Method Article

使用液相色谱法、捕获离子淌度谱法和飞行时间质谱法进行组蛋白修饰筛选

DOI:

10.3791/65589

⸱

January 12th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基于液相色谱、俘获离子淌度谱和飞行时间质谱 （LC-TIMS-ToF MS/MS） 的分析工作流程，用于基于主要参数（保留时间 [RT]、碰撞截面 [CCS] 和准确的质荷比 [m/z] 比）对组蛋白修饰和鉴定进行高可信度和高度可重复性的"自下而上"分析。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

组蛋白在真核生物中高度丰富且保守，并且由于称为翻译后修饰 （PTM） 的结构，在基因调控中发挥着重要作用。参考外部或遗传因素确定每个 PTM 或 PTM 模式的位置和性质，可以使这些信息与生物反应（如 DNA 转录、复制或修复）进行统计相关。在本工作中，描述了一种用于检测生物样品中组蛋白PTMs的高通量分析方案。使用互补液相色谱法、俘获离子淌度谱法和飞行时间质谱法 （LC-TIMS-ToF MS/MS） 可以在单次分析中分离和分配最具生物学相关性的修饰。所描述的方法利用了相关数据采集 （DDA） 的最新发展，使用迁移阱中的平行积累，然后是顺序碎片化和碰撞诱导的解离。组蛋白 PTM 根据其保留时间、迁移率和碎片模式进行可靠分配。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在真核细胞中，DNA 被包装成染色质，形成称为核小体的功能单元。这些单元由四个核心组蛋白（H2A、H2B、H3 和 H4 各两个）的八聚体组成1,2,3,4。组蛋白是真核生物中最丰富和高度保守的蛋白质之一，主要负责基因调控5.组蛋白翻译后修饰 （PTM） 在染色质动力学的调节和操纵各种生物过程（如 DNA 转录、复制和修复）中起着重要作用6。PTM 主要发生在与 DNA 3,7 接触的组蛋白 N 末端区域的可触及表面上。然而，尾部和核心修饰会影响染色质结构，改变核小体间相互作用并募集特定蛋白 3,8。

在基于液相色谱-质谱（LC-MS）的蛋白质组学中，当前的一个挑战是目标分析物的潜在共洗脱。在数据依赖性分析（DDA）的情况下，这意味着在MS/MS采集过程中，几个母离子的潜在损失9。飞行时间 （ToF） 仪器以非常高的频率 9,10（高达数十 kHz）11 获取频谱;这使得它们能够快速扫描复杂样品 （MS1） 中的总母离子，从而有望实现最佳灵敏度和 MS/MS 测序速率（高达 100 Hz）9，并使其成为生物样品分析的理想选择 10。然而，在这些高扫描速率下可用的灵敏度受到 MS/MS速率 9 的限制。结合捕获离子淌度谱（TIMS）和正交四极杆飞行时间（qToF）质谱仪，可以减轻这些局限性。在 TIMS 中，所有前驱离子都串联积累并洗脱作为其迁移率的函数，而不是选择具有四极杆9 的单个前驱体质量数。并行累积-串行碎片 （PASEF） 允许每秒处理数百个 MS/MS 事件，而不会损失任何灵敏度9。

这项工作的主要目的是展示 DDA 的最新发展，使用迁移阱中的平行积累，然后是顺序碎裂和碰撞诱导解离 （CID）。组蛋白 PTM 根据其保留时间 （RT）、迁移率和碎裂模式进行可靠分配。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:组蛋白样品是使用改编自Bhanu等人（2020）12的方法提取的。

