探究红景天苷抑制MCF-7细胞增殖与迁移的药理作用及分子机制

摘要

本实验方案描述了一种全面的策略，用于评估红景天苷在抑制MCF-7细胞增殖和迁移方面的药理作用及其作用机制。

摘要

红景天苷（Sal）具有抗癌、抗缺氧和抗炎的药理活性。然而，其抗乳腺癌的作用机制尚未完全阐明。因此，本实验旨在解析Sal在调控人乳腺癌MCF-7细胞恶性增殖过程中PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路的潜在作用。首先，通过CCK-8和细胞划痕实验评估Sal对MCF-7细胞的药理活性。此外，采用迁移和Matrigel侵袭实验检测MCF-7细胞的抵抗能力。对于细胞凋亡和细胞周期实验，分别使用annexin V-FITC/PI和细胞周期染色检测试剂盒对MCF-7细胞进行处理，并进行流式细胞术分析。通过DCFH-DA和Fluo-4 AM免疫荧光染色检测活性氧（ROS）和Ca²⁺水平。使用相应的商用试剂盒测定Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶的活性。进一步通过Western blot和qRT-PCR分析分别检测凋亡相关以及PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路中蛋白和基因的表达水平。研究发现，Sal处理以剂量依赖的方式显著抑制MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力。同时，Sal处理也显著诱导MCF-7细胞发生凋亡和细胞周期阻滞。免疫荧光实验显示，Sal明显促进MCF-7细胞中ROS和Ca²⁺的生成。进一步数据证实，Sal可上调促凋亡蛋白Bax、Bim、cleaved caspase-9/7/3及其相应基因的表达水平。与此一致的是，Sal干预显著降低Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α和FoxO1蛋白及其相应基因的表达。综上所述，Sal可作为一种潜在的植物来源化合物用于乳腺癌治疗，其可能通过抑制PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路，减少MCF-7细胞的恶性增殖、迁移和侵袭。

引言

作为最常见的癌症诊断类型和最常见的恶性肿瘤之一，最新统计数据显示，到2020年全球乳腺癌病例达230万例，占所有癌症病例的11.7%¹。乳腺癌的常见症状包括乳房压痛和刺痛感、乳房肿块和疼痛、乳头溢液、皮肤糜烂或凹陷，以及腋窝淋巴结肿大^1,2。更令人担忧的是，每年乳腺癌新发病例数量和总体发病率仍以惊人的速度持续上升，占癌症相关死亡的6.9%¹。目前，乳腺癌的干预手段仍主要依赖化疗、手术、放疗及综合治疗。尽管这些治疗方式可有效降低患者的复发率和死亡率，但长期治疗常导致多药耐药性、大面积脱发、恶心呕吐，以及严重的心理和精神负担^2,3。值得注意的是，乳腺癌存在多器官转移的潜在风险，这也促使人们寻求新型的草药药物治疗来源^4,5。

磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）介导的信号通路通过影响多个基因的剪接，在乳腺癌的生长、增殖和存活中发挥重要作用⁶。作为PI3K的下游信号感应蛋白，大量证据表明蛋白激酶B（AKT）可与雷帕霉素靶蛋白（mTOR）偶联，进一步促进乳腺癌的发展^7,8,9。此外，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路也被认为是抑制乳腺癌恶性增殖并诱导细胞凋亡的药物作用中的关键环节^10,11,12。众所周知，肿瘤微环境中严重的缺氧状态会引发缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的大量上调，从而进一步加剧乳腺癌的进展^13,14,15。同时，AKT的激活也会导致HIF-1α过度积累，限制乳腺癌样本中的细胞凋亡^16,17。有趣的是，PI3K-AKT-HIF-1α信号通路的激活已被证实参与多种癌症的病理进展和转移过程，包括肺癌¹⁸、结直肠癌¹⁹、卵巢癌²⁰和前列腺癌²¹。除了受HIF-1α调控外，叉头框转录因子1（FoxO1）的过表达也由AKT信号激活所触发，从而促进乳腺癌细胞周期阻滞并抑制细胞凋亡^22,23。综上所述，这些坚实的证据提示，抑制PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1信号级联通路可能成为乳腺癌药物治疗的一个潜在新靶点。

