方法文章

利用刚性或柔性基底上的垂直排列碳纳米纤维阵列向植物递送生物分子和染料

DOI：

10.3791/65602

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2023年7月21日

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1Biophysical Sciences, The University of Chicago, 2Molecular Genetics and Cell Biology, The University of Chicago, 3Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory, 4Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago, 5Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 6Department of Chemistry, East Tennessee State University

本文内容

摘要

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本文介绍了垂直排列碳纳米纤维（VACNFs）的微加工方法、将VACNFs转移至柔性基底的技术，以及在刚性和柔性基底上将VACNFs应用于植物以实现生物分子和染料递送的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

将生物分子和不可渗透性染料递送至完整植株是一项重大挑战。纳米材料是向植物递送DNA的新兴工具。尽管这些新工具前景广阔，但其应用仍不广泛。在刚性基底（支撑材料）上制备的纳米材料尤其难以成功应用于弯曲的植物结构。本研究描述了微加工垂直排列碳纳米纤维阵列并将其从刚性基底转移至柔性基底的过程。我们详细阐述并演示了这些纤维（无论位于刚性或柔性基底上）如何用于植物的瞬时转化或染料（例如荧光素）递送。我们展示了如何将垂直排列的碳纳米纤维（VACNFs）从刚性硅基底转移至柔性SU-8环氧树脂基底，从而形成柔性VACNF阵列。为克服SU-8的疏水性，我们在柔性薄膜中的纤维表面包覆了一层薄的二氧化硅层（2–3 nm）。为了将这些纤维用于向弯曲植物器官递送物质，我们在VACNF薄膜的纤维侧滴加1 µL的染料或DNA溶液，静置10分钟，然后将薄膜贴附于植物器官表面，并使用棉签以滚动方式推动纤维进入植物细胞。通过该方法，我们已成功实现了对具有弯曲表面的植物器官进行染料和DNA递送。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

植物转化（包括瞬时转化和稳定转化）尚未在所有植物组织和物种中广泛实现。植物的瞬时转化是指将质粒中编码的基因暂时导入植物细胞，但这些基因不会稳定地整合到基因组中。传统方法如微粒轰击、农杆菌介导、电穿孔或聚乙二醇处理原生质体等，操作过程缓慢或较为繁琐。此外，这些方法并非适用于所有植物物种1,2,3,4。 利用纳米材料递送DNA是一个新兴领域，目前仍处于发展初期5。已有研究表明，特定类型的纳米材料——碳纳米纤维，能够成功将蛋白质、葡聚糖和染料递送至植物叶片，且不会引发伤口反应6。本研究旨在提供一种利用碳纳米纤维这类纳米材料向植物递送生物分子或染料的详细实验方案。本文以DNA作为目标生物分子，实现多种植物器官中细胞的瞬时转化。

此前，Morgan 等人7证明了将碳纳米纤维固定在刚性硅基底上，可用于瞬时转化生菜、N. benthamiana 和杨树的叶片，以及拟南芥的叶片和根部。尽管在多种器官上均实现了转化，但纤维在曲面结构的植物组织（如根或果实）上更难施用。我们推测，若采用柔性基底承载纳米纤维，可能因其更贴合器官形状而提高递送效率。

本文详细介绍了用于制备和设计垂直排列碳纳米纤维（VACNFs）、将VACNFs转移至柔性基底，以及在刚性和柔性基底上将VACNFs应用于植物以递送生物分子和染料的方法。碳纳米纤维采用直流催化等离子体增强化学气相沉积法（dc C-PECVD）结合镍催化剂制备。镍催化剂点的位置、直径和高度通过电子束光刻、金属蒸发和剥离工艺的组合进行控制，具体方法如Melechko等人8,9所述。使用双层电子束抗蚀剂，可在基底上沉积更厚的镍催化剂，从而获得更长的纤维10。将纤维从刚性基底转移至柔性基底的方法基于Fletcher等人11所述方法的改进，当前方法无需使用非晶碳层或牺牲性光刻胶层。通过利用SU-8在欠烘焙和欠曝光条件下产生的固有拉伸应力，实现带有纤维转移的SU-8剥离12,13,14。SU-8是一种复杂的聚合物，天然具有疏水性，这使其在促进DNA递送方面的应用变得困难。为克服SU-8的疏水性，在将纤维嵌入SU-8后，我们通过原子层沉积法施加一层薄硅氧化物15。在刚性基底上应用纤维进行生物分子/染料递送时，采用Davern等人6所述的镊子轻敲所产生的冲击力，以及Morgan等人7所述的“芯片上”（on-plant）和“芯片内”（on-chip）方法。柔性VACNF薄膜应用于曲面植物表面时，首先采用Morgan等人7所述的“芯片内”方法，将DNA或染料液滴半干燥于薄膜表面，然后使用小型化妆涂抹工具将薄膜卷覆在曲面植物表面16,17。图1展示了将纤维应用于刚性和柔性基底并作用于植物的多种方法。

