细胞诱导生成的诱导性多能干细胞（hiPSCs）。本文提供了一种基于视频的操作方案，用于阐述在hPSCs向胰岛素生成性胰腺细胞分化之前，其最佳的培养与传代条件。该方法遵循定向诱导β细胞分化的六个阶段流程，即hPSCs依次分化为定型内胚层（DE）、原始肠管、后部前肠命运细胞、胰腺前体细胞、胰腺内分泌前体细胞，最终形成胰腺β细胞。值得注意的是，该分化过程需要27天时间才能生成人类胰腺β细胞。通过免疫染色和葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验两项检测，评估了这些细胞分泌胰岛素的潜能。

引言

人类多能干细胞（hPSCs）具有分化为多种细胞类型的独特能力，使其成为人类胰腺β细胞的一种可行替代来源1。这些hPSCs可分为两类：来源于胚泡的胚胎干细胞（hESCs）2，以及通过直接重编程体细胞获得的诱导性多能干细胞（hiPSCs）3。将hPSCs分化为β细胞的技术发展，对基础研究和临床实践均具有重要意义1,4。糖尿病是一种慢性疾病，全球受影响人数超过>4亿，其病因是由于胰腺β细胞功能障碍或缺失，导致机体无法正常调节血糖5。可用于移植的胰腺胰岛细胞供体数量有限，严重制约了糖尿病细胞替代疗法的发展2,4,6,7。利用hPSCs生成能够响应葡萄糖并分泌胰岛素的细胞，可作为研究人类胰岛发育与功能的有用细胞模型，也可用于在受控环境中筛选潜在的糖尿病治疗候选药物。此外，hPSCs有望产生与患者基因完全相同的胰腺胰岛细胞，从而降低移植后的免疫排斥风险2,4,7。

近年来，人多能干细胞（hPSC）培养和分化方案取得了显著进展，使得向胰腺β细胞分化的效率和可重复性显著提高8,9。

以下方案概述了胰腺β细胞定向分化的关键阶段，涉及在特定时间点调控特定的细胞信号通路。该方案基于Sui L. 等人10（2018年）建立的将人多能干细胞（hPSCs）诱导为胰腺β细胞的方案。根据Sui L. 等人11（2021年）的最新研究进展，本方案进行了相应调整。最新研究强调使用阿非迪霉素（aphidicolin, APH）处理可增强β细胞的分化效率，因此当前方案在分化过程的后期阶段向培养基中添加APH。此外，与初始方案相比，本方案在分化早期阶段的培养基成分也进行了修改。其中一项显著变化是在第6天开始添加角化细胞生长因子（Keratinocyte Growth Factor, KGF），并持续至第8天。角化细胞生长因子（KGF）的添加时间为第6天至第8天，这与初始方案10略有不同，原方案中KGF未包含在第4阶段的培养基中。

生成β细胞样细胞的第一步也是关键步骤，是将人多能干细胞（hPSCs）定向分化为定型内胚层（DE），定型内胚层是一种原始胚层，可发育形成包括胰腺在内的多种器官的上皮衬层。定型内胚层形成后，细胞进一步分化为原始肠管，随后被特化为后部前肠命运。后部前肠进一步发育为胰腺前体细胞，这类细胞具有分化为胰腺所有细胞类型（包括内分泌细胞和外分泌细胞）的潜能。该过程的后续阶段涉及胰腺内分泌前体细胞分化为胰岛朗格汉斯中的激素分泌细胞。最终，该分化过程完成，产生成熟且功能完备的胰腺β细胞样细胞。9,10需要注意的是，该过程较为复杂，通常需要优化培养条件，例如特定的生长因子和细胞外基质成分，以提高分化的效率和特异性。9,10此外，从人多能干细胞（hPSCs）生成具有功能的类似β细胞 体外 仍然是一个主要挑战。目前的研究重点在于优化分化方案，并提高所获得的β细胞的成熟度和功能9.