1. 样品制备

  1. 收获培养细胞
    1. 当细胞汇合度达到 80% 时，使用台盼蓝排除确保它们存活。
      注意:这些实验使用了HeLa S3细胞系，但这种方法可以应用于任何培养的细胞。
    2. 吸出培养基，然后在每个板上涂抹 5 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
    3. 旋转板以冲洗所有残留介质，然后吸出 PBS 并涂抹 5 mL 1x PBS。
    4. 用一次性细胞升降器刮擦细胞，轻轻地将细胞与平板分离。
    5. 将每个细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中。
    6. 通过以800× g 离心5分钟来沉淀细胞。
    7. 从细胞沉淀中吸出PBS。
    8. 继续进行组蛋白提取。
      注意:如果不能立即处理，请在液氮中快速冷冻细胞沉淀。将颗粒储存在-80°C，直到准备继续。
  2. 组蛋白提取
    1. 估计每个细胞沉淀的体积，并用永久性标记标记半月板。
    2. 为所有样品准备足够的核分离缓冲液（NIB;15 mM Tris-HCl （pH 7.5）、15 mM NaCl、60 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM CaCl2 和 250 mM 蔗糖）。或者，如果随着时间的推移需要处理许多样品，则将缓冲液散装并在2-8°C下储存长达6个月，或者通过仅解冻每次提取所需的量，在-15°C至-25°C下无限期地等分并冷冻。
      注意: 缓冲液在储存过程中应保持透明。如果缓冲液在任何时候出现浑浊或其他异常外观，请丢弃并准备新的缓冲液。
    3. 制备50倍体积的洗涤缓冲液的细胞沉淀，并按如下方式加入抑制剂（每2个样品约10mL洗涤缓冲液）。
      1. 要制备 10 mL 洗涤缓冲液，请混合 10 mL NIB、30 μL 200 mM 4-（2-氨乙基）苯磺酰氟盐酸盐 [AEBSF]、10 μL 1 M 二硫苏糖醇 [DTT]、20 μL 5 μM 微囊藻毒素、20 μL 5 M 丁酸钠。
    4. 取出 1/5 的洗涤缓冲液以制备裂解缓冲液（洗涤缓冲液的 1/5 体积，0.3% NP-40 或 NP-40 替代品）。
      注意:请勿使用 Triton-X 100 代替 NP-40 或 NP-40 替代品，因为它对于某些细胞类型可能过于粗糙。
    5. 将细胞沉淀悬浮在5列洗涤缓冲液中，并在4°C下以800× g 离心5分钟，彻底洗涤细胞沉淀。 完成此步骤两次，在洗涤之间吸出并丢弃上清液。
    6. 确保细胞沉淀的体积仍用永久性标记标记。重悬于10体积的裂解缓冲液中。
    7. 将每个沉淀彻底混合以重悬，然后在冰上孵育15分钟。
    8. 15分钟后，在4°C下以800× g 离心5分钟。
    9. 吸出并弃去上清液。
      注意: 颗粒应减小到原始颗粒尺寸的 ≤ 1/2 （如标记线所示）。如果沉淀没有充分减少，请重复裂解过程，并包括使用研杵打开细胞的温和均质化步骤。
    10. 裂解完成后，将沉淀重悬于500μL洗涤缓冲液中，然后在4°C下以800× g 离心5分钟。 吸出并弃去上清液，然后再次重复洗涤步骤以去除所有痕量的NP-40。
      注意:此时，沉淀由染色质组成，染色质含有组蛋白。
    11. 将沉淀重悬于0.4N H2SO4的5体积（原始细胞沉淀大小）中。
    12. 使用搅拌器在冷藏室或冰箱中孵育2小时。
    13. 2小时后，将样品在4°C下以3400× g 离心5分钟。 不要丢弃上清液。
    14. 将上清液转移到新管中，并将100%三氯乙酸（TCA）加标至内容物体积的1/3（最终TCA浓度约为20%）。
    15. 轻轻地倒置试管，观察透明、无色的溶液变成白色和/或浑浊，表明蛋白质沉淀。
      注意:对于组蛋白浓度低的溶液，蛋白质沉淀可能不会立即引起注意，但在孵育过夜后应可见沉淀。
    16. 在4°C下无干扰孵育过夜（12-18小时）以完全沉淀组蛋白。
    17. 第二天，在4°C下以3400× g 离心5分钟。
    18. 吸入上清液，注意不要用移液器吸头接触试管的侧面。在这个阶段，组蛋白主要以膜的形式沉积在管的两侧。
    19. 使用玻璃巴斯德移液管向每个试管中加入 500 μL 冰冷丙酮 + 0.1% HCl（酸性丙酮），然后轻轻倒置试管数次。这样做时按顺序排列样品（1、2、3 等），因为任何错误的丙酮都可能去除试管上的标记。在4°C下以3400× g 离心5分钟，并轻轻倾析上清液。
    20. 用 500 μL 冰冷的 100% 丙酮和玻璃巴斯德移液管重复此冲洗步骤。在4°C下以3400× g 离心5分钟，并轻轻倾析上清液。
    21. 在室温下将试管打开干燥，直到剩余的丙酮蒸发。
    22. 干燥后，向每个试管中加入 100 μL 质谱 （MS） 级水。使用此液滴擦拭容器的所有侧面，以重悬整个组蛋白膜。为此，将液滴移液到试管的侧面并旋转它，同时上下移液或分配 100 μL 的一半并使用尖端搅拌它。两种方法的组合效果最好。组蛋白易溶于水，并将存在于溶液中。
    23. 重悬所有样品后，如果有任何残留的白色固体，则在室温下在浴中超声处理5分钟。
    24. 在4°C下以800× g 离心5分钟。 将澄清溶液转移到新鲜试管中。丢弃任何剩余的不溶性颗粒。
    25. 在还原条件下运行 SDS-PAGE，以验证提取是否干净。
      注意:凝胶可以使用任何适当浓度的聚丙烯酰胺运行，只要它可以区分10-20kDa范围内的蛋白质。有关本方案中使用的凝胶，请参阅 材料表。