方案

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1. VACNFs 的制备（图 2 和 图 3）

  1. 在硅片上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）495 A4 以 4000 rpm 旋涂光刻胶，并在 180 ℃ 烘烤 °C，5 分钟
    注意：将晶圆冷却10秒后再进行下一步操作。
  2. 旋涂第二层光刻胶（PMMA 950 A2）并在180℃下烘烤 °C，5 分钟。
  3. 使用电子束光刻技术在指定的横向间距（节距：10）下定义直径为300 nm的催化剂点 µ米，或 35 µ3 毫米 × 3 毫米阵列中
  4. 将光刻胶在 30–40 mL 的甲基异丁基酮：异丙醇（IPA）比例为 1:3 的显影液中显影 1.5 分钟，随后用 IPA 冲洗并用 N₂ 吹干2.
    注意：使用明场显微镜（20倍物镜）检查点阵分布情况。
  5. 使用硅刻蚀机中的氧气等离子体对晶圆进行6秒曝光（去胶残），以清除残留光刻胶。
  6. 使用电子束蒸发法先沉积一层金属粘附层（Ti 或 Cr，10 nm），然后沉积第二层 Ni 催化剂（130 nm 或 150 nm）。在沉积 Ti 或 Ni 金属期间，保持电流在 10 kV 下低于 0.2 A，压力低于 5 × 10⁻⁶ Torr。-6 Torr，沉积速率约为 1 Å/s，用于视线沉积。
  7. 使用连续的浴式超声处理去除沉积在底层光刻胶上的金属（Ni），保留直接沉积在硅片上的镍。该过程称为剥离（lift-off）。
    1. 为此，准备3个盛有丙酮的容器，在室温（RT，20℃）下将晶圆置于丙酮中进行超声波清洗1分钟；重复3次。 °C) 以 35 kHz 的频率进行。用异丙醇（IPA）冲洗，并用氮气（N₂）吹干。2.
      注意：切勿让丙酮在晶圆上自然晾干。最后一次丙酮超声处理后，应立即用异丙醇（IPA）冲洗，然后用氮气吹干。2 气体。如果晶圆在任何时刻过早变干（在异丙醇冲洗之前），可能导致无法完全去除多余的金属和光刻胶，且丙酮可能留下残留物。
  8. 使用扫描电子显微镜（SEM）检查催化剂形貌的几何结构。为获取VACNF芯片的SEM图像，将样品台倾斜至30度° 角度，并使用1-3 kV的电压，束流约为100 pA，工作距离约为5 mm。
    注意：催化剂应呈圆柱形致密块状，形似冰球图4）。致密圆柱体的高度应反映沉积在硅片上的镍的厚度。如果镍点的轮廓较高且顶部呈凹陷状，形似火山（图4），那么催化剂更容易破裂形成多个镍液滴，从而导致碳纳米纤维发生分支9(图4 以及 图5）。这些问题可能源于金属蒸发过程中因沉积时间过长导致光刻胶熔化，或与剥离工艺相关的问题。图4 和 图5).
  9. 将硅晶圆切成四等份，并放入直流等离子体增强化学气相沉积室（dc-PECVD）中，通入乙炔/氨气混合气体。优化生长参数以控制纳米纤维的长度和锥度（尖端） <200 nm
    1. 使用1-1.5 A的电流和440-560 V的电压范围。在生长纤维时，当设备和基底加热至620 °C时，采用氨气流进行预处理阶段。 °C. 确保在启动等离子体前10秒打开碳源（乙炔）。
      注意：若需优化等离子体增强化学气相沉积（PECVD）设备的运行参数，则使用四分之一晶圆。以制备长度超过 40 的纤维 µm且尖端直径小于200 nm的垂直排列碳纳米纤维（VACNFs），建议采用以下参数：当Ni催化剂厚度为130 nm时，使用1.75 A电流，生长时间70分钟，乙炔∶氨气流量比为45标准立方厘米每分钟（sccm）∶100 sccm；当Ni厚度为150 nm时，使用1.5 A电流，生长时间80分钟，乙炔∶氨气流量比为48 sccm∶100 sccm。无论催化剂厚度如何，生长VACNFs时均采用以下参数：生长温度620 °C °C，等离子体过程中压力为10 torr，喷头高度为20 mm（图6).
  10. 使用 SEM 在 30 评估所得纤维的几何形态° 以1 kV的加速电位倾斜。
    注意：理想的纤维应为笔直且无分支。使用电子束蒸发仪无法控制镍催化剂的晶体取向，因此由于催化剂去湿现象，部分纤维会出现分支。9此外，晶体取向导致VACNFs生长高度不同，因此难以实现所有VACNFs的高度均一。
  11. 以1000 rpm转速将一层光刻胶（SPR955）旋涂于纤维上，持续45秒。随后切割 ¼ 使用切割锯将晶圆切成 3 mm × 3 mm 的阵列。将纤维在此阶段保存，以备后续使用。
    ​注意：如果计划将纤维转移至柔性基底，则不要执行步骤 1.11。

2. 将垂直排列的碳纳米纤维转移至柔性基底（图 7 和图 8）

  1. 纤维合成后，在晶圆或四分之一晶圆上以 4000 rpm 的速度旋涂 SU-8 2015 光刻胶，持续 45 秒。
  2. 在 95 °C 下对晶圆进行前烘 3 分钟。
  3. 使用接触式光刻机，采用 3 mm × 3 mm 的阵列掩模对晶圆进行曝光，曝光剂量为 95 mJ/cm2，掩模需与电子束光刻定义的图案对齐。
    注意：使用接近式接触模式，曝光间隙应比最高纤维高度大 20 µm。此步骤中纤维可能被碰倒。
  4. 在 95 °C 下进行曝光后烘烤，持续 6 分钟。
  5. 将晶圆在 SU-8 显影液中显影 15 秒，用 IPA 冲洗，并用 N2 从上至下吹干。
    ​注意：显影时确保晶圆完全浸没。
  6. 对已图案化的晶圆旋涂一层保护性薄光刻胶（SPR 955 CM 0.7），转速为 3000 rpm，持续 45 秒，并在 90 °C 下前烘 30 秒。
  7. 通过原子层沉积在 100 °C 下进行 22 个循环，在晶圆上沉积一层薄硅氧化物层（2–3 nm）。
  8. 使用划片机将晶圆切割成 3 mm × 3 mm 的正方形，划片机需与晶圆上已有的图案对齐。
  9. 使用扫描电子显微镜（SEM），在 30° 倾斜角和 3 kV 加速电压下评估所得纤维的形貌。
  10. 若需长期保存芯片（>1 周），可在此步骤停止。将芯片避光保存。
  11. 为分离柔性基底与刚性基底，将单个芯片置于丙酮中 30 分钟，或直至 SU-8 开始卷曲。
  12. 将 SU-8 薄膜（无论是否仍附着于刚性基底）用异丙醇（IPA）清洗 5 分钟，再用水清洗 5 分钟。运输时将芯片放入带有粘性垫的商用盒中。
  13. 可选：将 SU-8 薄膜无纤维的一面置于水溶性胶带，或置于带有薄聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET，厚度 12.5 µm）背衬的薄硅橡胶上。
    1. 使用镊子转移 SU-8 薄膜。按压 SU-8 方片的边缘，使其牢固粘附于胶带/硅橡胶-PET 上，以避免纤维断裂。此时，VACNF 薄膜已可立即使用。
    2. 制备硅橡胶/PET 载具的方法如下：使用双组分硅橡胶试剂盒，将两组分（弹性体与交联剂）混合均匀。然后，裁剪一块 PET 方片，并用胶带固定于透明塑料皿中。在 PET 上倾倒一层极薄的硅橡胶，于 80 °C 下固化 1–2 小时。