在本实验方案中，人多能干细胞（hPSC）的培养与传代过程中采用温和的细胞解离方法，对于维持细胞活力和多能性至关重要，可显著提高向胰岛β细胞分化效率。此外，各阶段特异性培养基均根据Sui L.等人10建立的方案进行了精细优化，以促进生成大量能分泌胰岛素的细胞簇，这些细胞簇在形态和功能上均高度类似于人胰岛。

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方案

在启动分化之前，建议确定实验所需的胰岛样类器官数量。在6孔板中，一个汇合度超过80%的孔通常含有200万至230万个hPSCs。由于不同hPSC细胞系及分化效率存在差异，准确预测较为困难，但粗略估计约为初始孔数的1.5倍。一次有效的定向分化通常在六孔板的每个孔中产生160万至200万个细胞，该数量包括细胞簇内的所有细胞，而不仅限于胰岛素生成细胞。对于一个直径50 µm的细胞簇，可粗略估算其包含约10,000个细胞。表1总结了在干细胞基质和培养基基础上，定向分化各天/阶段所用的培养基成分，以及葡萄糖刺激的胰岛素分泌缓冲液的配方。

1. 在六孔板中进行分化前的人多能干细胞传代

注意：在将人类干细胞分化为类似β细胞之前，对其进行适当的传代是建立实验流程的关键步骤。传代时消化不充分或接种细胞数量不当，均可能影响分化的效率和准确性。

  1. 准备干细胞培养基、包被液和消化溶液（详见表1）。
  2. 传代前1-2小时，用预冷的包被液（每孔1 mL）包被六孔板，于37 °C、5% CO2条件下孵育。
  3. 将一份干细胞培养基在室温（15-25 °C）下回温20分钟。
  4. 吸除干细胞培养基，每孔加入1 mL无钙/镁D-PBS。
  5. 重复步骤1.4两次。
    注意：加入D-PBS用于洗涤细胞，去除先前的培养基和化合物。值得注意的是，洗涤步骤无需特定时间，因为D-PBS不会对hPSC造成损伤，可避免因渗透压导致的细胞破裂或皱缩。
  6. 吸除D-PBS，每孔加入500 µL消化液，在室温（15-25 °C）下静置2-5分钟。
  7. 细胞消化过程中，吸除新六孔板各孔中的包被液，并向每孔加入1-2 mL无钙/镁D-PBS。
  8. 在倒置显微镜下定期观察消化过程。
  9. 当80-90%的细胞变圆但仍贴壁时，吸除消化液。
  10. 每孔加入含10 µM ROCK抑制剂的1 mL干细胞培养基。
  11. 使用1,000 µL无菌滤芯吸头和P1000移液器，将消化后的细胞收集至15 mL锥形管中。
  12. 用1,000 µL无菌滤芯吸头在移液器中轻柔吹打细胞悬液上下混匀，以打散细胞团，但吹打次数不超过10次。
  13. 加入1 mL含ROCK抑制剂的干细胞培养基，以帮助脱落后剩余的hPSC，并将细胞悬液转移至同一15 mL锥形管（1.10）。
  14. 吸除新包被板中的D-PBS，立即加入来自15 mL锥形管的细胞悬液。为确保最佳细胞生长，使用六孔板时，每孔接种2 × 105–1 × 106个活细胞（传代比例为1:10至1:50）。
    注意：体积计算时，六孔板每孔需加入含ROCK抑制剂的2 mL干细胞培养基。
  15. 快速前后、左右晃动培养板5-10次。
  16. 将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中培养24小时。
  17. 次日更换为不含ROCK抑制剂的新鲜干细胞培养基，之后每2天更换一次，直至hPSC汇合度达到80-95%。