    26. 进行蛋白质浓度测定（即Bradford或BCA）以确定总蛋白质浓度。
  3. 赖氨酸残基的化学衍生化（丙酰化）
    1. 将20μg组蛋白（通过蛋白质测定法测定）转移到干净的管中。使用真空浓缩器将样品干燥至 <5 μL，然后使用 20 μL 100 mM 碳酸氢铵 （NH4CO3）（~1 μg/μL 溶液）重悬。如果需要，使用氢氧化铵将pH调节至~8。
      注意:不要使用氢氧化铵 （NH4OH） 进行复苏，仅在必要时调整 pH 值。否则，蛋白质会变性并沉淀。
      注意:要以最小的样品损失检查pH值，请使用移液器吸头浸入样品并轻拍到pH试纸上。该测试程序将在剩余的样品制备步骤中有用。
    2. 通过以 1:3 （v/v） 的比例将丙酸酐加入乙腈 （ACN） 来制备丙酰化试剂（即，要制备 40 μL 试剂，将 10 μL 丙酸酐与 30 μL 乙腈混合）。
      注:传统上，甲醇或异丙醇已用于制备丙酰化试剂。由于丙酰化是酰胺生成反应，因此需要非质子溶剂（如乙腈）来防止不必要的副产物和反应，例如因使用甲醇而产生的丙酰甲酯。一次最多只能为多达 4 个样品准备足够的丙酰化试剂，以便试剂保持新鲜。在制备后1-2分钟内使用试剂。当试剂放置时，丙酸酐会与任何环境水分发生反应，乙酸将开始形成，这会改变试剂的有效性，并在添加试剂后改变组蛋白溶液的pH值。
    3. 以 1:4 （v/v） 的比例向每个样品中加入丙酰化试剂（即，对于 20 μL 组蛋白，加入 5 μL 丙酰化试剂）。
    4. 快速加入 1:5 （v/v） NH4OH（即，加入 4 μL 以获得 20 μL 组蛋白溶液），使溶液的 pH 值重新建立至 ~8。如果 pH 值仍然过低，则一次加入 1-2 μL NH4OH，直至 pH 值达到 8。通常，1:5 （v/v） 的比率就足够了。
    5. 将样品在室温下孵育15分钟，不受干扰。
    6. 每批丙酰化试剂不超过3-4个样品重复丙酰化反应，以确保最小的酸形成。
    7. 重复丙酰化程序步骤1.3.2-1.3.5。第二轮丙酰化确保>95%的可用赖氨酸被衍生化。
    8. 使用真空浓缩器将样品干燥至 <5 μL。这将蒸发任何未反应的丙酰化试剂、酸产物和从 NH4OH 释放的氨气。如果样品完全干燥，这很好，因为不会发生明显的样品损失。
      注意: 储存前用氩气置换丙酸酐瓶中的空气，以防止由于与瓶中残留的环境水分接触而形成乙酸。
  4. 胰蛋白酶蛋白水解消化
    1. 将组蛋白重悬于100mM NH4HCO3 中，以达到20μL的体积，达到1μg/μL的最佳浓度。
      注意:浓度低于 1 μg/μL 的样品溶液会导致胰蛋白酶效率降低。
    2. 将胰蛋白酶以 1:10 的比例 （wt/wt） 添加到组蛋白样品中（即，将 2 μL 的 1 μg/μL 胰蛋白酶溶液加入 20 μg 组蛋白）。
    3. 将反应在37°C孵育6-8小时。或者，在室温下孵育过夜（12-18小时）。
    4. 通过在-80°C下冷冻至少1小时来停止消化。
      注意:不要使用酸来淬灭消化反应，因为这会导致在程序的这一点上出现不必要的 pH 值下降。样品可以储存在-80°C，直到准备进行（临时停止点）。
  5. 肽N端的化学衍生化（丙酰化）
    1. 使用真空浓缩器将样品干燥至 <5 μL。
    2. 使用 100 mM NH4HCO3 重悬样品至 20 μL （1 μg/μL）。
    3. 像以前一样重复丙酰化（步骤1.3）。
      注意:由于水性:有机物相比较高，因此样品在此步骤中需要更长的时间才能干燥是正常的。
  6. 使用载物台提示进行样品脱盐
    1. 用 50 μL MS 级水 + 0.1% TFA 重悬或稀释样品。
    2. 使用 11-G 样品取芯器，从固相萃取盘中打入 5 个 C18 材料盘（在转移到移液器吸头之前打孔所有 5 个盘）。插入并确保圆盘牢固均匀地楔入200μL移液器吸头的底部（图1）。
      注意:如果通过单个载物台尖端对超过 25 μg 样品进行脱盐，请使用 15-G 取芯器。
    3. 使用离心机适配器将载物台尖端固定在 1.5 mL 或 2 mL 微量离心管中。
      注意:对于以下离心步骤，在4°C下使用缓慢（500-500× g）旋转，一次1-2分钟;溶剂通常在不到 1 分钟的时间内通过树脂，具体取决于 C18 材料在吸头中的紧密程度。
    4. 用 50 μL 100% 乙腈离心冲洗树脂，以活化 C18 材料并去除潜在的污染物。
      注意:使用凝胶加载移液器吸头将溶液加载到载物台吸头上可能更容易。一旦 C18 材料被激活，重要的是在脱盐过程期间不要让树脂变干。
    5. 通过离心用 80 μL MS 级水 + 0.1% TFA 平衡圆盘材料。
    6. 使用冰醋酸将样品酸化至pH 4或更低。像以前一样用pH试纸检查pH值，以尽量减少样品损失。
    7. 通过缓慢离心将整个样品加载到树脂盘上。
    8. 通过离心用 80 μL MS 级水 + 0.1% TFA 洗涤样品。
    9. 通过缓慢离心冲洗 70 μL 75% 乙腈和 0.5% 乙酸，将样品洗脱到干净的 1.5 mL 管中。可以使用额外的离心时间来确保从载物台尖端洗脱出全部样品体积。如果树脂在额外的离心时间内变干，也没关系，因为在样品洗脱后不再需要树脂。
    10. 在真空浓缩器中完全干燥每个样品。
      注意:样品可以储存在-80°C，直到准备好继续（临时停止点）。
    11. 对于LC-MS/MS分析，将样品在液相色谱（LC）方案的溶剂A（0.1%甲酸）中复溶，最终浓度为0.4μg/μL（即，将20μg组蛋白溶解在50μL溶剂A中）。