红景天苷（Sal）已被广泛证实具有抗癌作用^24,25，抗缺氧^26,27,28,29以及免疫增强的药理活性³⁰它是一种浅棕色或棕色粉末，易溶于水，属于苯乙醇苷类化合物，化学分子式为C₁₄H₂₀O₇ 分子量为300.3^31,32现代药理学研究表明，Sal可通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路促进胃癌细胞的凋亡。²⁴进一步的证据还表明，Sal处理通过抑制PI3K-AKT-HIF-1α信号通路，可能增强癌细胞对化疗药物的敏感性，从而促进癌细胞凋亡。²⁵证据还表明，Sal 能通过促进人乳腺癌 MCF-7 细胞的凋亡来抑制细胞迁移和侵袭，并导致细胞周期阻滞。^33,34然而，Sal是否能够调控PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1信号通路并抑制MCF-7细胞的恶性增殖，仍有待阐明。因此，本实验方案旨在探讨Sal对MCF-7细胞迁移、侵袭、细胞周期及凋亡的影响。 通过 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 通路。整合的研究策略包括常规、低成本且独立的实验，如细胞迁移和侵袭评估、流式细胞术检测凋亡和细胞周期、活性氧（ROS）和 Ca²⁺ 荧光测定等方法可为中药抗癌研究的实验整体设计提供参考。本研究的实验流程如图所示。 图1.

方案

本研究使用的 MCF-7 细胞购自商业来源（见材料表）。

1. 细胞培养

1. 在37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中，使用添加10% FBS和1%青霉素（10,000 U/mL）/链霉素（10,000 µg/mL）的DMEM培养MCF-7细胞（参见材料表）。
   ​注意：实验选用贴壁细胞融合度达到培养皿底部90%的细胞，并将其分为以下组别：对照组、盐酸多柔比星组（DXR，5 µM）、Sal组（20 µM、40 µM和80 µM）；或对照组、LY294002组（10 µM，PI3K抑制剂）、Sal组（80 µM）以及LY294002（10 µM）+ Sal（80 µM）组（参见材料表）。

2. 细胞活力检测

注意：有关此实验步骤的详细信息，请参见先前的报告²⁷。

1. 以每孔 8 × 10⁴ 个细胞的密度将 MCF-7 细胞接种于 96 孔板中，并加入 Sal（10 µM、20 µM、40 µM、80 µM、160 µM 和 320 µM）处理 24 小时，或加入 Sal（20、40、80 µM）处理 12 小时/24 小时/36 小时/48 小时，过夜培养至细胞贴壁。
2. 处理结束后，每孔加入 10 µL CCK-8 溶液（见材料表），共同孵育 2 小时。随后使用全自动酶标仪在 450 nm 处测定吸光度（OD₄₅₀）。

3. 细胞迁移与侵袭

注意：有关本实验步骤的详细信息，请参阅先前的报告³⁵。

1. 将浓度为 5 × 10⁶ 个细胞/mL 的细胞以 2 mL 接种于 6 孔板中，孵育至细胞覆盖孔底约 90%。
2. 使用无菌移液枪头沿细胞单层中央划出直线划痕，并在 0 h、24 h 和 48 h 使用光学显微镜采集图像。
3. 使用 Image J 软件测量划痕伤口的宽度。
4. 进行 transwell 实验时，将 MCF-7 细胞重悬于无血清培养基中，接种于预先包被或未包被 Matrigel 的 transwell 上室（见材料表）。
5. 在 transwell 下室中加入 DMEM 完全培养基作为化学趋化诱导剂。孵育 24 h 后，移除上室中的细胞，用甲醇固定下室中迁移和侵袭的细胞³⁵。
6. 用结晶紫溶液对 MCF-7 细胞染色（见材料表），并使用光学显微镜拍摄图像。

4. Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性的评估

1. 按照制造商说明（参见材料表），使用二辛可宁酸（BCA）试剂盒测定裂解后的 MCF-7 细胞中蛋白质浓度。
   1. 将各组裂解细胞样品加入相应的 96 孔板中。然后加入工作液，在 37 °C 下进一步孵育 5 分钟。最后，使用多功能酶标仪测定 OD₆₃₆ 的数值。

5. 细胞凋亡与细胞周期的流式细胞术分析

注意：有关本实验步骤的详细信息，请参阅先前的报告³¹。

1. 消化细胞，收集后重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶（PI）染色30分钟（参见材料表），然后使用流式细胞仪检测凋亡细胞数量。
2. 将重悬的样品溶液与PI溶液混合，孵育30分钟，随后用流式细胞仪进行检测。

6. DCFH-DA 和 Fluo-4 AM 荧光染色

注意：有关本实验步骤的详细信息，请参见先前的报告²⁹。

1. 将MCF-7细胞与10 µM的DCFH-DA荧光探针（参见材料表）在37 °C下孵育20分钟。用PBS洗涤三次以彻底去除多余的DCFH-DA后，使用荧光显微镜在激发波长488 nm和发射波长525 nm下检测荧光强度。
2. 将MCF-7细胞与5 µM的Fluo-4 AM荧光探针溶液（参见材料表）在37 °C下孵育45分钟。用PBS洗涤三次后，使用荧光显微镜在激发波长488 nm和发射波长516 nm下测定荧光强度值。

7. 蛋白质印迹（Western blot）

1. 将含有不同药物的 2 mL 细胞悬液（浓度为 5 × 10⁶ 个细胞/mL）加入 6 孔板中，在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中培养 24 小时。
   注意：用于蛋白印迹分析的实验分组设置如下：对照组、LY294002（10 µM）组、Sal（80 µM）组，以及 LY294002（10 µM）+ Sal（80 µM）组（参见材料表）。
2. 收集细胞和上清液，在 4 °C 条件下以 560 × g 离心 3 分钟。弃去上清液，用预冷的 PBS 洗涤两次。每次洗涤后均在 4 °C 条件下以 560 × g 离心 3 分钟。
3. 向第 7.2 步的细胞样品中加入 50 µL 裂解缓冲液，冰浴 15 分钟。在 4 °C 条件下以 8550 × g 离心 10 分钟，收集上清中的蛋白样品。
4. 采用 BCA 法检测蛋白浓度后，按 4:1 的比例将第 7.3 步获得的蛋白样品与上样缓冲液混合，在金属浴中 100 °C 变性 10 分钟，随后冷却至室温。
5. 取第 7.4 步的 20 µg 蛋白样品，使用 10% SDS-PAGE（参见材料表）分离不同分子量的蛋白质³⁵，然后转移至 0.22 µm PVDF 膜。用 5% BSA 封闭后，在 4 °C 条件下与相应的一抗抗体孵育过夜。
   注意：以下一抗抗体的稀释浓度均为 1:1,000：cleaved caspase-9/7/3（CC-9/7/3）、Bim、Bax、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α、FoxO1 和 β-actin（参见材料表）。
6. 次日，在 37 °C 条件下用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗孵育膜 2 小时。使用 ECL 化学发光液显影，并采用非接触式定量蛋白印迹成像系统采集图像（参见材料表）。

