方法文章

探究红景天苷抑制MCF-7细胞增殖与迁移的药理作用及分子机制

DOI：

10.3791/65634

⸱

2023年6月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pathology Department, Suining Central Hospital, 2General Surgery Day Ward, Department of General Surgery, the Third People's Hospital of Chengdu & the Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本实验方案描述了一种全面的策略，用于评估红景天苷在抑制MCF-7细胞增殖和迁移方面的药理作用及其作用机制。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

红景天苷（Sal）具有抗癌、抗缺氧和抗炎的药理活性。然而，其抗乳腺癌的作用机制尚未完全阐明。因此，本实验旨在解析Sal在调控人乳腺癌MCF-7细胞恶性增殖过程中PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路的潜在作用。首先，通过CCK-8和细胞划痕实验评估Sal对MCF-7细胞的药理活性。此外，采用迁移和Matrigel侵袭实验检测MCF-7细胞的抵抗能力。对于细胞凋亡和细胞周期实验，分别使用annexin V-FITC/PI和细胞周期染色检测试剂盒对MCF-7细胞进行处理，并进行流式细胞术分析。通过DCFH-DA和Fluo-4 AM免疫荧光染色检测活性氧（ROS）和Ca2+水平。使用相应的商用试剂盒测定Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性。进一步通过Western blot和qRT-PCR分析分别检测凋亡相关以及PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路中蛋白和基因的表达水平。研究发现，Sal处理以剂量依赖的方式显著抑制MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力。同时，Sal处理也显著诱导MCF-7细胞发生凋亡和细胞周期阻滞。免疫荧光实验显示，Sal明显促进MCF-7细胞中ROS和Ca2+的生成。进一步数据证实，Sal可上调促凋亡蛋白Bax、Bim、cleaved caspase-9/7/3及其相应基因的表达水平。与此一致的是，Sal干预显著降低Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α和FoxO1蛋白及其相应基因的表达。综上所述，Sal可作为一种潜在的植物来源化合物用于乳腺癌治疗，其可能通过抑制PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路，减少MCF-7细胞的恶性增殖、迁移和侵袭。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作为最常见的癌症诊断类型和最常见的恶性肿瘤之一，最新统计数据显示，到2020年全球乳腺癌病例达230万例，占所有癌症病例的11.7%1。乳腺癌的常见症状包括乳房压痛和刺痛感、乳房肿块和疼痛、乳头溢液、皮肤糜烂或凹陷，以及腋窝淋巴结肿大1,2。更令人担忧的是，每年乳腺癌新发病例数量和总体发病率仍以惊人的速度持续上升，占癌症相关死亡的6.9%1。目前，乳腺癌的干预手段仍主要依赖化疗、手术、放疗及综合治疗。尽管这些治疗方式可有效降低患者的复发率和死亡率，但长期治疗常导致多药耐药性、大面积脱发、恶心呕吐，以及严重的心理和精神负担2,3。值得注意的是，乳腺癌存在多器官转移的潜在风险，这也促使人们寻求新型的草药药物治疗来源4,5。

磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）介导的信号通路通过影响多个基因的剪接，在乳腺癌的生长、增殖和存活中发挥重要作用6。作为PI3K的下游信号感应蛋白，大量证据表明蛋白激酶B（AK....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The MCF-7 cells used for the present study were obtained from a commercial source (see the Table of Materials).

1. Cell culture

  1. Culture the MCF-7 cells in a humidified 5% CO2 atmosphere at 37 °C with DMEM containing 10% FBS and 1% penicillin (10,000 U/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) (see the Table of Materials).
    ​NOTE: The cells covering 90% of the bottom of the dish were employed for the experiment and assigned into the following groups: control group, doxorubicin hydrochloride group (DXR, 5 µM), and Sal groups (20 µM, 40 µM, and....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sal抑制MCF-7细胞过度增殖并延缓伤口愈合的作用
为了探究Sal在乳腺癌治疗中的潜在作用，我们首先利用人乳腺癌MCF-7细胞系，通过细胞增殖毒性实验和划痕实验检测其抗癌特性。将MCF-7细胞与一系列浓度的Sal（5–320 µM）共孵育24小时，采用CCK-8法评估细胞增殖情况。结果显示Sal对细胞增殖具有剂量依赖性抑制作用，在40 µM时细胞活力下降50%（图2A）。随后选择20 µM、40 µM和80 µM的Sal浓度进行后续不同时间点的处理及伤口愈合评估。如图2B所示，Sal可随时间推移抑制MCF-7细胞的活力，在共孵育24小时后，MCF-7细胞活力下降50%。图2C–R显示了通过划痕实验测定的Sal处理对MCF-7细胞伤口愈合的抑制作用。进一步的细胞划痕实验也证实，与Sal（20 µM、40 µM和80 µM）共培养24小时显著阻碍了伤口愈合进程（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