2. TIMS软件界面

  1. 选择 "仪器 "选项卡并切换到 "操作 "（验证仪器名称是否以绿色突出显示）（图 2）。
  2. 验证 TIMS 参数（图 2）。
  3. 验证MS设置（扫描开始，扫描结束，离子极性，扫描模式）（图2）。
  4. 验证 TIMS 设置（模式、迁移率启动、迁移结束、斜坡时间、累积时间、占空比、斜坡速率、MS 速率、MS 平均值和自动校准）（图 2）。
  5. 转到 "源 "选项卡并激活注射器选项（Hamilton 500 μL），仅用于 TuneMix 校准步骤（图 3）13。
  6. 进入 校准 选项卡，单击 m/z，选择 校准模式，然后选择模式（通常为增强 Q），缩放 （+0.01%） STD Dev （0.24），然后单击 校准;当得分达到 100% 时，接受（图 4）。
  7. 转到移动性选项卡并重复校准过程（通常为线性模式）、检测范围 （+5%）、宽度 （0.1 Da）、STD Dev （0.1855），然后单击校准;当您得到 98.5% ≥分数时，接受（图 5）。
  8. 转到该方法并选择要使用的方法;在本例中，选择 Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl （图5）。

3. LC-TIMS-PASEF-ToF 毫秒/毫秒联用

  1. 使用典型的 nESI 操作条件:4500 V 毛细管电压、800 V 端板偏移、3.0 bar 雾化器压力、10.0 L/min 干气、200 °C 干加热器和 50 μL/min 注射流速。
  2. 使用典型的 MS 设置:6 eV 碰撞能量、1200 Vpp 碰撞射频、75 μs 传输时间、5 μs 预脉冲存储。
  3. 使用入口漏斗 P1 和出口漏斗 P2 的压力差确定漂移气体流量。平行积累-连续碎裂 （PASEF） 发生在 TIMS 池中，同时积累所有母离子而不是单独积累。然后，母离子以较窄的离子峰释放，而通常的离子峰要宽得多（约短50倍），从而提高了信噪比，同时仍通过淌度14分离共洗脱肽。
  4. 开发用于分析蛋白水解组蛋白肽的LC-TIMS-ToF MS/MS方法。将配备C18 （300 Å， 5 μm， 4.6 mm x 250 mm）色谱柱的高效液相色谱仪（HPLC）与采用专有PASEF技术的商用TIMS-TOF MS仪器相结合。
    注:根据先前发表的工作15,16,17，确定该色谱柱尺寸可在高pH值和低pH值下为肽混合物提供良好的分离。
    1. 将进样体积设置为 20 μL （8 μg） 样品和 0.4 mL/min 流速。
    2. 使用含有0.1%甲酸（溶剂A）的水和含有0.1%甲酸（溶剂B）的乙腈进行60分钟的非线性LC梯度。设置梯度:10% B 2.7 分钟，然后在 5.3 分钟内降至 20% B，4 分钟内降至 28% B，再过 18 分钟降至 35% B，13 分钟内降至 40% B，再过 2 分钟降至 100% B。保持100%B5分钟后，在5分钟内将浓度降低至10%B，并保持最后5分钟。
  5. 在正电离模式下，通过纳米电喷雾电离 （nESI） 验证样品从 HPLC 洗脱到 TIMS-TOF 中的情况。

4. 数据分析

  1. 鉴定肽序列和修饰位点。
    1. 在MS酶解工具下使用ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest]制备肽的理论列表。
      1. 进行理论酶解，同时考虑酶解条件（使用的酶）、要搜索的 PTM 类型（例如，单甲基化、二甲基化或三甲基化）、要搜索的肽的大小范围以及质量检测范围和潜在的漏解次数。
  2. 根据理论肽手动分析采集的数据（图6）12。
    1. 搜索每个理论肽的多个电荷态（+1 至 +4）的质量数。
    2. 在对每个 m/z 进行初步鉴定后，选择峰，并使用基于肽序列（包括PTM）的碎裂离子理论列表确认MS/MS。
      注意:如果以前已知鉴定肽的迁移率，则也证实了这一点。
  3. 计算各种PTM的相对丰度，并将每个修饰报告为指定肽序列的百分比。
    1. 使用以下公式计算每个检测到的PTM的相对丰度:
      相对丰度 = 给定肽的 PTM 面积/未修饰和 PTM 的总面积

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

自下而上的蛋白质组学工作流程（图7）通常包括以下内容:从粗样品中提取目标蛋白质，然后定量蛋白质的浓度，然后进行分离，通常通过凝胶电泳或液相色谱法进行分馏。分馏后，使用蛋白水解酶（通常是胰蛋白酶）消化蛋白质，最后，使用已建立的数据库18对所得肽进行质谱分析和蛋白质鉴定。序列信息来自所示质荷比 （m/z） 范围内的前驱离子，这些离子受到碰撞诱导解离 （CID），产生碎裂模式，可使用数据库19 进行识别和测序（图 8）。

对于这项工作，主要目标是按照前面协议部分所述的步骤开发和应用LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA方法。确定异构体和同位素异位肽翻译后修饰的位置对鉴定和谱图解释提出了特殊的挑战。本研究以重组人组蛋白标准品和HeLa S3细胞为样本。

