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使用液相色谱、捕获离子淌度谱和飞行时间质谱进行组蛋白修饰筛选

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DOI：

10.3791/65589

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2024年1月12日

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1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

本文内容

摘要

基于液相色谱、捕集离子淌度质谱和飞行时间质谱（LC-TIMS-ToF MS/MS）的分析工作流程，用于高置信度和高重复性的“自下而上”组蛋白修饰分析，并依据主要参数（保留时间 [RT]、碰撞截面 [CCS] 和精确质荷比 [m/z]）进行鉴定。

摘要

组蛋白在真核生物中含量丰富且高度保守，其结构中的翻译后修饰（PTM）在基因调控中发挥重要作用。通过鉴定每种PTM或PTM模式相对于外部因素或遗传因素的位置和性质，可将这些信息与DNA转录、复制或修复等生物学响应进行统计学关联分析。本文介绍了一种高通量分析方法，用于从生物样本中检测组蛋白PTM。该方法结合使用液相色谱、捕获离子淌度质谱和飞行时间质谱（LC-TIMS-ToF MS/MS），可在单次分析中实现最具生物学相关性的修饰类型的分离及PTM定位。该分析策略利用了依赖性数据采集（DDA）技术的最新进展，即在淌度捕获装置中进行并行累积，随后依次进行片段化和碰撞诱导解离。组蛋白PTM的鉴定基于其保留时间、离子淌度和碎片化模式，具有高度可信度。

引言

在真核细胞中，DNA 以染色质的形式被包装成称为核小体的功能单位。这些单位由四种核心组蛋白（H2A、H2B、H3 和 H4 各两个）组成的八聚体构成1,2,3,4。组蛋白是真核生物中最丰富且高度保守的蛋白质之一，主要参与基因表达调控5。组蛋白翻译后修饰（PTMs）在调控染色质动态以及触发 DNA 转录、复制和修复等各类生物学过程中发挥重要作用6。PTMs 主要发生在与 DNA 接触的组蛋白 N 末端区域的可及表面3,7。然而，组蛋白尾部和核心区域的修饰均可影响染色质结构，改变核小体间的相互作用，并招募特定蛋白质3,8。

基于液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的蛋白质组学研究目前面临的一个挑战是目标分析物可能发生共洗脱。在数据依赖性采集（DDA）模式下，这会导致在MS/MS采集过程中部分前体离子丢失9。飞行时间（ToF）质谱仪能够以极高的频率采集谱图9,10（最高可达数十kHz）11，使其能够快速扫描复杂样品中的全部前体离子（MS1），从而实现最佳灵敏度和高速的MS/MS序列分析（最高达100 Hz）9，因此特别适用于生物样品分析10。然而，在如此高的扫描速率下，其灵敏度仍受限于MS/MS的采集速率9。通过将捕获离子淌度谱（TIMS）与正交四极杆飞行时间（qToF）质谱仪联用，可有效缓解这些限制。在TIMS中，所有前体离子被并行富集，并根据其淌度依次洗脱，而不是通过四极杆选择单一前体质量9。平行累积-串联碎裂（PASEF）技术可在不损失灵敏度的前提下，实现每秒数百次MS/MS事件9。

本研究的主要目的是展示使用迁移率陷阱中平行累积并随后进行连续碎裂和碰撞诱导解离（CID）的差示迁移分析（DDA）的最新进展。组蛋白翻译后修饰（PTMs）的鉴定基于其保留时间（RTs）、迁移率及碎裂模式，结果具有高置信度。