3. 植株上操作法（将待递送溶液滴加到植物表面）使用刚性基底中的纤维（图1A）

  1. 用丙酮（100%，5 分钟）、异丙醇（100%，5 分钟）和去离子水（5 分钟）依次洗涤，逐步去除光刻胶。2使用前 O（5 分钟）。
  2. 将待穿刺的植物组织置于坚硬的表面上以提供支撑。
  3. 放置1 µL染料或DNA液滴 (200 ng) 置于植物组织表面。
  4. 将带有刚性基底的VACNF芯片置于液滴顶部，使纤维方向朝向液滴并与其接触。
    注意：芯片的方向可以通过以下方式确定 "光泽度" 晶圆的表面。芯片的光面带有纤维，而暗面则无纤维。
  5. 使用镊子的平面轻敲芯片。用软头标记笔标记芯片与植物接触的区域。递送完成后，移除VACNF芯片。
    注意：敲击时施加的力度需根据所用植物组织的类型而调整。建议在进行纤维穿刺操作前先练习敲击芯片。避免对植物组织造成损伤，若在植物组织中可见VACNF芯片的轮廓，则表明已造成损伤。
  6. 重复步骤 3.1–3.5 进行对照实验（+染料/DNA，-纤维；-染料/DNA，+纤维；以及-染料/DNA，-纤维）。“-纤维”指芯片无纤维的一侧。
  7. 将完整植株或离体植物器官置于长日照条件（16小时光照，8小时黑暗）的湿润培养箱中保存，必要时进行。对于离体器官，使用底部铺有湿润滤纸的塑料培养皿。

4. 芯片上法（将待递送溶液的液滴置于 VACNF 芯片上），刚性基底（图 1B）

  1. 使用丙酮（100%，5 分钟）、异丙醇（IPA，100%，5 分钟）和双蒸水（ddH2O，5 分钟）依次洗涤，去除光刻胶，然后方可使用。
  2. 在带有刚性基底的 VACNF 芯片的纤维侧滴加 1 µL 染料或质粒 DNA（200 ng）。确保将液滴置于芯片中央，并覆盖多根纤维。让液滴干燥 15 分钟。
    注意：可通过晶圆的"光泽度"来判断芯片的方向。芯片的光亮面含有纤维，而不透明面则无纤维。
  3. 处理叶片或其他离体器官时，将其放置于硬质表面之上；处理完整植株时，则在施加 VACNF 的器官下方放置硬质支撑物。
  4. 经过 15 分钟干燥后，将 VACNF 芯片定位，使纤维面与植物组织接触。用镊子尾部轻敲芯片。
    注意：轻敲时施加的力度需根据所用植物组织类型进行调整。建议预先练习轻敲操作。
  5. 重复植株上操作法中的步骤 3.6–3.7。

5. 采用芯片上方法将SU-8薄膜中的垂直排列碳纳米纤维（VACNFs）应用于植物组织（图1C）

  1. 在SU-8薄膜的纤维侧滴加1 µL染料或DNA（200 ng），静置干燥10分钟。确保液滴位于芯片中央。
    注意：干燥时间根据所用基底的不同而有所差异。
  2. 使用一对尖头镊子将VACNF薄膜放置于植物表面。
    注意：SU-8薄膜在空气中暴露的时间越长，其脆性越大。为降低丢失SU-8薄膜的风险，请确保所有植物/样品和设备均放置在SU-8薄膜附近。
  3. 用一个小的化妆棉签轻轻滚压VACNF薄膜。用软头标记笔标记柔性基底接触的位置。使用胶带将柔性基底从植物表面移除。
    注意：滚压化妆棉签时施加的力度因所用植物组织的不同而异。在进行生物分子或染料递送前，应先练习VACNF薄膜的应用。若在植物组织上可见VACNF薄膜的轮廓，则表明植物组织已出现明显损伤。
  4. 对对照组重复步骤5.1–5.3，并按照离体植株法步骤3.7中所述条件储存植物。

6. 所有递送方法的显微镜观察与图像分析

  1. 使用共聚焦显微镜对样品成像，选择适合所递送荧光探针/报告分子的发射和激发波长。
    注意：瞬时转化所需时间因植物种类和递送的标记物而异。例如，荧光标记物的表达在拟南芥中于48小时后检测到，而在生菜叶片中则需96小时7。
  2. 成像时，尽量聚焦于纤维脱落的区域。纤维可能具有不同的取向。递送成功与否并不依赖于断裂纤维的外观。
    注意：由于等离子体增强化学气相沉积（PECVD）过程中形成的氮化硅层，纤维在最常见的激发/发射设置下会呈现荧光18。
  3. 每个样品至少采集5张图像。所得信号可能存在差异。
  4. 使用ImageJ19测量20 µm × 20 µm共聚焦图像区域内的总荧光强度（积分密度）7。