通过ESI-TIMS-PASEF-ToF MS/MS对人组蛋白标准品进行组蛋白PTM分析，可检测到中大型肽（长度为3-30个氨基酸），每个肽可检测多达5个电荷。丙酰化过程成功地产生了比胰蛋白酶消化通常产生的肽更长、信息量更大的肽。通过数据分析，鉴定出具有不同修饰状态的肽。作为优点，基于TIMS的方法区分了一些携带相同PTM的位置异构肽。例如，两种异构体物种可能在保留时间和 m/z 上重叠;然而，这两个信号可以在迁移域中分离（图9）。

图9所示肽的相应碎裂谱图由蛋白质组学分析软件使用适当的FASTA文件进行注释。在图9A中，可以看到未修饰的肽具有三个丙酰基（+56.03）基团（在N端，赖氨酸18和赖氨酸23上）。在图9B中，用赖氨酸18上的乙酰基（+42.02）和两个丙酰基（一个在N端，一个在赖氨酸23上）观察到肽。最后，在图9C中，可以看到肽在赖氨酸23和两个丙酰基（在N端和赖氨酸18上）上观察到乙酰化。如前所述，PASEF 的优势可用于通过重复靶向同一特征来提高测序速度和灵敏度9。这允许用户从生物样品中获得更多的结构信息。在这种情况下，这适用于每个组蛋白上发生的 PTM 的类型和位置。

翻译后修饰分析也可以直观地表示为序列覆盖图，如图 10 所示。在图10A中，在消化前被丙酰化的组蛋白H3标准品的肽长于其他结果，用蓝线表示。从HeLa S3细胞中提取的组蛋白以相同的方式处理，如图10B所示。指出了几种 PTM，包括相同氨基酸位置的许多不同模式。这是从生物样本中可以预料到的。值得注意的是，图10B中的几条灰线表示由于低强度导致缺乏MS2而无法识别的肽。

figure-results-1
图 1:载物台尖端的示意图和生产。 （A-G） C18-二氧化硅圆盘载物台尖端制造的分步指南。请点击这里查看此图的较大版本.

figure-results-2
图 2:数据处理:20210804丙酰化标准组蛋白Mix_QC肽。 在开始处理数据之前，请确保准备可能的电荷状态及其碎片（1550.9013;775.9543;517.6386;等）的理论列表，以便从基础峰色谱图（BPC + All MS）中提取这些值。提取每种肽后，确保其看起来像图中所示的分析列表。以峰值775.9543为例。在图的右侧，显示了三个图表:第一个对应于色谱图（强度与时间图），第二个对应于移动图，第三个对应于包含 PASEF 碎裂的质谱图。 请点击这里查看此图的较大版本.

figure-results-3
图 3:timsControl 协议步骤 1-4。 该图显示了 timsControl 过程的前四个步骤。在左上角，单击 仪器 按钮以打开和关闭仪器与软件之间的连接。在执行任何任务之前，必须确保软件处于操作模式。最后，验证 TIMS 参数是否正确。 请点击这里查看此图的较大版本.

figure-results-4
图 4:源参数。 在这种情况下，注射器 Hamilton 500 μL 仅用于 TuneMix。验证其他参数是否正确。 请点击这里查看此图的较大版本.

figure-results-5
图 5:质荷比 （m/z） 校准。 选择 校准 ，直到在左下角面板 校准模式中获得 100% 的分数。 请点击这里查看此图的较大版本.

figure-results-6
图 6:迁移率校准。 选择 校准 ，直到在左下角面板 校准模式中获得至少 98.5% 的分数。 请点击这里查看此图的较大版本.

figure-results-7
图 7:典型的自下而上的蛋白质组学工作流程。 从样品制备到鉴定的自下而上的分步程序9. 请点击这里查看此图的较大版本.

figure-results-8
图 8:保留时间、同位素模式和 H3 18-26 迁移率曲线。 （A）未修饰的丙酰化，（B）K23Ac肽在另外两个位置丙酰化，（C）K18Ac丙酰化在其他两个位置。请注意图B和图C所示的结构异构体的迁移率分离的优点。 请 点击这里查看此图的较大版本.

figure-results-9
图 9:使用 PASEF 进行 MS/MS 片段化肽测序的示例。 从蛋白质组学分析软件获得氨基酸位置为 18-26 的 H3 肽的片段谱图。（A）未修饰的丙酰化，（B）K23Ac肽在其他两个位置被丙酰化，（C）K18Ac丙酰化在其他两个位置。 请点击这里查看此图的较大版本.

figure-results-10
图 10:视觉组蛋白 PTM 分析摘要示例。 从 （A） H3 标准品和 （B） HeLa S3 细胞中观察到的肽和 PTM 的结果。 请点击这里查看此图的较大版本.

表 1:标准品和 HeLa S3 肽 LC-TIMS-TOF MS/MS 特性。 靶标和观察到的肽列表，包括实验特性（即保留时间、 m/z、1/Ko 和 LC 峰面积）。 请按此下载此表格。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

组蛋白是碱性蛋白质，通过以八聚体的形式与 DNA 相互作用来调节染色质结构，八聚体由四个核心组蛋白（H2A、H2B、H3 和 H4 各两个）组成）20。组蛋白含有许多赖氨酸和精氨酸残基，这些残基很容易被修饰，导致广泛的 PTM，通过影响组蛋白功能或与其他细胞蛋白结合来改变染色质化学21。PTM 可以通过协同工作来引发生物反应，在几种疾病中已经报道了特定的 PTM 组，最值得注意的是几种类型的癌症22。