方案

注意：组蛋白样品的提取采用改编自 Bhanu 等（2020）的方法12。

1. 样品制备

  1. 收获培养的细胞
    1. 当细胞融合度达到80%时，使用台盼蓝排斥法检测细胞活力。
      注：本实验采用 HeLa S3 细胞系，但该方法可应用于任何培养的细胞。
    2. 吸去培养基，然后向每块培养板中加入 5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）。
    3. 轻轻晃动培养板以冲洗残留的培养基，然后吸除 PBS，并加入 5 mL 的 1× PBS。
    4. 用一次性细胞刮铲轻轻刮取细胞，使其从培养板上分离。
    5. 将每份细胞悬液转移至15 mL锥形管中。
    6. 通过在 800 x g 条件下离心收集细胞沉淀 g 5 分钟。
    7. 吸除细胞沉淀中的 PBS。
    8. 进行组蛋白提取。
      注意：如果细胞沉淀不能立即处理，请在液氮中快速冷冻。将沉淀物保存在 -80 °C，直至准备继续实验。
  2. 组蛋白提取
    1. 估计每个细胞沉淀的体积，并用记号笔标记液面弯月面。
    2. 准备足量的细胞核分离缓冲液（NIB；15 mM Tris-HCl (pH 7.5)，15 mM NaCl，60 mM KCl，5 mM MgCl₂）2，1 mM CaCl2, 以及所有样品均使用含250 mM蔗糖的缓冲液。或者，若需在较长时间内处理大量样品，可将缓冲液批量配制后于2-8 °C保存，最长6个月；也可分装后于-15 °C至-25 °C冷冻长期保存，每次仅取出提取所需量解冻使用。
      注意：缓冲液在保存期间应保持澄清。若缓冲液在任何时候出现浑浊或任何其他异常外观，应弃用并重新配制新鲜缓冲液。
    3. 准备细胞沉淀体积50倍量的洗涤缓冲液，并按如下方式加入抑制剂（每2个样本约10 mL洗涤缓冲液）。
      1. 配制10 mL洗涤缓冲液，需混合以下成分：10 mL NIB、30 µL 200 mM盐酸-4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟（AEBSF）、10 µL 1 M二硫苏糖醇（DTT）、20 µL 5 µM微囊藻毒素、20 µL 5 M丁酸钠。
    4. 移除五分之一的洗涤缓冲液，用于配制裂解缓冲液（取洗涤缓冲液的五分之一体积，加入0.3% NP-40 或 NP-40 替代物）。
      注意：请勿使用Triton-X 100替代NP-40或NP-40替代试剂，因其对某些细胞类型可能过于剧烈。
    5. 充分洗涤细胞沉淀，将细胞重悬于5柱体积的洗涤缓冲液中，于800 × g离心 g 4 °C下离心5分钟。重复此步骤两次，每次洗涤之间吸除并弃去上清液。
    6. 确保用永久性记号笔标记细胞沉淀的体积。加入10倍体积的裂解缓冲液重悬。
    7. 用移液器充分吹打混匀每个沉淀，以重新悬浮，然后在冰上孵育15分钟。
    8. 15分钟后，以800 x g离心 g 4 °C下离心5分钟。
    9. 吸出并弃去上清液。
      注意：沉淀物应减少至 ≤ 1/2 原始沉淀体积（由标记线指示）。如果沉淀未充分减少，则重复裂解步骤，并加入使用研杵进行的轻柔匀浆步骤以破碎细胞。
    10. 裂解完成后，将沉淀重悬于500 µL洗涤缓冲液中，随后以800 x g离心 g 4 °C 下离心 5 分钟。吸除并弃去上清液，然后重复洗涤步骤一次，以彻底去除 NP-40 残留。
      注意：此时沉淀物为染色质，其中含有组蛋白。
    11. 将沉淀重悬于5倍体积（相对于原始细胞沉淀体积）的0.4 N H2SO4.
    12. 在冷室或冰箱中使用振荡器孵育2小时。
    13. 2小时后，以3400 x g离心样品。 g 4 °C下离心5分钟。不要丢弃上清液。
    14. 将上清液转移至新管中，加入终体积1/3量的100%三氯乙酸（TCA）（最终TCA浓度约为20%）。
    15. 轻轻倒置试管，观察到澄清无色的溶液变为白色和/或浑浊，表明蛋白质已沉淀。
      注意：对于组蛋白浓度较低的溶液，蛋白质沉淀可能不会立即明显，但在过夜孵育后应可见沉淀。
    16. 4 °C 条件下静置孵育过夜（12–18 小时），以使组蛋白完全沉淀。
    17. 次日，在3400 x g 4 °C下离心5分钟。
    18. 吸去上清液，注意移液枪头不要接触管壁。此阶段，组蛋白主要以管壁周围的薄膜形式沉积。
    19. 向每支试管中加入 500 µL 冰冷的丙酮 + 0.1% HCl（酸性丙酮），使用玻璃巴斯德吸管，然后轻轻倒置试管数次。操作过程中请将样品按顺序（1、2、3 等）排列，因为洒出的丙酮可能会去除试管上的标记。在 3400 x g 4 °C下离心5分钟，小心倾去上清液。
    20. 用500 µL预冷的100%丙酮重复此洗涤步骤，同样使用玻璃巴斯德吸管。在3400 x g 4 °C下离心5分钟，小心倾去上清液。
    21. 将离心管敞口置于室温下干燥，直至残留的丙酮完全挥发。
    22. 干燥后，向每管中加入 100 µL 质谱（MS）级水。用此液滴擦拭容器的所有内壁，以充分重悬整个组蛋白薄膜。操作时可将液滴移至管壁一侧，在上下移液的同时旋转离心管；或先加入一半体积（50 µL），再用枪头充分搅动管壁四周。结合使用这两种方法效果最佳。组蛋白易溶于水，将完全溶解于溶液中。
    23. 重悬所有样品后，若仍有残留的白色固体，于室温下在水浴中超声处理5分钟。
    24. 以 800 x 离心 g 4 °C下离心5分钟。将上清液转移至新的离心管中，弃去任何残留的不溶性沉淀。
    25. 在还原条件下进行SDS-PAGE，以验证提取物是否纯净。