2. 人干细胞定向分化为β细胞

注意：当人多能干细胞（hPSCs）达到80-95%融合度时，可用于直接分化为胰腺β细胞。

  1. 第-1天：细胞传代 分化第-1天：
    1. 传代前1-2小时，将6孔板用冷包被液在37 °C、5% CO₂条件下包被2 孵育1小时。
    2. 按照步骤 1.1 至 1.10 操作，然后进行细胞计数。
    3. 加入10 µL细胞混合液，加入等体积的台盼蓝，轻轻混匀。
    4. 计算细胞浓度。使用 0.8 × 106 细胞/mL - 1.0 × 106 每孔加入2 mL含10 µM ROCK抑制剂的干细胞培养基，按指定细胞密度接种至包被的6孔板中。
    5. 将培养板快速左右来回移动三次。
    6. 将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2 培养箱中。快速将培养板前后、左右各来回移动10次。然后将培养板孵育4小时。
      注意：将培养板放入培养箱后，切勿移动，以免影响细胞的贴壁和均匀分布。开启和关闭培养箱时应格外小心。
    7. 将第0至4天使用的基础培养基瓶置于4 °C下过夜，以解冻。
  2. 第0天
    注意：hPSCs 的融合度必须达到 80 - 95%；融合度低于此范围时，不得启动向定型内胚层的分化过程。
    1. 在冰上解冻第0至4天的基础培养基和补充物（参见 材料表).
    2. 在两个锥形管中仅准备第1天所需体积的培养基（每孔6孔板2 mL），另取一管准备第2.5至第4天所需体积的两倍量（每孔6孔板2 × 2 mL）。将第2.5至第4天的培养基储存在4 °C。
    3. 将所需体积的第1天培养基和洗涤培养基1置于37 °C水浴中预热5分钟。
    4. 吸除干细胞培养基，加入 2 mL 洗涤液 1。
      注意：本实验方案中使用的洗涤液由适用于各天/阶段的基础培养基添加1%抗生素组成。直接分化方案中的洗涤步骤仅包括加入指定的洗涤液（以下简称 "洗涤液 1 或 2", 材料表）并按照所述程序2.2.4进行后续抽吸。需要说明的是，这些洗涤步骤并未规定具体的时间范围。
    5. 吸出洗涤液1，并立即向孔壁加入2 mL第1天培养基。
    6. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养细胞2 24 小时。
  3. 第1天
    1. 将所需体积的第2.5至第4天培养基预热：在37 °C水浴中孵育5分钟。
    2. 吸弃第1天的培养基，立即沿孔壁加入2 mL第2.5至4天培养基。无需洗涤细胞。
    3. 将培养板放回 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2 36 小时。
  4. 第2.5天至第4天
    1. 将第2.5至4天培养基的剩余体积预热5分钟，置于37 °C水浴中。
    2. 吸除培养基，立即沿孔壁加入 2 mL 新鲜配制的第 2.5 至 4 天培养基。
    3. 将培养板放回 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2 36 小时。
  5. 第4天
    注意：此时定型内胚层标志物的表达达到峰值，细胞可启动原始肠管分化。
    1. 准备适量体积的第4天原始肠管阶段培养基（六孔板每孔2 mL），并在室温下预温 （15 °C -25 °C）孵育 20 分钟。
    2. 吸弃第2.5至4天的培养基，加入2 mL洗涤培养基1。
    3. 吸除洗涤液1，立即沿孔壁加入2 mL第4天原始肠管阶段培养基。
    4. 将培养板放回 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2 48 小时。
  6. 第6至8天
    注意：在此阶段，细胞开始进一步分化为后部前肠命运。
    1. 准备第6至8天后前肠培养基的必要体积（每孔2 mL，6孔板），并将培养基在室温（15 °C -25 °C）下放置20分钟以恢复至室温。
    2. 吸除第4天的培养基，并立即沿孔壁加入2 mL第6至8天的后前肠培养基。
    3. 将培养板置于含5% CO₂的37 °C培养箱中2 48 小时。
