使用液相色谱、捕获离子淌度谱和飞行时间质谱进行组蛋白修饰筛选

摘要

基于液相色谱、捕集离子淌度质谱和飞行时间质谱（LC-TIMS-ToF MS/MS）的分析工作流程，用于高置信度和高重复性的“自下而上”组蛋白修饰分析，并依据主要参数（保留时间 [RT]、碰撞截面 [CCS] 和精确质荷比 [m/z]）进行鉴定。

摘要

组蛋白在真核生物中含量丰富且高度保守，其结构中的翻译后修饰（PTM）在基因调控中发挥重要作用。通过鉴定每种PTM或PTM模式相对于外部因素或遗传因素的位置和性质，可将这些信息与DNA转录、复制或修复等生物学响应进行统计学关联分析。本文介绍了一种高通量分析方法，用于从生物样本中检测组蛋白PTM。该方法结合使用液相色谱、捕获离子淌度质谱和飞行时间质谱（LC-TIMS-ToF MS/MS），可在单次分析中实现最具生物学相关性的修饰类型的分离及PTM定位。该分析策略利用了依赖性数据采集（DDA）技术的最新进展，即在淌度捕获装置中进行并行累积，随后依次进行片段化和碰撞诱导解离。组蛋白PTM的鉴定基于其保留时间、离子淌度和碎片化模式，具有高度可信度。

引言

在真核细胞中，DNA 以染色质的形式被包装成称为核小体的功能单位。这些单位由四种核心组蛋白（H2A、H2B、H3 和 H4 各两个）组成的八聚体构成^1,2,3,4。组蛋白是真核生物中最丰富且高度保守的蛋白质之一，主要参与基因表达调控⁵。组蛋白翻译后修饰（PTMs）在调控染色质动态以及触发 DNA 转录、复制和修复等各类生物学过程中发挥重要作用⁶。PTMs 主要发生在与 DNA 接触的组蛋白 N 末端区域的可及表面^3,7。然而，组蛋白尾部和核心区域的修饰均可影响染色质结构，改变核小体间的相互作用，并招募特定蛋白质^3,8。

基于液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的蛋白质组学研究目前面临的一个挑战是目标分析物可能发生共洗脱。在数据依赖性采集（DDA）模式下，这会导致在MS/MS采集过程中部分前体离子丢....

方案

注意：组蛋白样品的提取采用改编自 Bhanu 等（2020）的方法¹²。

1. 样品制备

1. 收获培养的细胞
   1. 当细胞融合度达到80%时，使用台盼蓝排斥法检测细胞活力。
      注：本实验采用 HeLa S3 细胞系，但该方法可应用于任何培养的细胞。
   2. 吸去培养基，然后向每块培养板中加入 5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）。
   3. 轻轻晃动培养板以冲洗残留的培养基，然后吸除 PBS，并加入 5 mL 的 1× PBS。
   4. 用一次性细胞刮铲轻轻刮取细胞，使其从培养板上分离。
   5. 将每份细胞悬液转移至15 mL锥形管中。
   6. 通过在 800 x g 条件下离心收集细胞沉淀 g 5 分钟。
   7. 吸除细胞沉淀中的 PBS。
   8. 进行组蛋白提取。
      注意：如果细胞沉淀不能立即处理，请在液氮中快速冷冻。将沉淀物保存在 -80 °C，直至准备继续实验。
2. 组蛋白提取
   1. 估计每个细胞沉淀的体积，并用记号笔标记液面弯月面。
   2. 准备足量的细胞核分离缓冲液（NIB；15 mM Tris-HCl (pH 7.5)，15 mM....

结果

自下而上的蛋白质组学工作流程（图7）通常包括以下步骤：从粗提样品中提取目标蛋白质，随后定量蛋白质浓度，然后通常通过凝胶电泳或液相色谱进行分级分离。分级分离后，使用蛋白酶（通常为胰蛋白酶）对蛋白质进行消化，最后对产生的肽段进行质谱分析，并利用已建立的数据库进行蛋白质鉴定¹⁸。序列信息来源于指定质荷比（m/z）范围内的前体离子，这些离子经过碰撞诱导解离（CID），产生可用于数据库比对和测序的碎片图谱¹⁹（图8）。

本研究的主要目标是开发并应用一种LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA方法，该方法遵循此前在方案部分所述的步骤。对于异构和同重肽段上翻译后修饰位点的确定，在鉴定和质谱解析方面一直存在特殊挑战。本研究采用重组人组蛋白标准品和HeLa S3细胞作为样品。

通过ESI-TIMS-P.......