      注意：只要能够区分10-20 kDa范围内的蛋白质，可使用任何合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。参见 材料表 用于本方案中所用凝胶。
    26. 进行蛋白质浓度测定（如 Bradford 或 BCA 法）以确定总蛋白浓度。
  3. 赖氨酸残基的化学衍生化（丙酰化）
    1. 转移20 µg组蛋白（通过蛋白质测定确定）至洁净离心管中。将此样品干燥至干涸 <5 µL，然后用20 µL 100 mM碳酸氢铵（NH4一氧化碳3）（约1 µg/µL溶液）。如有需要，用氨水调节pH至约8。
      警告：请勿使用氨水（NH₄OH）4用 OH) 重悬，仅在必要时调节 pH。否则，蛋白质会变性并沉淀。
      注意：为尽量减少样品损失，可用移液器吸头蘸取少量样品并点在pH试纸上进行pH检测。此检测步骤在后续样品制备过程中均适用。
    2. 通过将丙酸酐与乙腈（ACN）按1:3（v/v）的比例混合来配制丙酰化试剂（例如，配制40 µL试剂时，将10 µL丙酸酐与30 µL ACN混合）。
      注意：传统上，甲醇或异丙醇曾用于制备丙酰化试剂。由于丙酰化是一种酰胺形成反应，必须使用非质子性溶剂（如乙腈），以避免产生不必要的副产物和副反应，例如使用甲醇时会生成丙酸甲酯。每次制备的丙酰化试剂仅够用于最多4个样品，以确保试剂新鲜；试剂应在配制后1-2分钟内使用。试剂放置过程中，丙酸酐会与环境中的水分发生反应，开始生成乙酸，这可能影响试剂的有效性，并在加入试剂后改变组蛋白溶液的pH值。
    3. 将丙酰化试剂以1:4（v/v）的比例加入各样品中（即每20 µL组蛋白加入5 µL丙酰化试剂）。
    4. 迅速加入体积比为1:5的NH4OH（即每20 µL组蛋白溶液加入4 µL）以将溶液pH重新调至约8。如果pH仍然过低，可再加入1–2 µL NH4每次加入 OH，直至 pH 达到 8。通常，1:5（v/v）的比例已足够。
    5. 将样品在室温下静置孵育15分钟。
    6. 每批丙酰化试剂处理的样本数量不超过3-4个，以确保酸的生成最少。
    7. 重复丙酰化步骤1.3.2–1.3.5。进行第二轮丙酰化以确保 >95%的可利用赖氨酸被衍生化。
    8. 将样品干燥至干燥状态 <5 µL，使用真空浓缩仪。这将蒸发掉任何未反应的丙酰化试剂、酸性副产物以及从NH₃中释放的氨气4OH。如果样品完全干燥，也没有关系，因为不会造成明显的样品损失。
      注意：储存丙酸酐前，需用氩气置换瓶内空气，以防止残留的环境湿气与丙酸酐接触生成乙酸。
  4. 胰蛋白酶蛋白水解消化
    1. 将组蛋白重悬于 100 mM NH₄HCO₃ 中4HCO3 使总体积达到20 µL，获得1 µg/µL的最佳浓度。
      注意：浓度低于 1 µg/µL 的样品溶液将导致胰蛋白酶消化效率降低。
    2. 将胰蛋白酶以1:10（质量比）的比例加入组蛋白样品中（即向20 µg组蛋白中加入2 µL浓度为1 µg/µL的胰蛋白酶溶液）。
    3. 在37 °C孵育反应6-8小时。或者，在室温下孵育过夜（12-18小时）。
    4. 通过在 -80 °C 冻结至少 1 小时以终止消化反应。
      注意：不要使用酸来终止消化反应，因为这会导致该步骤中 pH 值意外下降。样品可在 -80 °C 保存，直至准备继续实验（中间暂停点）。
  5. 肽段N端的化学衍生化（丙酰化）
    1. 干燥样品至 <5 µL，使用真空浓缩仪。
    2. 将样品重悬至最多 20 µL（1 µg/µL），使用 100 mM NH4HCO3.
    3. 重复丙酰化步骤（步骤1.3）。
      注意：由于水相与有机相的比例较高，样品在此步骤中需要更长的干燥时间是正常现象。
  6. 使用阶段尖端进行样品脱盐
    1. 用50 µL质谱级水加0.1%三氟乙酸重悬或稀释样品。
    2. 使用11-G样品采集器，打取5个C圆片18 从固相萃取小盘中取出材料（在转移至移液枪头前，需打孔穿取全部5个小盘）。将小盘插入并确保其牢固且均匀地楔入200 µL移液枪头底部图1).
      注意：若通过单个StageTip对超过25 µg的样品进行脱盐，请使用15-G取芯针。
    3. 使用离心机适配器将stage-tips固定在1.5 mL或2 mL微量离心管中。
      注意：对于以下离心步骤，使用慢速（400-500 × g) 在 4 °C 下旋转 1-2 分钟；溶剂通常在不到 1 分钟内流经树脂，具体时间取决于 C18 材料被装入尖端。
    4. 通过加入50 µL 100%乙腈离心清洗树脂，以活化C18 材料并去除潜在污染物。
      注意：使用加样枪头将溶液加载到上样尖端可能会更方便。一旦 C18 材料活化后，在整个脱盐过程中必须避免树脂干燥。
    5. 用80 µL色谱级水加0.1%三氟乙酸通过离心平衡磁珠材料。
    6. 使用冰醋酸将样品酸化至pH 4或更低。用pH试纸检测pH值，方法同前，以尽量减少样品损失。
    7. 通过缓慢离心将全部样品加载到树脂盘上。
    8. 以离心方式用 80 µL 色谱纯水 + 0.1% TFA 洗涤样品。
    9. 通过缓慢离心，用70 µL 75%乙腈和0.5%乙酸冲洗，将样品洗脱至洁净的1.5 mL离心管中。可适当延长离心时间，以确保样品完全从Stage-tip中洗脱。即使树脂在额外离心过程中干燥也无妨，因为样品洗脱后树脂不再需要。
    10. 在真空浓缩仪中将每个样品完全干燥。
      ​注意：样品可在 -80 °C 保存，待准备就绪后再继续操作（中间暂停点）。
    11. 用于LC-MS/MS分析时，将样品重新溶解于液相色谱（LC）方案中的溶剂A（0.1%甲酸）中，使终浓度为0.4 µg/µL（即，将20 µg组蛋白溶解于50 µL溶剂A中）。