  7. 第8至12天
    注意：细胞已准备好进行胰腺前体细胞的分化。
    1. 准备第8至12天胰腺前体阶段培养基的必要体积（每孔6孔板2 mL），并将培养基在室温下预温 （15 °C -25 °C）孵育 20 分钟。
    2. 吸除第6至8天的培养基，立即沿孔壁加入2 mL第6至8天后前肠培养基。
    3. 将培养板置于含有5% CO₂的37 °C培养箱中2 48 小时。
  8. 第12天：执行聚类步骤
    注意：在此阶段，细胞形成致密的单层，将转入三维细胞培养以形成细胞簇。此步骤对于促进类β细胞在结构上更接近天然人胰岛至关重要，同时也可提升其在细胞和细胞簇水平上的功能相似性。11(图1).
    1. 处理一个6孔板，其中包含直径为400 µm的微孔（如指定） 材料表：人干细胞来源的β细胞定向分化，第12天）用2 mL抗黏附冲洗液在室温（15 °C - 25 °C）下冲洗。
      注意：微孔可防止细胞贴附于孔底，并有助于机械形成三维细胞簇。
    2. 离心板，1,300 x g g 5 分钟。
    3. 在倒置显微镜下检查是否存在气泡。若未观察到气泡，吸除抗黏附冲洗液，并立即加入2 mL洗涤培养基2材料表).
    4. 重复步骤 1.8.3 两次。
    5. 准备所需体积的成团培养基，并在室温（15–25 °C）下预热20分钟。确保将6孔板中的两孔细胞转移至一个400 µm微孔6孔板的单孔中，每孔加入4 mL成团培养基。
    6. 吸弃胰腺前体细胞培养基，每孔加入 0.5 mL 解离缓冲液。
    7. 在室温（15 °C - 25 °C）孵育 2-5 分钟。在倒置显微镜下定期观察解离过程，当大部分细胞变圆但仍贴壁时，吸除解离缓冲液。
    8. 吸出解离缓冲液，立即向每孔加入1 mL类胚体培养基。
    9. 使用 P1000 移液器和 1,000 µL 滤芯吸头，轻轻吹打细胞 6 次以进行解离。
    10. 将细胞与类胚体培养基混合物转移至50 mL锥形管中。
    11. 加入1 mL集落培养基以收集所有剩余细胞。
    12. 将集落培养基加入至所需总体积，使每份 微量培养板的每个孔中含有4 mL的细胞簇培养基混合物。
    13. 吸弃6孔板中微孔内的洗涤液2，转移细胞悬液。将培养板置于37 °C孵育24 h。
  9. 第13天：聚集体形成后的细胞处理及从第13天开始更换培养基
    注意：类器官簇具有高度敏感性，需谨慎操作以确保其在后续数日内的完整性和活性。因此，在第12天之后的簇形成后阶段，必须密切监测类器官簇的状态。定期评估并进行必要调整，对于保障实验过程的成功至关重要。
    1. 准备所需体积的第13天培养基（每孔6孔板2 mL），并在另一个50 mL锥形管中准备第15至20天胰腺内分泌前体细胞培养基。
    2. 使用移液枪和1,000 µL滤芯吸头，缓慢将6孔板微孔中的细胞簇收集至50 mL锥形管中。
    3. 加入1 mL第13天培养基以收集剩余的细胞簇，并将细胞簇转移至离心管中。
    4. 让细胞在重力作用下自然沉降至锥形管底部，静置5 min。
    5. 尽可能吸出离心管中的上清液，避免扰动细胞团块。移液枪头不得接触或吸取细胞团块，仅可吸取上清液。
    6. 根据以下说明加入所需体积的第13天培养基：将6孔微孔板中的1孔加入低吸附6孔板中的3个孔（每孔2 mL培养基）。
    7. 轻柔地上下吹打，避免吸入细胞团块。
    8. 将悬液转移至超低吸附的6孔板中。
    9. 将培养板快速左右、前后移动六次。
    10. 在37 °C下孵育平板48 h。
    11. 按照本节2.9所述，在后续所有步骤中直至分化结束，均需进行培养基更换。
  10. 第15至20天
    1. 每48小时更换一次胰腺内分泌前体阶段培养基，直至分化第21天，将细胞悬液收集至50 mL锥形管中，并按照第13天的步骤2.9.4至2.9.10操作。
  11. 第21至27天
    注意：在此阶段，细胞簇分化为胰腺β细胞。
    1. 制备胰腺β细胞阶段培养基。
    2. 每隔一天更换一次培养基，具体操作如第15至21天所述。
      ​注意：第25天后，可对类胰岛类器官进行分析，以确认其功能完全。