结果

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VACNF芯片在刚性或柔性基底上的显著优势在于能够将生物分子或染料递送至植物的特定位置（图1）。本研究中，我们采用荧光信号读取来评估递送效果。使用不同的植物、基底以及递送方法（芯片上或植物上），荧光素染料的出现时间可能存在差异。为快速判断VACNF芯片/薄膜是否适用于递送，可采用纤维直接递送染料的方法（图9）。图9中标注不同时间的图像来自同一样品的不同视野。使用植物上递送方法时，通过荧光显微镜可在递送荧光素染料后立即观察到染料信号。此外，若在向植物递送荧光素染料后随时间连续观察同一视野，信号强度会随时间逐渐减弱（图10）。荧光素染料可能通过胞间连丝从当前视野迁移至叶片其他区域20,21。与植物上递送方法相比，在刚性基底上采用芯片上递送方法时，染料在穿刺区域内的扩散速度较慢（图9）。这可能是由于染料从纤维上解离或在细胞内重新水化，从而需要更长时间才能移动所致。

柔性基底中的纤维适用于向草莓和苹果等曲面表面递送染料（图11 和 图12）。在草莓上使用柔性基底时，可立即观察到强烈的荧光素信号（图11），而在苹果中则需要2小时才能观察到强烈的荧光素信号（图12B、D）。通过荧光显微镜检测所产生的荧光信号，可以确定编码荧光标记物的质粒是否成功递送（图12F、图13 和 图14）。必须设置对照实验，以确定所选植物本身是否不存在与目标递送荧光标记物相似的自发荧光。仅使用纤维进行实验有助于判断镊子施加的冲击力是否对植物组织造成损伤，或样品中观察到的荧光是否来源于VACNFs本身，因为其氮化硅层具有固有荧光特性18（图13C–D）。刺入植物组织的纤维不会诱导伤口响应，这一点通过H2O2的产生情况得以验证6。最后，使用“+DNA，-Fibers”作为对照是必要的，以确认DNA不会仅通过轻敲进入植物细胞，从而证明纤维对于将DNA递送至植物细胞是必需的（图13E–F）。当在刚性基底上使用VACNFs时，采用“在植株上”或“在芯片上”的递送方法应无明显差异，这由荧光值无显著差别所证实（图13I）。使用柔性VACNF薄膜结合芯片上DNA递送方法，成功实现了市售苹果和洋葱表皮细胞的瞬时转化（图12F 和 图14）。

失败的实验可能在不同视野中出现断裂的纤维，但尝试递送质粒DNA或染料后不会产生荧光信号。如果对植物施加过大的压力，将出现明显的组织损伤（图15）。这种机械损伤在显微镜下观察时可能表现为植物组织上的微小孔洞或透明区域，仿佛部分细胞层已被去除。有时芯片的压痕也可能可见。在DNA递送后未检测到荧光蛋白表达的实验，也可能由于使用了低质量的DNA，因此建议制备新鲜的DNA。

DNA/染料施用示意图：在植株上、在芯片上、在薄膜上的方法，结合轻敲和滚动技术。
图 1：利用刚性和柔性基底上的纤维向植物组织递送染料/DNA 的示意图。（A）在植株上通过纤维介导递送染料/DNA。将 1 µL 染料/DNA 溶液液滴置于叶片表面，然后将 VACNF 芯片放置在液滴上方。使用一对镊子轻轻敲击芯片使其进入组织。移除刚性基底后，纳米纤维保留在组织内。（B）在芯片上通过纤维介导递送 DNA。将 1 µL 染料或 DNA 溶液滴加到 VACNF 芯片上，并干燥 15 分钟。将带有半干 DNA 的芯片置于叶片表面，如图 A 所示轻敲进入组织。（C）在芯片上使用 SU-8 薄膜递送 DNA。将纤维从刚性硅基底转移至柔性 SU-8 支撑层上。将 1 µL 染料/DNA 溶液滴加到 VACNF 薄膜上，并干燥 10 分钟。然后使用化妆涂抹工具将带有半干染料/DNA 的 VACNF 薄膜滚动贴附到弯曲的植物表面。请点击此处查看该图的放大版本。

光刻工艺示意图，包含以下步骤：曝光、金属沉积、剥离、等离子体增强化学气相沉积（PECVD）生长。
图 2：制备垂直排列碳纳米纤维阵列的工作流程。 为制备垂直排列的碳纳米纤维（VACNFs），首先将双层聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA 495 A4 后接 PMMA 950 A2）旋涂在硅片上。使用电子束光刻技术定义直径为 300 nm 的点阵。随后在甲基异丁基酮/异丙醇（MIBK/IPA，1:3）中显影 1.5 分钟。利用金属蒸发仪，在硅片上先沉积一层 10 nm 的钛（Ti）作为粘附层，再沉积一层 130 nm 或 150 nm 的镍（Ni）。然后通过剥离工艺（在丙酮中超声浴）去除剩余的光刻胶。通过扫描电子显微镜（SEM）检查催化剂点的形貌。若催化剂呈扁平圆柱状、类似冰球，则将其放入等离子体增强化学气相沉积（PECVD）设备中进行纤维生长。随后使用 SEM 对所生长的纤维进行检查。请点击此处查看该图的放大版本。

显示针尖高度和间距测量结果的微结构SEM图像。
图3：理想垂直排列碳纳米纤维的扫描电镜（SEM）图像。（A）间距约为35 µm、高度为10–15 µm的垂直排列碳纳米纤维（VACNFs）的电子显微照片，成像角度为30°。该图像在图7C中重复出现。（B）间距约为20 µm、高度为20–30 µm的垂直排列氮化碳纳米纤维（VANCFs）的电子显微照片，成像角度为30°。（C）间距约为35 µm、高度为50–60 µm的VANCFs的电子显微照片，成像角度为30°。（D）直径<200 nm的VACNF尖端的电子显微照片。纤维尖端直径存在一定变异（150–300 nm）。由于纤维以30°角成像，其表观高度比实际高度小sin(30°)=1/2倍。图A和图B已获Morgan等人7的转载许可。请点击此处查看该图的高清版本。