2. TIMS 软件界面

  1. 选择 仪器 选项卡并切换到 操作 模式（确认仪器名称变为绿色高亮）（图 2）。
  2. 核对 TIMS 参数（图 2）。
  3. 核对 MS 设置（扫描起始、扫描结束、离子极性、扫描模式）（图 2）。
  4. 核对 TIMS 设置（模式、迁移率起始、迁移率结束、斜坡时间、累积时间、占空比、斜坡速率、MS 速率、MS 平均次数和自动校准）（图 2）。
  5. 转至 源 选项卡，仅在 TuneMix 校准步骤中启用注射器选项（Hamilton 500 µL）（图 3）13。
  6. 进入 校准 选项卡，点击 m/z，选择 校准模式，并选择模式（通常为增强型 Q），设定缩放范围（+0.01%），标准偏差（0.24），然后点击 校准；当得分达到 100% 时，确认接受（图 4）。
  7. 转至迁移率选项卡并重复校准过程（通常为线性模式），检测范围（+5%），宽度（0.1 Da），标准偏差（0.1855），然后点击校准；当得分 ≥ 98.5% 时，确认接受（图 5）。
  8. 进入方法选项并选择要使用的方法；本示例中选择的方法为 Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl（图 5）。

3. 液相色谱-迁移谱-并行累积连续碎裂飞行时间质谱

  1. 使用典型的nESI工作条件：毛细管电压4500 V，端板偏移电压800 V，雾化器压力3.0 bar，干燥气体流速10.0 L/min，干燥加热器温度200 °C，进样流速50 µL/min。
  2. 使用典型的质谱设置：碰撞能量6 eV，碰撞射频电压1200 Vpp，传输时间75 µs，预脉冲储存时间5 µs。
  3. 通过入口漏斗P1与出口漏斗P2之间的压力差确定漂移气流。平行累积-串联碎裂（PASEF）在TIMS单元中发生，可同时累积所有前体离子，而非逐个累积。随后前体离子以窄离子峰形式释放，相较于通常更宽的峰（约窄50倍），从而在仍通过迁移率分离共洗脱肽段的同时提高信噪比14。
  4. 开发一种用于分析蛋白水解组蛋白肽段的LC-TIMS-ToF MS/MS方法。将配备C18色谱柱（300 Å，5 µm，4.6 mm × 250 mm）的高效液相色谱仪（HPLC）与采用专有PASEF技术的商用TIMS-TOF MS仪器联用。
    注：根据已发表的研究15,16,17，该色谱柱尺寸被证实可在高pH和低pH条件下对肽段混合物实现良好的分离效果。
    1. 设定进样体积为20 µL（8 µg）样品，流速为0.4 mL/min。
    2. 运行60分钟的非线性LC梯度，流动相A为含0.1%甲酸的水，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈。梯度设置如下：起始10% B保持2.7分钟，随后5.3分钟内升至20% B，4分钟内升至28% B，再18分钟内升至35% B，13分钟内升至40% B，2分钟内升至100% B。保持100% B 5分钟后，5分钟内降至10% B，并维持最后5分钟。
  5. 通过纳米电喷雾电离（nESI）在正离子模式下验证样品从HPLC洗脱进入TIMS-TOF的过程。

4. 数据分析

  1. 确定肽段序列及修饰位点。
    1. 使用 ProteinProspector 工具中的 MS-digest 功能 [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] 生成理论肽段列表。
      1. 进行理论酶切时，需考虑酶切条件（所用酶）、待搜索的翻译后修饰类型（例如单甲基化、二甲基化或三甲基化）、目标肽段的大小范围、质谱检测的质量范围以及可能存在的漏切位点数量。
  2. 基于理论肽段手动分析所获得的数据（图6）12。
    1. 针对每个理论肽段，在多个电荷态（+1 至 +4）下搜索相应的质荷比（m/z）值。
    2. 在初步鉴定每个 m/z 值后，选择对应峰，并根据肽段序列（包括翻译后修饰）生成的理论碎片离子列表，确认其二级质谱（MS/MS）信息。
      注意：若已知所鉴定肽段的迁移率，也应予以验证。
  3. 计算各种翻译后修饰的相对丰度，并将每种修饰表示为特定肽段序列的百分比。
    1. 使用以下公式计算每种检测到的翻译后修饰的相对丰度：
      相对丰度 = 修饰肽段峰面积 / 给定肽段未修饰形式与所有修饰形式的总峰面积