3. 胰岛β细胞簇的染色

注意：执行此步骤以研究分化后簇的生物学功能评估

  1. 在分化结束时，收集5至10个细胞团簇，置于1.5 mL微量离心管中。
  2. 用200 µL的4%多聚甲醛在室温下固定细胞团簇15分钟。
  3. 向团簇中加入1 mL PBS，并使用1,000 µL移液器吸头在不扰动团簇的情况下吸除PBS。
  4. 向团簇中加入200 µL的30%蔗糖溶液，并在4 °C下孵育过夜。
  5. 将团簇转移至冷冻模具中，去除多余的蔗糖溶液，加入一滴O.C.T.包埋剂，并将团簇与O.C.T.包埋剂混合均匀。
  6. 将冷冻模具置于干冰上速冻，随后在-80 °C保存。
  7. 使用切片机或冷冻切片机，从冷冻组织块上切下5 µm厚的切片，并贴附于载玻片上。
  8. 将载玻片存放在-80 °C冰箱中，直至进行染色。
  9. 染色当天，将载玻片从-80 °C冰箱中取出。
  10. 小心去除冷冻模具切片周围的冰。
  11. 使用疏水笔在载玻片上圈出细胞团簇区域。
  12. 将载玻片放入盛有PBS的染色缸中，复水15分钟。
  13. 向染色缸中加入冷甲醇，并将装有载玻片的染色缸置于-20 °C环境中10分钟。
  14. 将载玻片浸入PBS染色缸中。
  15. 重复步骤3.14三次。
    注意：后续所有洗涤步骤均采用此方法。
  16. 从载玻片上移除PBS，并立即加入含2–5% BSA的PBS-T封闭液100 µL，覆盖组织区域。
  17. 向每张载玻片加入封闭液，并用石蜡膜覆盖。
  18. 在室温（15–25 °C）下孵育1小时。
  19. 根据试剂与溶液部分提供的比例，用封闭液稀释一抗。
  20. 从载玻片上移除封闭液。
  21. 立即加入稀释后的一抗，并用封口膜覆盖载玻片，防止干燥。
  22. 在4 °C下孵育过夜。
  23. 次日，用PBS-T洗涤载玻片3–5次。
  24. 配制稀释的二抗和DNA染料。
  25. 去除载玻片上多余的PBS-T。
  26. 加入稀释的二抗和DNA染料，在室温（15–25 °C）下孵育45分钟。
  27. 用PBS-T洗涤载玻片3–5次。
  28. 去除载玻片上的所有液体。
  29. 向每个切片上滴加一滴组织学封片介质。
  30. 用玻璃盖玻片封片。
  31. 使用荧光显微镜拍摄染色后的载玻片图像。

4. GSIS（葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验）

  1. 配制三种不同的溶液：低葡萄糖KREBS溶液、高葡萄糖KREBS溶液以及含KCl的低葡萄糖KREBS溶液。
  2. 将所有溶液置于37 °C水浴中预热。
  3. 使用1000 µL移液器吸头仔细挑选约10–15个大小相似的细胞团簇，并将其连同少量分化培养基转移至1.5 mL离心管中，以避免团簇干燥。
    注意：细胞团簇应肉眼可见；若不可见，可将含有分化后团簇的培养板置于倒置显微镜下进行挑选，并转移至1.5 mL离心管中。
  4. 将含有团簇和培养基的离心管放置于试管架上，静置，待团簇沉降至管底。
  5. 使用200 µL移液器缓慢吸除上清液，然后加入200 µL低葡萄糖KREBS溶液。
  6. 将胰岛在低葡萄糖溶液中于37 °C孵育1小时。
    注意：为确保准确评估团簇数量并保证实验的一致性，建议在转移过程中检查溶液中是否所有团簇均存在，因其易黏附于管壁。
  7. 从孵箱中取出离心管，缓慢吸除200 µL KREBS溶液，注意避免吸出任何团簇。
  8. 加入200 µL低葡萄糖KREBS溶液，并于37 °C孵育30分钟。
  9. 将200 µL低葡萄糖KREBS溶液吸出至500 µL离心管中，立即于-80 °C保存，用于胰岛素测定。对不同处理组重复此步骤。
  10. 为洗涤团簇，向含有团簇的离心管中加入200 µL无葡萄糖的KREBS溶液。待团簇沉降至管底后，小心吸除上清液，避免扰动团簇。
  11. 加入200 µL高葡萄糖KREBS溶液，并于37 °C孵育30分钟。
  12. 将200 µL高葡萄糖KREBS溶液吸出至500 µL离心管中，立即于-80 °C保存，用于胰岛素测定。对不同处理组重复此步骤。
  13. 为洗涤团簇，向含有团簇的离心管中加入200 µL无葡萄糖的KREBS溶液。待团簇沉降至管底后，小心吸除上清液，避免扰动团簇。
  14. 加入200 µL含KCl的KREBS溶液，并对不同处理组重复此操作。
  15. 于37 °C孵育30分钟。
  16. 将200 µL含KCl的KREBS溶液吸出至500 µL离心管中，立即于-80 °C保存，用于胰岛素测定。对其他处理组重复此步骤。
  17. 加入50 µL超纯水，随后进行总胰岛素含量测定。
  18. 向含有胰岛和超纯水的离心管中加入150 µL酸性乙醇溶液。
  19. 将样品于4 °C保存过夜（12–15小时）。
  20. 次日，对每个样品进行涡旋振荡。
  21. 使用功率设定为20%的电子超声破碎仪超声处理1秒，以确保胰岛组织完全裂解。
    注意：重复步骤4.21，直至显微镜下无可见团簇残留。
  22. 将所有样品在10,000 × g 条件下离心10分钟，保留上清液。
  23. 使用纳米分光光度计测定DNA浓度，用于后续胰岛素测定结果的标准化。