用于材料分析的微结构带尺寸标注的扫描电子显微镜图像。
图 4：生长垂直阵列碳纳米纤维（VACNFs）前催化剂几何形貌的扫描电子显微镜（SEM）图像。（A）剥离后催化剂的SEM图像。注意催化剂边缘周围存在光刻胶，导致形成火山口状结构。（B、C）使用单层PMMA抗蚀剂后催化剂的火山口状结构的SEM图像。（D）由双层PMMA制成的理想冰球状催化剂结构。由于在A、B和D图中纤维以30°倾角成像，其显示的高度比实际高度小sin(30°) = 1/2倍。比例尺为100 nm。请点击此处查看此图的放大版本。

催化剂对纤维形成的影响；包含不同直径（200-600 nm）的示意图及SEM图像。
图5：催化剂点尺寸对纤维生长的影响：为确定催化剂材料的最佳直径，实验中采用200-600 nm范围内的点尺寸进行纤维生长。400-600 nm范围的点尺寸导致催化剂发生去润湿现象，并引发多根纤维的生长。直径为300 nm时获得了最优的纤维形貌。更小的点尺寸则导致纤维高度不足。由于纤维图像在30°倾角下拍摄，其表观高度比实际高度小sin(30°) = 1/2倍。图像采用扫描电子显微镜拍摄。请点击此处查看该图的放大版本。

化学气相沉积示意图；基底上的电离气体；10 托腔室；650°C，300V。
图6：美国橡树岭国家实验室（ORNL）使用的直流等离子体增强化学气相沉积（dc-PECVD）系统的示意图。 ORNL 的定制系统配备一个大型喷淋头，用作反应气体的反应器和等离子体的输出端。喷淋头相对于基底加热台保持 300 V 的直流电位。请点击此处查看此图的放大版本。

在硅晶圆上进行PECVD纳米纤维工艺的示意图：涂层、ALD、丙酮浴、清洗步骤。
图7：将纤维从刚性基底转移至柔性基底的工作流程。 在完成纳米纤维的合成与检测后，每片晶圆以4000 rpm的转速旋涂SU-8 2015，持续45秒。随后在95 °C下进行前烘3分钟。然后将晶圆置于掩膜对准仪中，以95 mJ/cm2的剂量进行紫外光曝光并完成图形化。在95 °C下后烘6分钟后，使用SU-8显影液显影15秒，再用异丙醇（IPA）冲洗，并用N2气体吹干。接着在晶圆上旋涂一层SPR 955 CM 0.7保护性光刻胶，转速为3000 rpm，并在90 °C下软烘30秒。随后通过原子层沉积（ALD）在晶圆上沉积一层2–3 nm厚的二氧化硅层（100 °C下进行22个循环），使柔性基底具有亲水性15。之后使用划片机将晶圆切割成3 mm × 3 mm的方片。使用时，将单个芯片置于丙酮中，直至SU-8开始卷曲并呈凹形（>30分钟）。此时，大多数芯片上的SU-8层边缘可用尖头镊子夹住，并从下方的硅基底上完整剥离，形成一块3 mm见方的薄膜。随后将该薄膜依次在异丙醇和水中各清洗5分钟，并立即投入使用。 请点击此处查看该图的放大版本。

微结构的SEM图像，展示尺寸和表面形貌分析。
图8：纤维从刚性基底转移到柔性基底的扫描电镜（SEM）图像。 所示图像具有代表性，但来自不同的样品。(A) PECVD生长后的长纤维（与图2C中的图像相同）。(B,C) 涂覆SU-8后的纤维。环氧树脂在纤维底部上涌。暴露的纤维长度范围为5 µm至30 µm。(D) 剥离后嵌入SU-8中的纤维保持了其几何形状。由于纤维以30°倾角成像，其表观高度比实际高度小sin(30°)=1/2倍。图A已获Morgan等人许可转载7。 请点击此处查看该图的放大版本。

芯片上和植物上随时间推移的染料与纤维递送显微结果。
图9：使用刚性基底上带纤维的芯片法和植物上法向拟南芥叶片递送染料。（A–P）图像通过共聚焦显微镜获取。芯片法（A–H）：将1 µL的10 µM荧光素染料在VACNF芯片上干燥15分钟，然后用镊子将芯片轻敲至拟南芥叶片的远轴面。（A–D）递送后5–15分钟内成像的叶片。（E–H）递送后1小时成像的叶片。（A,E）+染料，+纤维。对照组：（B,F）-染料，-纤维；（C,G）-染料，+纤维；（D,H）+染料，-纤维。（I–P）植物上法：将1 µL的10 µM荧光素染料置于植物表面，将芯片放置使其接触液滴，并用镊子将芯片轻敲至拟南芥叶片的远轴面。（I–L）递送后5–15分钟内成像，（M–P）递送后1小时成像。（I,M）+染料，+纤维。对照组：（J,N）-染料，-纤维；（K,O）-染料，+纤维；（L,P）+染料，-纤维。图A–P为z轴堆叠图像中的单层平面图像。比例尺为20 µm。纤维间距为35 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

植物组织中叶绿素自发荧光的延时显微成像，持续90分钟。
图10：通过使用刚性基底的植株上法在拟南芥中递送染料的时间过程。 图像采用共聚焦显微镜获取。使用植株上法，将1 µL浓度为10 µM的荧光素染料溶液滴加至叶片表面，随后将VACNF芯片置于液滴之上。使用一对镊子轻轻敲击芯片使其进入组织。对同一区域每5分钟采集一次“+染料，+纤维”的图像。比例尺为20 µm。纤维间距为35 µm。各图均为z轴层扫图像中的单层平面图像。请点击此处查看该图的放大版本。