结果

自下而上的蛋白质组学工作流程（图7）通常包括以下步骤：从粗样品中提取目标蛋白质，随后定量蛋白质的浓度，然后通常通过凝胶电泳或液相色谱进行分级分离。分级分离后，使用蛋白酶（通常为胰蛋白酶）对蛋白质进行消化，最后对产生的肽段进行质谱分析，并利用已建立的数据库进行蛋白质鉴定18。序列信息来源于指定质荷比（m/z）范围内的前体离子，这些离子经过碰撞诱导解离（CID），产生可用于数据库比对和测序的碎片图谱19（图8）。

本研究的主要目标是开发并应用一种LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS DDA方法，该方法遵循此前在方案部分所述的步骤。对于异构和同重肽段上翻译后修饰位点的确定，在鉴定和谱图解析方面一直存在特殊挑战。本研究采用重组人组蛋白标准品和HeLa S3细胞作为样品。

通过ESI-TIMS-PASEF-ToF MS/MS对人组蛋白标准品进行组蛋白PTM分析，检测到中等到较大尺寸的肽段（长度为3-30个氨基酸），每条肽段最多可带5个电荷。丙酰化处理成功生成了比胰蛋白酶消化更长且信息更丰富的肽段。数据分析结果显示，肽段以多种修饰状态被鉴定出来。该基于TIMS的方法具有一个优势，即能够区分携带相同PTMs的位置异构肽段。例如，两种异构体可能在保留时间和m/z上重叠；然而，这两个信号可在迁移率维度上实现分离（图9）。

在图9中所示肽段对应的碎片谱图由蛋白质组学分析软件利用相应的FASTA文件进行注释。图9A显示了未修饰肽段，其上带有三个丙酰基（+56.03）修饰（分别位于N端、赖氨酸18位和赖氨酸23位）。图9B中观察到的肽段在赖氨酸18位有一个乙酰基（+42.02）修饰，并在N端和赖氨酸23位各有一个丙酰基修饰。最后，在图9C中，肽段在赖氨酸23位发生乙酰化修饰，同时在N端和赖氨酸18位各有一个丙酰基修饰。如先前所发表，PASEF技术的优势可通过重复靶向同一特征来提高测序速度和灵敏度9，从而使用户能够从生物样品中获得更丰富的结构信息。在本案例中，该技术被应用于分析每种组蛋白上发生翻译后修饰的类型与位置。

翻译后修饰分析还可以通过序列覆盖图进行可视化展示，如图10所示。图10A中，组蛋白H3标准品在酶解前经过丙酰化处理，产生的肽段比未处理时更长，以蓝色线条表示。从HeLa S3细胞中提取的组蛋白也采用相同方式处理，结果如图10B所示。结果显示了多种翻译后修饰，包括在同一氨基酸位点出现的多种不同修饰模式，这在生物样本中是预期之内的现象。值得注意的是，图10B中少量灰色线条代表由于信号强度过低而未能获得MS2谱图、因而鉴定结果存在不确定性的肽段。

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图1：Stage tips 的示意图及制备流程。（A-G） C18-硅胶盘 stage tip 制备的逐步说明。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：数据处理：20210804 丙酰化标准组蛋白混合物_QC 肽段。在开始处理数据之前，务必准备好可能电荷态及其碎片的理论列表（1550.9013；775.9543；517.6386；等），以便从基峰色谱图（BPC +All MS）中提取这些数值。在提取每个肽段后，需确认其形态与图中所示的分析列表一致。图中以 775.9543 峰为例进行展示。图右侧显示了三个图表：第一个为色谱图（强度-时间图），第二个为迁移图，第三个为包含 PASEF 碎裂的质谱图。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：timsControl 操作流程步骤 1-4。 该图展示了 timsControl 操作程序的前四个步骤。在左上方，点击 Instrument 按钮以开启或关闭仪器与软件之间的连接。在执行任何任务之前，必须确保软件处于运行模式。最后，确认 TIMS 参数设置正确。请点击此处查看此图的放大版本。

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图4：源参数。 本例中，仅使用 Hamilton 500 µL 进样器进行 TuneMix。请确认其他参数保持正确。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：质荷比（m/z）校准。 选择校准，直至左下方面板校准模式中获得100%的评分。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：迁移率校准。 选择校准，直至左下方面板校准模式中的得分达到至少98.5%。请点击此处查看该图的放大版本。

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图7：典型的自下而上蛋白质组学工作流程。 从样品制备到鉴定的自下而上操作步骤示意图9。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图8：保留时间、同位素分布及H3 18-26肽段的迁移率谱图。 （A）未修饰的丙酰化肽段，（B）K23Ac肽段在另外两个位点丙酰化，以及（C）K18Ac肽段在另外两个位点丙酰化。注意迁移率分离在B和C图所示结构异构体分析中的优势。请点击此处查看该图的放大版本。