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结果

本文所述方案提供了一种高效地从人多能干细胞（hPSCs）分化出β样细胞的方法10。该过程采用易于扩增的二维培养系统，可广泛应用于多种实验场景，例如学习分化技术、小型项目和实验室研究，以及评估诱导性多能干细胞（iPSC）系分化潜能的预试验。

为了深入了解葡萄糖稳态，必须对胰岛中已分化的β细胞的功能特性进行表征。这通常通过多种实验来实现，例如针对β细胞标志物和胰岛素表达的免疫染色，以及葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）检测，后者用于检测胰岛在低和高葡萄糖浓度下的功能12,13。β细胞具有特征性基因，包括 Nkx2-2、Pdx1、Nkx6-1 和 Neurod1，这些基因对于建立和维持β细胞身份至关重要9。免疫染色技术可用于研究组织切片中蛋白质的表达与定位。针对β细胞标志物的免疫染色可评估关键胰腺谱系标志物...

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讨论

将人多能干细胞（hPSCs）成功分化为胰腺β细胞，依赖于优化所选hPSCs的常规培养和传代过程中的所有环节。这包括确保细胞系具有正常的核型，无支原体污染，并且不含质粒或病毒载体基因组。此外，在使用人诱导多能干细胞（hiPSCs）时，应避免在初步实验中使用仍处于重编程过程中的最早传代细胞。初步实验应小规模进行，以鉴定出具有最佳分化潜能的hPSC细胞系以及最适传代次数。

其他可能影响分化效率的因素包括所用干细胞培养基的质量、包被密度以及传代次数10,12。本实验方案已针对所有相关参数进行优化，以确保实现最高的分化效率10。

在每个阶段使用特定配方的分化培养基，以支持人多能干细胞（hPSCs）向β细胞的分化。在分化培养基中使用Activin A和Wnt激动剂，以启动向定型内胚层细胞的转变。在原始肠管阶段，向培养基中添加KGF以促进进一步向β细胞分化