8. qRT-PCR

1. 以 560 × g 离心收集 MCF-7 细胞 g 4 ℃下 °C，持续3分钟，然后加入500 µ将缓冲液RL1加入5 × 10⁶ 细胞。用移液器反复吹打并混匀，直至肉眼不可见细胞团块。
   注意：缓冲液RL1是总RNA提取试剂盒中的组分之一（参见 材料表).
2. 将第8.1步中的细胞匀浆转移至置于收集管中的DNA纯化柱中，于8,550 ×g离心 × g 在4 °C下2分钟。取出DNA纯化柱，保留收集管中的上清液。
   注意：DNA 清除柱和收集管是总 RNA 提取试剂盒中的两个组分（参见 材料表).
3. 加入800 µL buffer RL2 至 500 µ取步骤8.2中的上清液L，并轻轻混匀。
   注意：缓冲液RL2是总RNA提取试剂盒中的组分之一（参见 材料表使用前，将120 mL无水乙醇加入60 mL RL2缓冲液中。
4. 转移 700 µ将步骤8.3中所得混合液的L加入嵌入收集管中的RNA专用柱，于8,550 × g离心 × g 在4℃下 °C下1分钟。弃去收集管中的废液。
   注意：RNA专用柱是总RNA提取试剂盒中的一个组分（参见 材料表).
5. 重复步骤 8.4，处理步骤 8.3 中剩余的混合物。
6. 加入500 µ缓冲液RW1的L加入RNA专用柱中，8,550 ×g离心 × g 在4 °C 下 1 分钟。弃去收集管中的废液。
   注意：缓冲液RW1是总RNA提取试剂盒中的组分之一（参见 材料表).
7. 加入700 µL 缓冲液 RW2 加入 RNA 专用柱中，8,550 × g 离心 × g 在 4 ◦1分钟。弃去收集管中的废液。重复步骤8.7一次。
   注意：缓冲液 RW2 是总 RNA 提取试剂盒中的组分之一（参见 材料表).
8. 将仅含RNA的柱子放回收集管中，在8550 × g条件下离心 × g 在 4 °C离心2分钟，以去除残留的RW2缓冲液。
9. 将仅含RNA的洗脱液转移至新的收集管中，并滴加100 µ无RNase的ddH₂O₂65℃预热 °将 C 加入膜中央的仅 RNA 柱中，置于 25 °C下2分钟，通过8,550 × g离心收集RNA溶液 × g 在 4 °1 分钟，温度为 C。
   注意：使用无RNase的ddH₂O₂O 是总 RNA 提取试剂盒中的组分之一（参见 材料清单).
10. 加入4 µ5×反应缓冲液 L，1 µoligo (dT) L₁₈ 引物，1 µ随机六聚体引物 L，1 µL 基因特异性引物（见表1），1 µL 酶混合液和 5 µ步骤8.9中RNA溶液的g加入100 µL 8孔排管。用无RNase水将反应体系补至20 µL.
11. 将系统的反应条件设置如下：（1）：95 °℃，30 秒，1 个循环；（2）：95 °C，5 秒，50 个循环，60 °摄氏34度，34秒；（3）：95 °C，5 秒，1 个循环，65 °摄氏度，60 秒，97 °摄氏度，1 秒；以及（4）：42 °C，30 秒，1 个循环。执行 qRT-PCR 程序。
    注意：通过2^−ΔΔCT 方法^36,37用于qRT-PCR分析的各基因引物信息见表1。

9. 统计学分析

1. 以三次独立实验的均值 ± 标准差表示数据。
2. 使用图形与分析软件（见材料表）进行单因素方差分析（ANOVA），随后采用Tukey检验对多组间差异进行分析。本研究中，P < 0.05 被定义为具有统计学显著性。

结果

Sal抑制MCF-7细胞过度增殖并延缓伤口愈合的作用
为了探究Sal在乳腺癌治疗中的潜在作用，我们首先利用人乳腺癌MCF-7细胞系，通过细胞增殖毒性实验和划痕实验检测其抗癌特性。将MCF-7细胞与一系列浓度的Sal（5–320 µM）共孵育24小时，采用CCK-8法评估细胞增殖情况。结果显示Sal对细胞增殖具有剂量依赖性抑制作用，在40 µM时细胞活力下降50%（图2A）。随后选择20 µM、40 µM和80 µM的Sal浓度进行后续不同时间点的处理及伤口愈合评估。如图2B所示，Sal可随时间推移抑制MCF-7细胞的活力，在共孵育24小时后，MCF-7细胞活力下降50%。图2C–R显示了通过划痕实验测定的Sal处理对MCF-7细胞伤口愈合的抑制作用。进一步的细胞划痕实验也证实，与Sal（20 µM、40 µM和80 µM）共培养24小时显著阻碍了伤口愈合进程（