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图9：使用PASEF进行MS/MS碎片肽段测序的示例。 碎片谱图来自对H3肽段（氨基酸位置18-26）的蛋白质组学分析软件结果。(A) 未修饰的丙酰化肽段，(B) K23Ac修饰并在其余两个位置丙酰化的肽段，以及(C) K18Ac修饰并在其余两个位置丙酰化的肽段。请点击此处查看该图的放大版本。

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图10：组蛋白翻译后修饰分析结果的可视化示例。 来自（A）H3标准品和（B）HeLa S3细胞中H3的检测肽段及翻译后修饰结果。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：标准肽段与HeLa S3肽段的液相色谱-离子淌度-飞行时间质谱（LC-TIMS-ToF MS/MS）特征。 目标肽段与实际检测到的肽段列表，包含实验性质（即保留时间、m/z、1/Ko 和液相色谱峰面积）。请点击此处下载该表格。

讨论

组蛋白是一类碱性蛋白质，通过与DNA相互作用形成八聚体（包含两种H2A、H2B、H3和H4核心组蛋白各两个）来调控染色质结构20。组蛋白含有大量赖氨酸和精氨酸残基，这些残基易于发生修饰，从而产生广泛的翻译后修饰（PTMs），通过影响组蛋白功能或与其他细胞内蛋白质结合，改变染色质的化学性质21。PTMs可通过协同作用引发生物学反应，已有研究报道特定组合的PTMs存在于多种疾病中，尤其是多种类型的癌症22。

当细胞水平上识别到DNA损伤时，会立即启动复杂的信号级联反应，对损伤位点进行标记，并协调细胞周期进程，同时激活所需的修复通路。此外，DNA损伤会诱导多种修饰，例如乙酰化和甲基化加合物，这些修饰有助于招募相关蛋白23。参与DNA损伤反应的多种翻译后修饰（PTMs）引发了一个问题：这些分子机制如何调控彼此之间的共存，以及通过一个极为复杂的整合网络来维护基因组完整性的功能意义是什么。例如，组蛋白H3第9位赖氨酸的三甲基化（H3K9me3）已被发现与多种疾病的病理过程相关24。正因如此，有必要开发出有效的分析技术方法，以实现对细胞水平上这些修饰的全面表征23。

使用手动数据分析软件和蛋白质组学分析软件对 HeLa S3 组蛋白提取物进行分析，检测到多种翻译后修饰（PTM），包括乙酰化（+42.01 Da）、甲基丙酰化（+70.04 Da）、二甲基化（+28.03 Da）以及三甲基化（+42.05 Da），这些修饰存在于多种组蛋白中。此外，基于 PASEF 的 MS/MS 方法能够区分携带相同翻译后修饰的一些位置异构肽段。

在引言中，简要描述了将液相色谱-迁移率-飞行时间串联质谱（LC-TIMS-ToF MS/MS）联用技术应用于蛋白质翻译后修饰（PTMs）研究的优势，以展示近年来采用迁移率陷阱中平行累积后接连续碎裂和碰撞诱导解离（CID）的数据依赖性采集（DDA）技术的最新进展。其核心思想是建立一种方法，能够分辨来自不同肽段的信号，而这些信号是传统技术迄今无法分辨的。使用丙酸酐进行衍生化处理可防止胰蛋白酶对赖氨酸C端的切割，从而生成更长、信息更丰富的肽段。具有相同质荷比（m/z）和保留时间的肽段可通过其碎裂图谱加以区分，但同时也发现，其中部分肽段物种还可利用该LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS方法在迁移率维度上实现分离。

为了更好地理解这一点，图8 展示了任意分子的三个主要特征，从而能够鉴定化合物，例如完整的蛋白质、脂质或肽段（在此为组蛋白 H3 18-26）等。这些特征包括化合物在色谱柱中的保留时间（min）、各化合物的质荷比（m/z），以及这些化合物与漂移气体相互作用时所表现出的迁移率（1/Ko）。在 图8A 中，未修饰的 H3 肽段 18-26 的保留时间为 28.15 min，并在其迁移率谱中显示出两条带，表明其至少存在两种构象，这一结果推测是由于根据先前所述方案，两个赖氨酸位点（18 和 23）发生了丙酰化修饰所致。接下来的谱图（图8B、C）展示的是同一条肽段（H3 18-26），但乙酰化基团（42.02）的位置不同：B 为 K18Ac，C 为 K23Ac。这两种异构体（K18Ac 和 K23Ac）通过迁移谱图得以识别，因其具有不同的空间分布，导致其在 TIMS 电池中与气体的相互作用不同。该方法的重要性在于，有可能识别并更深入地研究那些已与多种疾病（例如 DNA 损伤）相关的不同翻译后修饰（PTMs）。

当碎片数据稀疏时，确定特定残基上的修饰具有挑战性，因为两种或多种不同的修饰可能同时发生在同一残基（或附近）并被误认为是单一修饰25。这一问题可通过确认未修饰肽段已被鉴定来解决，尤其是通过使用标准品来验证或排除单一修饰的存在，而非多个修饰的存在（表1）。