芯片显微镜、染料效应、纤维存在；荧光、结构分析、比较研究。
图11：利用VACNF薄膜向草莓果实递送染料。（A-H）图像采用共聚焦显微镜获取。使用芯片上样方法，将染料液滴干燥于VACNF薄膜上，随后用化妆涂抹工具将薄膜滚压至果实表面。荧光素染料（10 µM）递送至草莓细胞后，在（A）10分钟和（B）1小时进行成像。（C,D）未处理对照组（-Dye, -Fibers）。（E,F）-Dye, +Fibers对照组分别在10分钟和1小时后的结果。（G,H）+Dye, -Fibers对照组分别在10分钟和1小时后的结果。比例尺为40 µm。图A-H为188 µm z轴堆栈图像的最大投影。纤维间距为35 µm。请点击此处查看本图的放大版本。

带有染料、纤维存在的显微镜图像；不同递送后时间点显示细胞摄取情况。
图12：通过VACNF薄膜向苹果递送染料及实现瞬时转化。 （A–F）图像采用共聚焦显微镜生成。使用芯片上方法，将1 µL的荧光素染料（10 µM，B 和 D）或1 µL编码pUBQ10:YFP的质粒（DNA−YFP）（200 ng）滴加并干燥于VACNF薄膜表面，随后使用化妆用涂抹器将薄膜滚压至果实表面。荧光素染料递送至苹果表皮后，在（B）10分钟和（D）2小时进行成像。（D）染料递送后需一定时间扩散进入细胞。通过VACNF薄膜递送DNA-YFP并在（F）48小时后观察其表达。（A、C、E）为未处理对照组（-Dye/DNA-YFP，-Fibers）。比例尺为40 µm。图A–D为z轴层扫获得的单层平面图像。图E和F为53 µm z轴层扫的最大投影图像。纤维间距为35 µm。箭头表示荧光素或YFP信号。*表示纤维。请点击此处查看该图的放大版本。

植物转化方法比较，YFP荧光显微镜，柱状图分析。
图13：利用植株上或芯片上的VACNF方法对拟南芥叶片进行瞬时转化。（A-H）在DNA递送后48小时使用共聚焦显微镜获取图像。（A、C、E、G）植株上方法：将1 µL编码pUBQ10:YFP（DNA−YFP）（200 ng）的质粒置于拟南芥叶片的远轴面。将芯片放置使其与液滴接触，并用镊子轻敲芯片使其插入叶片组织中。（B、D、F、H）芯片上方法：将1 µL DNA−YFP（200 ng）在VACNF芯片上干燥15分钟，然后用镊子将芯片轻敲入拟南芥叶片的远轴面。+DNA-YFP，+Fibers表示（A）植株上方法和（B）芯片上方法。对照组：（C、D）-DNA-YFP，+Fibers；（E、F）+DNA-YFP，-Fibers；以及（G、H）-DNA，-Fibers。（I）来自2-3次实验合并的5个生物学重复中25个20 × 20 µm区域的YFP通道荧光信号相对平均强度的图表。由于自体荧光，含有气孔（*）的区域被排除。从每个平均值中减去了-DNA-YFP、-Fibers条件下的平均荧光强度。采用双因素方差分析（及Tukey检验）进行显著性检验，误差线代表均值的标准误差。不同字母表示处理间的显著差异（P < 0.0001）。所有图像均为40 µm z轴堆栈的最大投影。比例尺为20 µm。白色箭头指示图像中的纤维。纤维间距为35 µm。本图经Morgan等7许可转载。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA-YFP与纤维条件下的荧光显微镜图像，显示细胞结构的差异。
图14：利用VACNF薄膜对洋葱进行瞬时转化。 在DNA递送后48小时，使用共聚焦显微镜获取图像。采用芯片上方法，将1 µL编码pUBQ10:YFP（DNA-YFP）（200 ng）的质粒DNA液滴干燥于VACNF薄膜上10分钟，随后将薄膜滚压至植物器官表面。(A) DNA-YFP被递送至洋葱表皮，并在其中表达YFP。(B) 无处理对照组；(C) 对照组（+DNA-YFP，-Fibers）；以及(D) 对照组（-DNA-YFP，+Fibers）。比例尺为40 µm。纤维间距为35 µm。图像为115 µm深度的z轴堆栈最大投影图像。请点击此处查看该图的放大版本。

显微图像，DNA-YFP和纤维存在情况比较，细胞结构分析。
图15：VACNF薄膜应用于生菜后引起的组织损伤。（A-D）图像通过共聚焦显微镜获得。（A）采用芯片上方法，通过VACNF薄膜将DNA递送至生菜叶片。将含有pUBQ10:YFP DNA（200 ng）的液滴在VACNF薄膜上干燥10分钟，随后将薄膜卷压在离体生菜叶片的远轴面，并在湿度培养箱中保存4天。（B）对照组（-DNA-YFP，+Fibers）。（C）对照组（+DNA-YFP，-Fibers），以及（D）无处理组（-DNA-YFP，-Fibers）。比例尺为40 µm。VACNF的间距为35 µm。箭头指示因柔性基底卷压时施力过大而导致的植物损伤。请注意，在其他实验中已成功实现VACNF介导的DNA向生菜的递送7。请点击此处查看该图的放大版本。

VACNF process flowchart; fiber prep via SEM, dye/fiber delivery, DNA expression check, confocal eval.
图16：VACNF介导的植物递送工作流程。 在I阶段，使用SEM检查纤维的几何形貌。为实现有效递送，纤维尖端需具备特定直径 <200 nm。若使用柔性基底上的纤维，则下一步需通过扫描电镜（SEM）确认纤维是否成功转移至SU-8，并检测暴露纤维的高度。在第二阶段（Stage II），我们通过使用刚性或柔性基底将染料递送至目标植物或器官，以验证纤维的实用性。使用1 µL液滴，可将其直接置于植物表面，或短暂干燥于芯片/薄膜上。在此步骤及所有其他步骤中，必须设置适当的对照组（-Dye, -Fibers；-Dye, +Fibers；+Dye, -Fibers），以确保信号确实来源于 真正 染料递送。在第三阶段，确认目的基因存在于质粒中，确定递送的DNA浓度，并测试递送后检测表达的最佳时间点。在第四阶段，通过共聚焦显微镜评估结果，以检测递送标记物的表达情况。该图已经Morgan等人许可修改。7. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了构建垂直排列碳纳米纤维阵列的方法，将纤维转移至柔性基底，并将纤维应用于刚性或柔性基底上的植物，以实现生物分子或染料向植物体内的递送。我们描述了两种通用的材料沉积方法——芯片上法（on-chip）和植株上法（on-plant），并展示了在刚性基底上的纤维以及使用VACNF薄膜的芯片上法所取得的成功结果。相较于传统的植物转化方法（如基因枪法、聚乙二醇介导或电穿孔法的原生质体转化），这些纤维的应用在理论和实践中更为简便，且可用于对农杆菌介导转化具有抗性的植物。然而，仅有少数细胞被成功转化。