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致谢

Ines Cherkaoui 获得了 Diabetes UK 研究生奖学金（BDA 18/0005934）的支持，该奖学金由 GAR 获得；GAR 还感谢 Wellcome Trust 提供的研究员奖（212625/Z/18/Z）、英国研究与创新署医学研究理事会（UKRI MRC）提供的项目资助（MR/R022259/1）、Diabetes UK 提供的项目资助（BDA16/0005485）、CRCHUM 提供的启动资金、Innovation Canada 提供的 John R. Evans 领导者奖（CFI 42649）、美国国立卫生研究院糖尿病与消化及肾脏疾病研究所（NIH-NIDDK）提供的项目资助（R01DK135268），以及加拿大卫生研究院（CIHR）和 JDRF 提供的团队资助（CIHR-IRSC：0682002550；JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N）。感谢 Camille Dion 和 Harry Leitch 博士在人类 hiPSC 生成与培养方面的帮助，以及伦敦帝国理工学院国家健康研究所生物医学研究中心（NIHR Imperial BRC）类器官设施的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL TubeOne 微量离心管StarlabsS1615-5500
6孔细胞培养板ThermoFisher Scientific165218
AggreWell 400 6孔板 STEMCELL Technologies34425
抗胰高血糖素抗体 Sigma-aldrichG2654-100UL
抗胰岛素抗体 DakoA0564
抗NKX6.1抗体Novus BiologicalsNBP1-49672SS
抗PDX1抗体 Abcamab84987
阿非迪霉素（Aphidicolin）Sigma-AldrichA4487
B-27 补充剂（50倍浓度），无血清 Thermo Fisher Scientific17504044
牛血清白蛋白，无脂肪酸Sigma-AldrichA3803-100G
二水合氯化钙Sigma-AldrichC3306
无钙镁D-PBS缓冲液Thermo Fisher Scientific14190144
环巴胺-KAAD（Cyclopamine-KAAD）Calbiochem239804
D-(+)-葡萄糖，BioXtraSigma-AldrichG7528
无水磷酸氢二钠Sigma-Aldrich94046-100ML-
含GlutaMAX的DMEM培养基Thermo Fisher Scientific10566016用于洗涤液2：含GlutaMAX和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基。 
DMEM/F-12（Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12）Thermo Fisher Scientific10565-018
Epredi SuperFrost Plus 黏附载玻片Thermo Fisher Scientific10149870
乙醇VWR20821.33
胎牛血清Thermo Fisher Scientific10270098
γ-分泌酶抑制剂XXThermo Fisher ScientificJ64904
Geltrex LDEV-Free 低生长因子基质胶Thermo Fisher ScientificA1413302将Geltrex以1:1比例加入冷的DMEM/F-12培养基中，最终稀释比例为1:100。
山羊抗豚鼠IgG二抗，Alexa Fluor 555标记Thermo Fisher ScientificA-21435
山羊抗豚鼠IgG二抗，Alexa Fluor 647标记Abcamab150187
山羊抗小鼠IgG二抗，Alexa Fluor 633标记Thermo Fisher ScientificA-21052
山羊抗兔IgG二抗，Alexa Fluor 568标记Thermo Fisher ScientificA-11011
肝素Sigma-AldrichH3149
HEPES缓冲液Sigma-AldrichH3375-500G
Hoechst 33342 三盐酸盐Thermo Fisher ScientificH1399
人重组FGF-7（KGF）蛋白Thermo Fisher ScientificPHG0094
盐酸Sigma-Aldrich295426
ImmEdge 疏水屏障PAP笔Agar ScientificAGG4582
LDN193189Sigma-AldrichSML0559-5MG
六水合氯化镁Sigma-AldrichM9272-500G
OCT包埋剂，118 mLAgar ScientificAGR1180
PBS片剂，磷酸盐缓冲盐水，Fisher BioReagentsThermo Fisher Scientific7647-14-5
青霉素-链霉素（PS）Thermo Fisher Scientific,15070-063
氯化钾Sigma-Aldrich7447-40-7
人重组EGF蛋白R&D Systems236-EG-200
矩形盖玻片，22×50 mmVWR631-0137
RepSox（盐酸盐）STEMCELL Technologies72394
含GlutaMAX补充剂的RPMI 1640培养基  Thermo Fisher Scientific61870036用于洗涤液1：含GlutaMAX和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基。
Shandon Immu-mount封片剂Thermo Fisher Scientific9990402
碳酸氢钠Sigma-AldrichS6014-500G
氯化钠Sigma-AldrichS3014
无水磷酸二氢钠Sigma-Aldrich7558-80-7
STEMdiff 内胚层诱导培养基 STEMCELL Technologies5110
StemFlex 培养基Thermo Fisher ScientificA3349401将StemFlex补充剂在4°C过夜解冻，并将补充剂瓶中残留液体全部转移至StemFlex基础培养基中。
Stemolecule 全反式维甲酸Reprocell04-0021 
甲状腺激素3（T3）Sigma-AldrichT6397
台盼蓝溶液，0.4%ThermoFisher Scientific15250061
TrypL Express 酶（1倍浓度）Thermo Fisher Scientific12604013
TWEEN 20Sigma-AldrichP2287-500ML
超低黏附悬浮培养板Thermo Fisher Scientific38071
UltraPure 无DNase/RNase蒸馏水Thermo Fisher Scientific10977015
Y-27632（盐酸二水合物） STEMCELL Technologies72302
硫酸锌Sigma-Aldrich Z4750

参考文献

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