为避免过度污染或提取出不纯的组蛋白，使用前检查试剂的质量至关重要。例如，若NIB缓冲液以大量储存和使用，应确保溶液澄清，无浑浊或异常外观。浑浊可能是细菌生长所致，会污染样品，并可能导致组蛋白与细菌蛋白的混合物。此外，建议为检测（如用于测定蛋白质浓度的BCA法或Bradford法）制备新鲜的标准曲线，并确保用于标准曲线的蛋白质未过期或降解。

该方法可拓展至其他类型的细胞或生物体，例如蚊子。对于完整或部分生物体，选择适当数量的生物体尤为重要，以确保最终组蛋白浓度适合分析。

此外，作为质谱仪维护的一般准则，应定期清洁前端，以防止仪器上污染物积聚以及不同样品运行之间的交叉污染。根据需要，清洁应包括帘板、孔板和四极杆。

通常，在使用液相色谱（LC）时，需要考虑每周使用质谱级溶剂新鲜配制流动相。建议专用移液器和玻璃器皿用于流动相的配制，并在系统更换新溶液时对LC管路进行充分冲洗。保护柱和分离柱通常应分别每100至200次进样和每500至1500次进样后更换26。在运行一批样品前后，务必注入空白样品。如果某一批次中的样品数量较多，也可考虑在该批次运行过程中间隔性地插入空白样品进行检测。

该方案提供了一种基于PASEF的DDA工作流程，用于检测组蛋白PTM，并根据离子淌度区分同量异位和同分异构物种。

本方案需要大量的样品制备，应充分考虑整体实验样品制备所需时间。通常情况下，样品制备方案需要2至3个工作日才能完成。此外，不同实验室之间以及仪器型号的差异可能会影响分析的整体灵敏度。

极少有蛋白质组学数据分析软件被认为无需手动调整或校正即可充分适用于通过自下而上（bottom-up）方法分析组蛋白via bottom-up methods without manual adjustment or correction27,28,29。结果应（至少在初期）通过人工分析进行确认，而这一过程同样耗时。如果使用分析软件，其应具备 MS/MS 谱图注释功能，此类功能通常易于用于确认或排除鉴定结果。

还值得一提的是，除非使用带有离子淌度值的 TIMS 细胞，否则无法通过质谱分离异构体；例如，可以利用碎裂模式（PASEF）来确定组蛋白修饰的位置。

披露

Melvin A. Park 和 Matthew Willetts 是布鲁克道尔顿公司（Bruker Daltonics Inc.）的员工，该公司是 timsTOF 仪器的制造商。