讨论

组蛋白是一类碱性蛋白质，通过与DNA相互作用形成八聚体（包含两种H2A、H2B、H3和H4核心组蛋白各两个）来调控染色质结构²⁰。组蛋白含有大量赖氨酸和精氨酸残基，这些残基易于发生修饰，从而产生广泛的翻译后修饰（PTMs），通过影响组蛋白功能或与其他细胞内蛋白质结合，改变染色质的化学性质²¹。PTMs可通过协同作用引发生物学反应，已有研究报道特定组合的PTMs存在于多种疾病中，尤其是多种类型的癌症²²。

当细胞水平上识别到DNA损伤时，会立即启动复杂的信号级联反应，对损伤位点进行标记，并协调细胞周期进程，同时激活所需的修复通路。此外，DNA损伤会诱导多种修饰，例如乙酰化和甲基化加合物，这些修饰有助于招募相关蛋白²³。参与DNA损伤反应的多种翻译后修饰（PTMs）引发了一个问题：这些分子机制如何调控彼此之间的共存，以及通过一个极为复杂的整合网络来维护基因组完整性的功能意义是什么。例如，组蛋白H3.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
-80 °C 冰箱
1× 磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023	无动物源成分
1 mL 移液器吸头	Thermo Fisher Scientific	94060710	Finntip Flex 1000 μL，非无菌，无滤芯，盒装吸头
1.5 mL 微量离心管	Thermo Fisher Scientific	14-282-300	用于体积不超过 1.5 mL 样品的简便安全处理
10 µL 移液器吸头	Thermo Fisher Scientific	94060100	Finntip Flex，10 μL，非无菌，无滤膜，盒装
10% NP-40	Thermo Fisher Scientific	28324	NP-40 Surfact-Amps 去垢剂溶液
10× 不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的杜氏磷酸盐缓冲液 (Dulbecco’s PBS)	(Mediatech)	MT21031CM
15 mL 圆锥形离心管	Corning	352196	Falcon 圆锥形离心管
200 µL 凝胶加样移液吸头	Thermo Fisher Scientific	02-707-138	Fisherbrand 凝胶加样吸头，1–200 μL
200 µL 移液器吸头	Thermo Fisher Scientific	94060310	Finntip Flex 200μL，非无菌，无滤芯，盒装吸头
2× Laemmli 样品缓冲液	Bio-Rad	1610737	用于 SDS-PAGE 的预混蛋白样品缓冲液
50 mL 圆锥形离心管	Corning	352070	Falcon 圆锥形离心管
96 孔平底板	Thermo Fisher Scientific	12565501
96 孔 V 型底板，600 μL	Axygen	P-DW-500-C-S
丙酮	Sigma Aldrich	179124	ACS 试剂，≥99.5%
乙腈 (ACN)	Thermo Fisher Scientific	A998	HPLC 级，Fisher Chemical
含 0.1% 甲酸 (v/v) 的乙腈，LC/MS 级	Thermo Fisher Scientific	LS120	Optima LC/MS 级，Thermo Scientific
AEBSF	Thermo Fisher Scientific	328110500	AEBSF 盐酸盐，98%
碳酸氢铵，NH4HCO3	Sigma Aldrich	09830	BioUltra，≥99.5% (T)
氢氧化铵溶液，NH4OH	Sigma Aldrich	AX1303	符合 ACS 规格，符合 USP/NF 药典检测试剂规格 GR ACS
氩气 (Ar)	Airgas	AR HP 300
BEH C18 HPLC 色谱柱	Waters	186003625	XBridge 肽段 BEH C18 色谱柱，300 Å，5 µm，4.6 mm × 250 mm，1K–15K
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma Aldrich	A7906	热激组分，pH 7，≥98%
氯化钙，CaCl2	Sigma Aldrich	C4901	无水，粉末，≥97%
细胞解离缓冲液	Thermo Fisher Scientific	13151014
陶瓷刻划晶片	Restek	20116
Compass DataAnalysis 6.0	Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2	Bruker Daltonics
Compass IsotopePattern	Bruker Daltonics
Compass timsControl 4.1	Bruker Daltonics
考马斯亮蓝 R-250	Bio-Rad	1610436