当DNA损伤在细胞水平上被识别出来时，紧随其后的是复杂的信号级联反应，其中病变被标记，然后是细胞周期进程的协调和所需修复途径的激活。此外，DNA 损伤诱导各种修饰，例如乙酰和甲基加合物，这促进了蛋白质募集23。参与DNA损伤的PTM种类繁多，这就引出了一个问题，即这些分子机制如何调节它们的共存，以及通过极其复杂的集成网络捍卫基因组完整性的功能重要性是什么。例如，组蛋白 H3 （H3K9me3） 的赖氨酸 9 三甲基化与各种疾病的不同病理有关24。由于这样的原因，有必要开发仪器分析方法，以便在细胞水平23上完整表征这些修饰。

使用手动数据分析软件和蛋白质组学分析软件对 HeLa S3 组蛋白提取的分析揭示了 PTM，包括乙酰化 （+42.01 Da）、甲基丙酰化 （+70.04 Da）、二甲基化 （+28.03 Da） 和几种组蛋白的三甲基化 （+42.05）。此外，基于PASEF的MS/MS方法能够区分一些携带相同PTM的位置异构肽。

在引言中，简要介绍了LC-TIMS-ToF MS/MS耦合在PTMs研究中的优势，以展示DDA的最新发展，即在迁移阱中平行积累，然后依次碎裂和碰撞诱导解离。主要思想是建立一种方法，允许解析来自不同肽的信号，到目前为止，经典技术还无法解析。使用丙酸酐的衍生化过程可防止胰蛋白酶裂解赖氨酸 C 末端，从而产生更长、信息量更大的肽。具有相同 m/z 和保留时间的肽能够通过其片段化模式进行鉴定，但也可以看到，使用这种LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS方法可以在迁移域中分离其中一些物种。

为了更好地理解这一点，图8代表了任何分子的三个主要特征，从而可以识别化合物，无论它们是完整的蛋白质、脂质还是肽（在本例中为组蛋白H3 18-26），仅举几个例子。这些特性包括化合物在色谱柱中的保留时间（分钟）、每种化合物的质荷比 （m/z） 以及这些化合物在与漂移气体相互作用时呈现的迁移率 （1/Ko）。在图8A中，未修饰的H3肽18-26显示其RT为28.15 min，并且在其迁移谱中呈现两个条带，表明它具有至少两种构象，这一结果被怀疑是两种赖氨酸（18和23）的结果，它们按照先前描述的方案被丙酰化。以下光谱（图8B，C）显示相同的肽（H3 18-26），但乙酰化基团（42.02）在B，K18Ac和C，K23Ac之间的位置不同。这两种异构体（K18Ac 和 K23Ac）已通过移动图鉴定，因为它们具有不同的空间分布，这导致与 TIMS 池中的气体发生不同的相互作用。这种方法的重要性在于可以更详细地识别和研究通过DNA损伤等与不同疾病相关的不同PTM。

当碎片数据稀疏时，识别特定残基处的修饰具有挑战性，因为两个或多个不同的修饰可能同时发生在（或接近）相同的残基上，并且可以理解为单个修饰25。这可以通过确保已鉴定出未修饰的肽来解决，特别是通过使用标准品来确认或否认存在单个修饰而不是多个修饰（表1）。

为避免过度污染或提取不纯的组蛋白，使用前检查试剂的质量非常重要。例如，如果 NIB 缓冲溶液是批量储存和使用的，请确保溶液是透明的，没有浑浊或异常外观。浑浊可能是细菌生长的结果，细菌生长会污染样品，并可能导致组蛋白和细菌蛋白的混合物。此外，建议为测定准备新的校准曲线，例如用于测定蛋白质浓度的BCA或Bradford测定，确保用于校准曲线的蛋白质不会过期或降解。

这种方法可以扩展到其他类型的细胞或生物体，例如蚊子。对于全部或部分生物体，选择适当数量的生物体对于确保最终组蛋白浓度适合分析尤为重要。

此外，作为质谱仪维护的一般准则，应定期清洁前端，以防止仪器上堆积和运行之间的污染。根据需要，这种清洁应包括窗帘、孔板和四极杆。

通常，当使用液相色谱时，有必要考虑每周使用MS级溶剂制备新鲜流动相。最好保留专用移液器和玻璃器皿进行流动相制备，并在系统上放置新溶液时吹扫液相色谱管路。保护柱和分离柱通常应分别每100-200次进样和500-1500次进样更换26。确保在运行一批样品之前和之后注入空白。如果给定批次中有大量样品，也可以考虑在批次中以不同的间隔运行空白。

该协议提供了基于 PASEF 的 DDA 工作流程，用于检测组蛋白 PTM 以及基于离子淌度的同位异异异构和异构物质的区分。

该方案需要大量的样品制备，并且应考虑总体实验样品制备时间。平均而言，样品制备方案需要 2-3 个工作日才能完成。此外，实验室和仪器版本之间的差异也会影响分析的整体灵敏度。

很少有蛋白质组学数据分析软件被认为足以通过自下而上的方法分析组蛋白，而无需手动调整或校正27,28,29。结果应该（至少在一开始）使用手动分析来确认，这也是耗时的。如果使用分析软件，它应该具有MS/MS注释功能，这些功能通常易于确认或拒绝。