垂直排列的碳纳米纤维通过橡树岭国家实验室纳米相材料科学中心的用户计划制备。用户可申请使用该设施来生产垂直排列的碳纳米纤维（VACNFs）。此外，也可在洁净室中使用直流等离子体增强化学气相沉积设备并结合碳源来制备VACNF芯片22,23。根据所述方法，纤维的制备、纤维转移以及VACNF芯片/薄膜的应用过程中有几个关键步骤。为确保纤维能够有效应用于植物细胞递送，纤维必须保持笔直，且其尖端直径需<200 nm6,7（图3）。为了制备特定尺寸和间距的碳纳米纤维，可通过调节多种参数实现，包括点直径、横向间距以及所沉积催化剂的量。为选择用于碳纳米纤维制备的最佳点直径，我们从不同点直径生长了纤维（如图5所示）。研究发现，300 nm直径的点可获得最佳纤维，因此选定该点尺寸（图5）。在确定合适参数后，我们选用那些具有理想几何形貌（笔直且尖端直径<200 nm）的纤维比例超过>50%的芯片。为检测纤维的几何形貌，我们采用扫描电子显微镜对VACNF芯片/薄膜样品上的随机视野区域进行成像分析。

此外，纤维必须具有一定的最小长度，才能实现向植物细胞内的递送。制备不同长度纤维的重要性在于，较长的纤维可用于穿透更深的组织层。较长的纤维（>40 µm）对于柔性薄膜至关重要，因为纤维转移依赖于从基部断裂纤维，并需要在纤维顶部叠加 SU-8 层。本方案中所用 SU-8 层的工作厚度为 20–35 µm。在各种植物（弯曲或平坦）表皮内实现递送所需的最小高度为 10–15 µm6,7。因此，VACNF 薄膜必须使用长度 >40 µm 的纤维。在制备碳纳米纤维时需考虑多个不同参数：催化剂材料、催化剂几何形状、催化剂材料厚度，以及 PECVD 腔室内的条件（气体比例、压力、温度、电流、喷头高度和生长时间）8,9,24,25。为了制备 Morgan 等人7 和 Davern 等人6 所使用的长度超过 25 µm 的碳纳米纤维，我们增加了 Ni 催化剂的用量，调整了乙炔与氨气的比例，并提高了电流和生长时间。此外，我们更加关注催化剂材料的几何形状。为了获得高而直立的纤维，沉积的催化剂应呈曲棍球饼状，而非类似火山口的形状（图 4）。火山口结构源于显影后残留的光刻胶。为防止火山口结构的形成，在电子束光刻过程中使用了双层 PMMA 以形成底切结构26。该底切结构有助于沉积的金属催化剂的剥离（图 2）。催化剂的较厚层对于高 VACNF 的生长至关重要。VACNF 的形貌已被 Merkulova 等人24 研究。VACNF 的垂直取向归因于 Ni 催化剂的尖端型生长机制以及直流电场势垂直于基底的取向（图 6）。喷头描述了 PECVD 反应器的几何结构（图 6），并作为电场电势的来源27。

为了利用电子束光刻技术定义催化剂点阵列，我们涂覆了一层电子束抗蚀剂（聚甲基丙烯酸甲酯），然后使用电子束在晶圆上特定位置和特定形状处于抗蚀剂中形成微小孔洞。具有目标直径的孔洞以规则网格排列，并设定好间距（节距）；在将基底放入设备之前，已将指定所需图案的文件载入电子束光刻系统中。除了纤维高度外，影响纤维成功转移的另一个关键参数是在丙酮浴中浸泡的时间。垂直阵列碳纳米管薄膜需在丙酮浴中浸泡足够长时间，使其边缘开始卷曲；若浸泡时间过短，则薄膜更难从芯片上剥离，且可能发生断裂。芯片存放时间越久，在丙酮浴中所需浸泡的时间就越长。完成丙酮浸泡后，将薄膜/芯片依次置于异丙醇和水中，以去除残留的丙酮以及纤维表面的保护性光刻胶。

进行旋涂时，将晶圆或晶圆碎片放置在旋涂机的真空吸盘上，并使用旋涂机的测试功能确认晶圆的中心位置。在晶圆中心滴加一小滴光刻胶（直径约2.5 cm），然后以3000 rpm的转速旋转45秒。纤维在旋涂前后的图像见图8，显示纤维的几何形貌（高度、取向和间距）得以保持。由于纤维的存在，光刻胶会在纤维底部积聚，导致涂层厚度超过预期。其他研究团队已对垂直阵列碳纳米管（VACNF）生长后的旋涂工艺进行了探索11,18。

该流程中另一个至关重要的步骤是确保对 VACNF 芯片/薄膜施加适当大小的力。递送机制依赖于镊子在刚性基底上轻敲所产生的冲力，使纤维在细胞壁上形成微小穿孔6,7，或在柔性基底上使用迷你化妆涂抹头进行滚动实现。纤维可能会断裂并残留在植物细胞内6,7，但这并不影响最终结果；然而，仍需通过实践结合染料摄取和组织损伤的观察，以准确掌握施加的压力。此外，在使用 VACNF 芯片/薄膜递送 DNA 后，选择合适的成像时间点也十分重要，因为可检测表达的时间因植物物种及所递送载体类型的不同而有所差异7（图 16）。