讨论

乳腺癌影响着各个年龄段的人群，造成无法估量的身心负担和巨大的经济压力¹。乳腺癌每年发病率和死亡率不断上升，促使全球广泛关注在传统治疗之外寻找有效的基于草药的化合物疗法^4,5。令人鼓舞的是，大量证据已揭示了Sal的抗癌作用^24,25,38。然而，Sal在乳腺癌中的作用及其潜在的分子机制仍 largely 未知。本研究强调了Sal对人乳腺癌MCF-7细胞系增殖、迁移和侵袭的显著抑制作用。随后，我们揭示了Sal诱导MCF-7细胞凋亡和细胞周期阻滞的潜力。同时，这些数据还显示，Sal处理增加了细胞内ROS和Ca²⁺的水平。进一步对分子机制的探索表明，Sal在乳腺癌治疗中具有促进凋亡的作用，并影响PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1信号通路。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% 青霉素/链霉素	HyClone	SV30010
AKT 抗体	ImmunoWay Biotechnology Company	YT0185
Annexin V-FITC/PI 检测试剂盒	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	AP101
全自动酶标仪	Molecular Devices	SpectraMax iD5
Bax 抗体	Cell Signaling Technology, Inc.	#5023
BCA 蛋白定量试剂盒	Biosharp Life Sciences	BL521A
Bcl-2 抗体	Cell Signaling Technology, Inc.	#15071
Bim 抗体	Cell Signaling Technology, Inc.	#2933
Ca2+–ATP酶活性检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A070-4-2
细胞计数试剂盒-8	Biosharp Life Sciences	BS350B
细胞周期染色试剂盒	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	CCS012
cleaved caspase-3	Cell Signaling Technology, Inc.	#9661
cleaved caspase-7	Cell Signaling Technology, Inc.	#8438
cleaved caspase-9	Cell Signaling Technology, Inc.	#20750
结晶紫溶液	碧云天生物技术	C0121
DMEM 高糖培养基	Servicebio Technology Co., Ltd.	G4510
盐酸多柔比星	MedChemExpress	HY-15142
ECL 化学发光液	Biosharp Life Sciences	BL520B
胎牛血清	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	164210
流式细胞仪	BD	FACSCanto
Fluo-4 AM	碧云天生物技术	S1060
FoxO1 抗体	ImmunoWay Biotechnology Company	YT1758
山羊抗兔 IgG 二抗	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	70-GAR0072
GraphPad Prism 软件	La Jolla	版本 6.0
HIF-1α 抗体	Affinity Biosciences	BF8002
人乳腺癌细胞系 MCF-7	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	CL-0149
上样缓冲液	Biosharp Life Sciences	BL502B
LY294002	MedChemExpress	HY-10108
Matrigel	Thermo	356234
mTOR 抗体	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11405
Na+–K+–ATP酶活性检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A070-2-2
光学显微镜	Olympus	IX71PH
p-AKT 抗体	ImmunoWay Biotechnology Company	YP0006
PI3K 抗体	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11525
p-PI3K 抗体	Affinity Biosciences	AF3241
定量 Western 印迹成像系统	Touch Image Pro	eBlot
逆转录第一链 cDNA 合成试剂盒	Servicebio Technology Co., Ltd.	G3330-100
活性氧检测试剂盒	碧云天生物技术	S0033S	包含 DCFH-DA 荧光探针
红景天苷	成都赫柏睿生物有限公司	H-040
SDS-PAGE 试剂盒	Servicebio Technology Co., Ltd.	G2003-50T
总 RNA 提取试剂盒	Foregene	RE-03014
胰蛋白酶	HyClone	SH30042.01
β-actin	Affinity Biosciences	AF7018