还值得一提的是，除非插入TIMS池并使用迁移率值，否则不可能通过质谱法分离异构体;例如，可以使用片段模式 （PASEF） 确定组蛋白修饰的位置。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Melvin A. Park 和 Matthew Willetts 是 timsTOF 仪器制造商 Bruker Daltonics Inc. 的员工。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本材料基于美国国家科学基金会（National Science Foundation）资助的工作。HRD-1547798 和授权号HRD-2111661。这些 NSF 赠款被授予佛罗里达国际大学，作为科学技术卓越研究中心 （CREST） 计划的一部分。这是佛罗里达国际大学环境研究所的第 1672 号贡献，这是佛罗里达国际大学的一项杰出项目。美国国立卫生研究院（National Institute of Health）根据拨款号提供了额外的支持。R21AI135469弗朗西斯科·费尔南德斯-利马（Francisco Fernandez-Lima）和格兰特·诺（Grant No.）R01HD106051本杰明·加西亚（Benjamin A. Garcia）以及美国国家科学基金会（National Science Foundation）的资助号。CHE-2127882 给 Benjamin A. Garcia。作者要感谢Mario Gomez Hernandez博士在初始方法开发过程中的初步支持。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
-80 华氏度C 冰箱
1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010023非动物源性
1 mL 移液器吸头Thermo Fisher Scientific94060710Finntip Flex 1000 μL 型，非无菌，未过滤，架装吸头
1.5 mL 微量离心管Thermo Fisher Scientific14-282-300使用这些管可简单安全地处理高达 1.5 mL
10 &微量的样品体积;L 移液器吸头Fisher Scientific94060100Finntip Flex，10 μL，未灭菌，未过滤，架装
10% NP-40ThermoFisher Scientific28324NP-40 表面活性放大器去污剂溶液
10x Dulbecco'不含 Ca2+/Mg2+的 PBSMediatech）MT21031CM
15 mL 锥形管Corning352196Falcon 锥形离心管
200 µL 凝胶加载移液器吸头Thermo Fisher Scientific02-707-138Fisherbrand 凝胶加载吸头，1–200 亩;L
200 和微型;L 移液器吸头Thermo Fisher Scientific94060310Finntip Flex 200μL，非无菌，未过滤，管装吸头
2x Laemmli 样品缓冲液Bio-Rad1610737用于 SDS-PAGE 的预混蛋白质样品缓冲液
50 mL 锥形管康宁352070Falcon 锥形离心管
96 孔平底板Thermo Fisher Scientific12565501
96 孔板，V 形底 600 &μ;LAxygenP-DW-500-C-S
丙酮Sigma Aldrich179124ACS 试剂，≥99.5%
乙腈 （ACN）Thermo Fisher ScientificA998HPLC、
含 0.1% 甲酸 （v/v） 的 Fisher 化学乙腈、LC/MS 级Thermo Fisher ScientificLS120Optima LC/MS 级、Thermo Scientific
AEBSFFisher Scientific328110500AEBSF 盐酸盐、98%
碳酸氢铵、NH4HCO3Sigma Aldrich09830BioUltra， ≥99.5% （T）
氢氧化铵溶液，NH4OHSigma AldrichAX1303符合 ACS 规范，符合检测 USP/NF 专论的试剂规范 GR ACS
氩气 （Ar）AirgasAR HP 300
BEH C18 HPLC 色谱柱Waters186003625XBridge 多肽 BEH C18 色谱柱，300 Å， 5 个和微;米，4.6 毫米 X 250 毫米，1K–15K
牛血清白蛋白 （BSA）Sigma AldrichA7906热休克分数，pH 7 和 ge;98%
氯化钙、CaCl2Sigma AldrichC4901无水物、粉末和ge;97%
细胞解离缓冲液Thermo Fisher Scientific13151014
陶瓷划线晶片Restek20116
Compass DataAnalysis 6.0Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2Bruker Daltonics
Compass IsotopePatternBruker Daltonics
Compass timsControl4.1Bruker Daltonics
考马斯亮蓝 R-250Bio-Rad1610436
深孔板，96 孔微孔板，2.0 mLThermo Fisher Scientific89237526
一次性细胞提升器Thermo Fisher Scientific 08100240Fisherbrand 细胞提升仪;一次性提升器可快速去除细胞层
一次性颗粒研杵Thermo Fisher Scientific12-141-363Fisherbrand 颗粒杵;重悬蛋白质和 DNA 沉淀或在微量离心管中研磨软组织
二硫苏糖醇 （DTT）Thermo Fisher ScientificP23251 M
甲酸 （FA）Sigma Aldrich695076ACS 试剂，≥96%
熔融石英毛细管 75 &μ;m ID x 363 μm OD（Molex （Polymicro）TSP075375
冰醋酸Thermo Fisher ScientificA38S醋酸，冰酸（ACS 认证），Fisher Chemical
玻璃巴斯德移液器Sigma AldrichBR747725-1000EA
高效液相色谱仪 岛津岛津 Prominence 20 HPLC UFLC 系统
盐酸，盐酸Sigma Aldrich258148ACS 试剂，37%
Hypercarb 30-40 &μ;m 碳 150–300 &Thermo Fisher Scientific60106-402
Hypersep 小柱Thermo Fisher Scientific60109-404
LC/MS 校准标准品，适用于 ESI-ToFAgilentG1969-85000TuningMix
氯化镁，MgCl2Sigma AldrichM8266无水物，≥98%
甲醇，用于 HPLCThermo Fisher ScientificA454Optima，用于 HPLC 的 Thermo Fisher Scientific  
微量离心管适配器GL Sciences501021514
微囊藻毒素Thermo Fisher Scientific50-200-8727Enzo Life Sciences 微囊藻毒素-LA
MS 样品瓶，LaPhaPack，卡口，12 mm x 32 mmLEAP PAL 部件LAP.11190933
NanodropThermo Fisher Scientific型号：ND3300
氮气 （N2）AirgasNI UHP300
PEAKS Studio X+生物信息学溶液
pH 试纸条，InstachekMicro Essential实验室JR-113型号：Hydrion
氯化钾，KClSigma AldrichP3911ACS 试剂，99.0%–100.5%
压力注射单元Next Advance 型号：PC77
酸酐Sigma Aldrich8.00608用于合成
冷冻离心机（700–18,000 x g）NuAire，型号：NuwindNU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm，3 gESI Source Solutionsr13.aq.0003
SDS-PAGE 凝胶Bio-Rad4569035任何 kD 预制聚丙烯酰胺凝胶，8.6 cm & 次 6.7 cm（W ×L），用于 Mini-PROTEAN 电泳槽
Thermo Fisher ScientificA11079.0698+%
氯化钠、NaClSigma AldrichS9888ACS 试剂 ≥99.0%
SPE 盘，C18VWR76333-134Empore SPE 盘，C18，CDS 分析型，90 mm x 0.5 mm，12 和微量;m
SpeedVac+ 真空泵和板转子Savant型号：SC210A
蔗糖Millipore1.07651适用于微生物学
硫酸，H2SO4 Sigma Aldrich33974199.999%
TIMS-ToF 质谱仪Bruker Daltonics型号 Tims tof ms
三氯乙酸溶液，TCASigma AldrichT06996.1 N
三氟乙酸 （TFA）Sigma Aldrich302031适用于 HPLC 和 ge;99.0%
Triversa NanomateAdvion型号：TR263
胰蛋白酶，MS 级Thermo Fisher Scientific90057
试管旋转器Thermo Fisher Scientific88881001
混合器Thermo Fisher Scientific88880017
含 0.1% 甲酸 （v/v） 的水，LC/MS 级Thermo Fisher ScientificLS118Optima LC/MS 级，Thermo Scientific 
Thermo （ Thermo 丙旋