深孔，96 孔微孔板，2.0 mL	Thermo Fisher Scientific	89237526
一次性细胞刮刀	Thermo Fisher Scientific	08100240	Fisherbrand 细胞刮刀；可快速去除细胞层
一次性研磨杵	Thermo Fisher Scientific	12-141-363	Fisherbrand 研磨杵；用于重悬蛋白和 DNA 沉淀或研磨微量离心管中的软组织
二硫苏糖醇 (DTT)	Thermo Fisher Scientific	P2325	1 M
甲酸 (FA)	Sigma Aldrich	695076	ACS 试剂，≥96%
熔融石英毛细管 75 μm 内径 × 363 μm 外径	(Molex (Polymicro)	TSP075375
冰醋酸	Thermo Fisher Scientific	A38S	冰醋酸（经 ACS 认证），Fisher Chemical
玻璃巴斯德吸管	Sigma Aldrich	BR747725-1000EA
高效液相色谱仪	Shimadzu		Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC 系统
盐酸，HCl	Sigma Aldrich	258148	ACS 试剂，37%
Hypercarb 30–40 μm 碳材料，150–300 Å	Thermo Fisher Scientific	60106-402
Hypersep 小柱	Thermo Fisher Scientific	60109-404
LC/MS 校准标准品，用于 ESI-ToF	Agilent	G1969-85000	TuningMix
氯化镁，MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	无水，≥98%
用于 HPLC 的甲醇	Thermo Fisher Scientific	A454	Optima HPLC 级，Fisher Chemical
微量离心管适配器	GL Sciences	501021514
微囊藻毒素	Thermo Fisher Scientific	50-200-8727	Enzo Life Sciences 微囊藻毒素-LA
质谱样品瓶，LaPhaPack，Snap，12 mm × 32 mm	LEAP PAL 配件	LAP.11190933
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	型号：ND3300
氮气 (N2)	Airgas	NI UHP300
PEAKS Studio X+	Bioinformatic Solutions
pH 指示试纸，Instachek	Micro Essential Lab	JR-113	型号：Hydrion
氯化钾，KCl	Sigma Aldrich	P3911	ACS 试剂，99.0%–100.5%
压力注射细胞	Next Advance	型号：PC77
丙酸酐	Sigma Aldrich	8.00608	用于合成
制冷离心机 (700–18,000 × g)	NuAire，型号：Nuwind	NU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm，3 g	ESI Source Solutions	r13.aq.0003
SDS-PAGE 凝胶	Bio-Rad	4569035	任意 kD 预制聚丙烯酰胺凝胶，8.6 cm × 6.7 cm（宽 × 长），适用于 Mini-PROTEAN 电泳槽
丁酸钠	Thermo Fisher Scientific	A11079.06	98+%
氯化钠，NaCl	Sigma Aldrich	S9888	ACS 试剂，≥99.0%
SPE 圆盘，C18	VWR	76333-134	Empore SPE 圆盘，C18，CDS Analytical，90 mm × 0.5 mm，12 µm
SpeedVac+ 真空泵及板式转子	Savant	型号：SC210A
蔗糖	Millipore	1.07651	适用于微生物学
硫酸，H2SO4	Sigma Aldrich	339741	99.999%
TIMS-ToF 质谱仪	Bruker Daltonics		型号 Tims tof ms
三氯乙酸溶液，TCA	Sigma Aldrich	T0699	6.1 N
三氟乙酸 (TFA)	Sigma Aldrich	302031	适用于 HPLC，≥99.0%
Triversa Nanomate	Advion	型号：TR263
胰蛋白酶，质谱级	Thermo Fisher Scientific	90057
管式旋转混合器	Thermo Fisher Scientific	88881001
涡旋混合器	Thermo Fisher Scientific	88880017
含 0.1% 甲酸 (v/v) 的水，LC/MS 级	Thermo Fisher Scientific	LS118	Optima LC/MS 级，Thermo Scientific