尽管该方法在植物研究中具有广泛适用性，但仍存在一些局限性。例如，由于在SU-8表面添加了光刻胶保护层，向VACNF薄膜上沉积一层薄薄的二氧化硅并不总能使其完全变为亲水性。如果出现这一问题，可尝试在VACNF上施加更厚的二氧化硅层。为检测薄膜是疏水性还是亲水性，可将其置于水中观察：若薄膜下沉，则为亲水性；若漂浮，则为疏水性。此外，不同批次制备的纤维之间可能存在差异。在直流等离子体增强化学气相沉积（dc-PECVD）设备中生长纤维时，有多个参数可以调节；本方案中所述内容是针对两种不同量的Ni催化剂所设定的一组参数。另外，Ni催化剂的晶体取向无法控制28，且纤维中不可避免地会出现一定程度的分支结构。

本文中，我们利用刚性和柔性基底将荧光素染料和DNA递送至植物细胞，展示了该方法的应用。该方法还可广泛适用于其他生物分子和遗传修饰手段，例如在苹果或其他需要数年时间才能获得稳定转基因品系的果树系统中，可用于RNAi基因沉默。此外，这些纤维还可用于向植物递送基因编辑材料或实现稳定的遗传转化。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

纳米纤维阵列在能源部科学办公室下属的纳米相材料科学中心（用户设施）制备完成（项目编号：CNMS2019-103 和 CNMS2022-A-1182）。对纳米相材料科学中心（CNMS）的支持通过同行评审的提案系统授予，并为计划发表研究成果的获批申请人提供免费使用资源的机会（http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml）。我们感谢 Kevin Lester 和 CNMS 在纳米纤维阵列制备过程中提供的协助。我们感谢 John Caughmen 博士、Timothy McKnight 博士、Amber Webb 博士、Daryl Briggs 和 Travis Bee 在实验设计方面的重要讨论。我们感谢 Adam Rondinone 博士提供 PECVD 设备的示意图。我们感谢 Leslie Carol 提供科学插图。本研究由美国能源部科学办公室生物与环境研究局生物成像科学项目资助（项目编号：DE-SC0019104），以及美国农业部资助（项目编号：2021-67013-34835）。JMM 得到美国农业部国家食品与农业研究所农业与食品研究计划博士前奖学金（项目编号：2021-67034-35167）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
13" x 13" 白色1/4折重型Brawny工业用抹布，70片装Fastenal 690535
2-丙醇（IPA） Fischer ScientificA451-4
4" 盖子EntegrisH22-401-0615晶圆载具
4" 托盘EntegrisH22-40-0615晶圆载具
Accretech SS10 切割锯AccreteckSS10
丙酮Fischer ScientificA18-4
ORNL洁净室中使用的丙酮JT Baker9005-05
苹果杂货店无产品编号
Arabidopsis thaliana 来自芝加哥大学Jean Greenberg教授实验室的Columbia生态型种子无产品编号
碳直流等离子体增强化学气相沉积设备橡树岭国家实验室 定制设备
Cobham Green生菜 来自加州大学戴维斯分校Richard Michelmore教授实验室的种子无产品编号奶油生菜
荧光素染料Sigma AldrichF2456-2.5G
凝胶盒 Gel-Pak AD-23C-00-X4
Heidelberg DWL 66 直写光刻设备 HeidelbergDWL 66
ImageJ美国国立卫生研究院 无产品编号
ORNL洁净室中使用的异丙醇（IPA）Doe and IngallsCMOS Grade 9079-05
JEOL 9300FS 100kV电子束光刻系统JEOL8100
Kimwipes擦拭纸KimtechKimberly-Clark Professional 34120
Kord-Valmark一次性聚苯乙烯培养皿VWR11019-554
Layout Editor  juspertor GmbH无产品编号 
LSM 710共聚焦显微镜Zeiss无产品编号
LSM 800共聚焦显微镜Zeiss无产品编号
化妆用涂抹棒 AmazonG2PLUS500支装一次性微型涂抹刷，适用于化妆和个人护理（刷头直径：1.5 mm）- 5 x 100支
Merlin场发射扫描电子显微镜ZeissMerlin
MIBK/IPA （甲基异丁基酮/异丙醇）（1:3）MicrochemM089025
洋葱杂货店无产品编号
Oxford FlexAl原子层沉积设备OxfordFlexAl
PMMA 495 A4MicrochemM130004
PMMA 950 A4MicrochemM230004可稀释至A2
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）AmazonKS-6304-21-11D型透明PET（聚酯）片材，厚度0.0005"，宽度27"，长度10英尺，1片
精密镊子Aven Inc. 18032TT
pUBQ10:YFP-GW拟南芥生物资源中心CD3-1948
硅刻蚀机（用于去残胶） OxfordPlasmalab
硅橡胶套件Smooth-On IncEcoflex 00-20
硅晶圆Pure Wafer4N0.001-.005SSP-INV
旋涂仪Brewer SciencesModel 100CB
SPR 955cm 0.7 Megaposit10018314
草莓杂货店无产品编号
SU-8 2015MicrochemSU-8 2000系列有毒。操作时需小心。处理SU-8 2000系列光刻胶时应佩戴化学护目镜、化学手套和适当的防护服。避免接触眼睛、皮肤或衣物。
SU-8显影液MicrochemSU-8 2000系列操作时需小心。处理SU-8 2000系列光刻胶时应佩戴化学护目镜、化学手套和适当的防护服。避免接触眼睛、皮肤或衣物。
Suss MicroTec接触式光刻对准仪Suss MicroTecMA6/BA6
台式显微镜Phenom XL用于金属沉积后检查镍催化剂
Thermionics VE-240电子束蒸发仪ThermionicsVE-240

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