致谢

本材料基于美国国家科学基金会（NSF）资助项目 HRD-1547798 和 HRD-2111661 所支持的工作。这些 NSF 资助项目由佛罗里达国际大学（Florida International University）获得，属于“科学与技术研究中心（CREST）计划”的一部分。本文为佛罗里达国际大学卓越项目“环境研究所”（Institute of Environment）的第 1672 号贡献。此外，本研究还获得了美国国立卫生研究院（National Institute of Health）的资助，资助编号分别为授予 Francisco Fernandez-Lima 的 R21AI135469 和授予 Benjamin A. Garcia 的 R01HD106051，以及美国国家科学基金会资助编号 CHE-2127882（授予 Benjamin A. Garcia）。作者谨此感谢 Mario Gomez Hernandez 博士在方法初步开发阶段提供的初始支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
-80 °C 冰箱
1× 磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010023无动物源成分
1 mL 移液器吸头Thermo Fisher Scientific94060710Finntip Flex 1000 μL，非无菌，无滤芯，盒装吸头
1.5 mL 微量离心管Thermo Fisher Scientific14-282-300用于体积不超过 1.5 mL 样品的简便安全处理
10 µL 移液器吸头Thermo Fisher Scientific94060100Finntip Flex，10 μL，非无菌，无滤膜，盒装
10% NP-40Thermo Fisher Scientific28324NP-40 Surfact-Amps 去垢剂溶液
10× 不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的杜氏磷酸盐缓冲液 (Dulbecco’s PBS)(Mediatech)MT21031CM
15 mL 圆锥形离心管Corning352196Falcon 圆锥形离心管
200 µL 凝胶加样移液吸头Thermo Fisher Scientific02-707-138Fisherbrand 凝胶加样吸头，1–200 μL
200 µL 移液器吸头Thermo Fisher Scientific94060310Finntip Flex 200μL，非无菌，无滤芯，盒装吸头
2× Laemmli 样品缓冲液Bio-Rad1610737用于 SDS-PAGE 的预混蛋白样品缓冲液
50 mL 圆锥形离心管Corning352070Falcon 圆锥形离心管
96 孔平底板Thermo Fisher Scientific12565501
96 孔 V 型底板，600 μLAxygenP-DW-500-C-S
丙酮Sigma Aldrich179124ACS 试剂，≥99.5%
乙腈 (ACN)Thermo Fisher ScientificA998HPLC 级，Fisher Chemical
含 0.1% 甲酸 (v/v) 的乙腈，LC/MS 级Thermo Fisher ScientificLS120Optima LC/MS 级，Thermo Scientific
AEBSFThermo Fisher Scientific328110500AEBSF 盐酸盐，98%
碳酸氢铵，NH4HCO3Sigma Aldrich09830BioUltra，≥99.5% (T)
氢氧化铵溶液，NH4OHSigma AldrichAX1303符合 ACS 规格，符合 USP/NF 药典检测试剂规格 GR ACS
氩气 (Ar)AirgasAR HP 300
BEH C18 HPLC 色谱柱Waters186003625XBridge 肽段 BEH C18 色谱柱，300 Å，5 µm，4.6 mm × 250 mm，1K–15K
牛血清白蛋白 (BSA)Sigma AldrichA7906热激组分，pH 7，≥98%
氯化钙，CaCl2Sigma AldrichC4901无水，粉末，≥97%
细胞解离缓冲液Thermo Fisher Scientific13151014
陶瓷刻划晶片Restek20116
Compass DataAnalysis 6.0Bruker Datonics
Compass HyStar 6.2Bruker Daltonics
Compass IsotopePatternBruker Daltonics
Compass timsControl 4.1Bruker Daltonics
考马斯亮蓝 R-250Bio-Rad1610436
深孔，96 孔微孔板，2.0 mLThermo Fisher Scientific89237526
一次性细胞刮刀Thermo Fisher Scientific 08100240Fisherbrand 细胞刮刀；可快速去除细胞层
一次性研磨杵Thermo Fisher Scientific12-141-363Fisherbrand 研磨杵；用于重悬蛋白和 DNA 沉淀或研磨微量离心管中的软组织
二硫苏糖醇 (DTT)Thermo Fisher ScientificP23251 M
甲酸 (FA)Sigma Aldrich695076ACS 试剂，≥96%
熔融石英毛细管 75 μm 内径 × 363 μm 外径(Molex (Polymicro)TSP075375
冰醋酸Thermo Fisher ScientificA38S冰醋酸（经 ACS 认证），Fisher Chemical
玻璃巴斯德吸管Sigma AldrichBR747725-1000EA
高效液相色谱仪 ShimadzuShimadzu Prominence 20 HPLC UFLC 系统
盐酸，HClSigma Aldrich258148ACS 试剂，37%
Hypercarb 30–40 μm 碳材料，150–300 ÅThermo Fisher Scientific60106-402
Hypersep 小柱Thermo Fisher Scientific60109-404
LC/MS 校准标准品，用于 ESI-ToFAgilentG1969-85000TuningMix
氯化镁，MgCl2Sigma AldrichM8266无水，≥98%
用于 HPLC 的甲醇Thermo Fisher ScientificA454Optima HPLC 级，Fisher Chemical  
微量离心管适配器GL Sciences501021514
微囊藻毒素Thermo Fisher Scientific50-200-8727Enzo Life Sciences 微囊藻毒素-LA
质谱样品瓶，LaPhaPack，Snap，12 mm × 32 mmLEAP PAL 配件LAP.11190933
NanodropThermo Fisher Scientific型号：ND3300
氮气 (N2)AirgasNI UHP300
PEAKS Studio X+Bioinformatic Solutions
pH 指示试纸，InstachekMicro Essential LabJR-113型号：Hydrion
氯化钾，KClSigma AldrichP3911ACS 试剂，99.0%–100.5%
压力注射细胞Next Advance 型号：PC77
丙酸酐Sigma Aldrich8.00608用于合成
制冷离心机 (700–18,000 × g)NuAire，型号：NuwindNU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm，3 gESI Source Solutionsr13.aq.0003
SDS-PAGE 凝胶Bio-Rad4569035任意 kD 预制聚丙烯酰胺凝胶，8.6 cm × 6.7 cm（宽 × 长），适用于 Mini-PROTEAN 电泳槽
丁酸钠Thermo Fisher ScientificA11079.0698+%
氯化钠，NaClSigma AldrichS9888ACS 试剂，≥99.0%
SPE 圆盘，C18VWR76333-134Empore SPE 圆盘，C18，CDS Analytical，90 mm × 0.5 mm，12 µm
SpeedVac+ 真空泵及板式转子Savant型号：SC210A
蔗糖Millipore1.07651适用于微生物学
硫酸，H2SO4 Sigma Aldrich33974199.999%
TIMS-ToF 质谱仪Bruker Daltonics型号 Tims tof ms
三氯乙酸溶液，TCASigma AldrichT06996.1 N
三氟乙酸 (TFA)Sigma Aldrich302031适用于 HPLC，≥99.0%
Triversa NanomateAdvion型号：TR263
胰蛋白酶，质谱级Thermo Fisher Scientific90057
管式旋转混合器Thermo Fisher Scientific88881001
涡旋混合器Thermo Fisher Scientific88880017
含 0.1% 甲酸 (v/v) 的水，LC/MS 级Thermo Fisher ScientificLS118Optima LC/MS 级，Thermo Scientific 

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Protein Prospector

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