乳腺癌影响着各个年龄段的人群，造成无法估量的身心负担和巨大的经济压力1。乳腺癌每年发病率和死亡率不断上升，促使全球广泛关注在传统治疗之外寻找有效的基于草药的化合物疗法4,5。令人鼓舞的是，大量证据已揭示了Sal的抗癌作用24,25,38。然而，Sal在乳腺癌中的作用及其潜在的分子机制仍 largely 未知。本研究强调了Sal对人乳腺癌MCF-7细胞系增殖、迁移和侵袭的显著抑制作用。随后，我们揭示了Sal诱导MCF-7细胞凋亡和细胞周期阻滞的潜力。同时，这些数据还显示，Sal处理增加了细胞内ROS和Ca2+的水平。进一步对分子机制的探索表明，Sal在乳腺癌治疗中具有促进凋亡的作用，并影响PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1信号通路。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到四川省卫生健康委员会（120025）的资助。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1% 青霉素/链霉素HyCloneSV30010
AKT 抗体ImmunoWay Biotechnology CompanyYT0185
Annexin V-FITC/PI 检测试剂盒MultiSciences Biotech Co., Ltd.AP101
全自动酶标仪Molecular DevicesSpectraMax iD5
Bax 抗体Cell Signaling Technology, Inc.#5023
BCA 蛋白定量试剂盒Biosharp Life SciencesBL521A
Bcl-2 抗体Cell Signaling Technology, Inc.#15071
Bim 抗体Cell Signaling Technology, Inc.#2933
Ca2+–ATP酶活性检测试剂盒南京建成生物工程研究所A070-4-2
细胞计数试剂盒-8Biosharp Life SciencesBS350B
细胞周期染色试剂盒MultiSciences Biotech Co., Ltd.CCS012
cleaved caspase-3Cell Signaling Technology, Inc.#9661
cleaved caspase-7Cell Signaling Technology, Inc.#8438
cleaved caspase-9Cell Signaling Technology, Inc.#20750
结晶紫溶液碧云天生物技术C0121
DMEM 高糖培养基Servicebio Technology Co., Ltd.G4510
盐酸多柔比星MedChemExpressHY-15142
ECL 化学发光液Biosharp Life SciencesBL520B
胎牛血清Procell Life Science & Technology Co., Ltd.164210
流式细胞仪BDFACSCanto figure-materials-1
Fluo-4 AM碧云天生物技术S1060
FoxO1 抗体ImmunoWay Biotechnology CompanyYT1758
山羊抗兔 IgG 二抗MultiSciences Biotech Co., Ltd.70-GAR0072
GraphPad Prism 软件La Jolla版本 6.0
HIF-1α 抗体Affinity BiosciencesBF8002
人乳腺癌细胞系 MCF-7Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0149
上样缓冲液Biosharp Life SciencesBL502B
LY294002MedChemExpressHY-10108
MatrigelThermo 356234
mTOR 抗体Servicebio Technology Co., Ltd.GB11405
Na+–K+–ATP酶活性检测试剂盒南京建成生物工程研究所A070-2-2
光学显微镜OlympusIX71PH
p-AKT 抗体ImmunoWay Biotechnology CompanyYP0006
PI3K 抗体Servicebio Technology Co., Ltd.GB11525
p-PI3K 抗体Affinity BiosciencesAF3241
定量 Western 印迹成像系统Touch Image ProeBlot
逆转录第一链 cDNA 合成试剂盒Servicebio Technology Co., Ltd.G3330-100
活性氧检测试剂盒碧云天生物技术S0033S包含 DCFH-DA 荧光探针
红景天苷成都赫柏睿生物有限公司H-040
SDS-PAGE 试剂盒Servicebio Technology Co., Ltd.G2003-50T
总 RNA 提取试剂盒ForegeneRE-03014
胰蛋白酶HyCloneSH30042.01
β-actinAffinity BiosciencesAF7018

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Franzoi, M. A., et al.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

MCF 7 PI3K AKT PCR

相关文章