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biology. 20, 245(2019).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. D., Roth, M. Crystal structure of the nucleosome core particle at 16 Å resolution. Journal of Molecular Biology. 176 (1), 55-75 (1984).
  4. Kornberg, R. D., Thomas, J. O. Chromatin structure: Oligomers of the histones: The histones comprise an (F2A1)2(F3)2 tetramer, a different oligomer of F2A2 and F2B, and monomer of F1. Science. 184 (4139), 865-868 (1974).
  5. Borghini, A., Cervelli, T., Galli, A., Andreassi, M. G. DNA modifications in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 230 (2), 202-209 (2013).
  6. Jeanne Dit Fouque, K., et al. 34;Double-Down" mass spectrometry of histone H4 proteoforms: Tandem ultraviolet-photon and mobility/mass-selected electron capture dissociations. Analytical Chemistry. 94 (44), 15377-15385 (2022).
  7. Lawrence, M., Daujat, S., Schneider, R. Lateral thinking: How histone modifications regulate gene expression. Trends in Genetics. 32 (1), 42-56 (2016).
  8. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  9. Meier, F., et al. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5378-5387 (2015).
  10. Chernushevich, I. V., Loboda, A. V., Thomson, B. A. An introduction to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 36 (8), 849-865 (2001).
  11. Andrews, G. L., Simons, B. L., Young, J. B., Hawridge, A. M., Muddiman, D. C. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Analytical Chemistry. 83 (13), 5442-5446 (2011).
  12. Bhanu, N. V., Sidoli, S., Garcia, B. A Workflow for ultra-rapid analysis of histone posttranslational modifications with direct-injection mass spectrometry. Bio-Protocol. 10 (18), e3756(2020).
  13. Xue, A., et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using proteomic analysis. British Journal of Cancer. 103 (3), 391-400 (2010).
  14. Wang, Y., et al. Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10S cells. Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).
  15. Mertins, P., et al. Integrated proteomic analysis of posttranslational modifications by serial enrichment. Nature Methods. 10 (7), 634-637 (2012).
  16. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100138(2021).
  17. Romson, J., Emmer, A. Mass calibration options for accurate electrospray ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry. 467, 11619(2021).
  18. Dupree, E. J., Jayathirtha, M., Yorkie, H., Mihasan, M., Petre, B. A., Darie, C. C. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14(2020).
  19. Ho, C. M., et al. Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu. Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).
  20. Eickbush, T., Moudrianakis, E. The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions. Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).
  21. Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs. Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).
  22. Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection. The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).
  23. Huang, R. X., Zhou, P. K. DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60(2020).
  24. Dantuma, N. P., van Attikum, H. Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response. The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).
  25. Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry. Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).
  26. Dolan, J. LC column problems everywhere 1. LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).
  27. Brusniak, M. K., et al. An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology. Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).
  28. Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions. Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).
  29. Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets. Methods. 61, 287-298 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Histone ModificationPosttranslational ModificationsLiquid ChromatographyTrapped Ion MobilityTime Of Flight Mass SpectrometryPeptide Isomer SeparationNanoelectrospray IonizationProtein ProspectorCollision Induced DissociationEpigenetic Variation Analysis

Related Articles