我们已开发出多种在Xenopus laevis蝌蚪中诱导视网膜损伤或视网膜变性的实验方案。这些模型为研究视网膜再生机制提供了可能。
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本文内容
摘要
摘要
视网膜神经退行性疾病是导致失明的主要原因。在众多正在探索的治疗策略中，激活自我修复机制近年来尤为引人关注。在视网膜修复的细胞来源中，穆勒胶质细胞（Müller glial cell）备受重视，因其在无羊膜动物中具有干细胞潜能和极强的再生能力。然而，这种潜能在哺乳动物中极为有限。研究具有再生能力的动物模型中视网膜再生的分子机制，有助于揭示如何激活哺乳动物穆勒胶质细胞中潜在的视网膜再生能力。这是再生医学领域发展治疗策略的关键步骤。为此，我们建立了多种视网膜损伤模型 非洲爪蟾：一种机械性视网膜损伤，一种可实现硝基还原酶介导的光感受器条件性消融的转基因品系，一种基于CRISPR/Cas9介导的视网膜色素变性模型 视紫红质 敲除，以及由眼内CoCl驱动的细胞毒性模型2 注射。本文重点介绍这一系列可诱导多种退行性病变并用于研究视网膜再生的实验方案，同时阐述其优势与局限性。 非洲爪蟾.
引言
全球数百万人患有各种导致失明的视网膜退行性疾病，例如视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变或年龄相关性黄斑变性（AMD）。迄今为止，这些疾病在很大程度上仍无法治愈。目前正在评估的治疗方法包括基因治疗、细胞或组织移植、神经保护治疗、光遗传学以及假体装置。另一种新兴策略是通过激活具有干细胞潜能的内源性细胞来实现自我再生。在此背景下，穆勒胶质细胞——视网膜主要的胶质细胞类型——成为备受关注的细胞来源之一。在损伤发生后，它们能够去分化、增殖并生成神经元1,2,3。尽管这一过程在斑马鱼或Xenopus中非常有效，但在哺乳动物中却效率极低。
尽管如此，已有研究表明，使用适当的有丝分裂原蛋白处理或过表达多种因子可诱导哺乳动物穆勒胶质细胞重新进入细胞周期，并在某些情况下进一步触发其后续的增殖与分化 神经发生承诺1,2,3,4,5然而，这在治疗应用上仍然远远不足。....
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方案
动物饲养和实验操作均按照机构指南进行，并在机构许可证 A91272108 下实施。研究方案已获机构动物护理委员会 CEEA #59 批准，并获得法国省级动物保护部门 Direction Départementale de la Protection des Populations 的授权，授权编号分别为 APAFIS #32589-2021072719047904 v4 和 APAFIS #21474-2019071210549691 v2。有关本方案中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息，请参见材料表。
1. 机械性视网膜损伤
注意：此处描述的损伤范式方案包括对 45 期及以后阶段的蝌蚪进行机械性视网膜穿刺。因此，该方法并不针对任何特定类型的视网膜细胞，而是在穿刺部位损伤整个视网膜厚度。
- 蝌蚪麻醉剂的制备
- 配制10%的苯佐卡因储备液。取1 g苯佐卡因，加入2 mL二甲基亚砜（DMSO）和8 mL丙二醇，定容至10 mL。将储备液用铝箔避光，于4 °C保存数月。
- 使用时，取25 µL 10%苯佐卡因储备液加入50 mL蝌蚪饲养水（过滤并除氯的自来水）中，配制成0.005%的苯佐卡因溶液，充分混匀。
注意：苯佐卡因浓度特别低，因为蝌蚪对麻醉剂的敏感性远高于成体。 ....
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结果
机械性视网膜损伤
经受协议第1部分所述机械性损伤的蝌蚪视网膜切片显示，视网膜损伤累及组织的所有层，但局限在穿刺部位（图 2A、B）。
利用 NTR-MTZ 系统进行条件性视杆细胞消融
根据方案第 2 节所述，经 MTZ 处理的麻醉状态下的 Tg(rho:GFP-NTR) 转基因蝌蚪眼球在体视显微镜下进行观察分析（图 3A、B）。与对照组相比，GFP 荧光信号的减弱表明视杆细胞被逐步特异性消融（图 3B），该结果通过视网膜切片的 GFP 免疫染色进一步确认，如方案第 5 节所述（图 3C）。
通过 CRISPR.......
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讨论
不同视网膜损伤模型的优缺点 非洲爪蟾 蝌蚪
机械性视网膜损伤
已在非洲爪蟾（Xenopus）蝌蚪中建立多种神经视网膜的手术损伤模型。神经视网膜可被完全移除15,16，也可仅部分切除16,17。本文所介绍的机械性损伤不涉及任何视网膜切除操作，而是采用我们先前在Xenopus蝌蚪中建立的一种简单的眼部穿刺方法6。由于该机械性视网膜损伤模型依赖手工操作，其表型在不同蝌蚪之间可能存在显著差异。此外，损伤的可重复性及损伤程度也可能因操作者不同而有所变化。因此，我们建议由同一人完成全部损伤操作。
利用 NTR-M.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究获得了 Retina France 协会、法国基金会、罕见病基金会（FMR）、Bardet-Biedl 综合征协会（BBS）以及盲人与视觉障碍者国家联盟（UNADEV）向 M.P. 提供的资助，上述资助由多机构专题研究所（ITMO NNP，神经科学、认知科学、神经病学与精神病学）/生命科学与健康联盟（AVIESAN）合作支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,2-丙二醇（丙基）è乙二醇 | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| 无水乙醇 ≥99.8% | VWR 化学品 | 20821-365 | |
| 抗活化型半胱天冬酶3抗体（兔） | 细胞信号传导 | 9661S | 稀释比例 1/300 |
| 抗GFP抗体（鸡） | Aveslabs | GFP-1020 | 稀释比例 1/500 |
| 抗M-视蛋白抗体（兔） | Sigma-Aldrich | AB5405 | 稀释比例 1/500 |
| 抗小鼠二抗，Alexa Fluor 594（山羊） | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | 稀释比例 1/1,000 |
| 抗Otx2抗体（兔） | Abcam | Ab183951 | 稀释比例 1/100 |
| 抗兔二抗，Alexa Fluor 488（山羊） | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | 稀释比例 1/1,000 |
| 山羊抗兔二抗，Alexa Fluor 594 | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | 稀释比例 1/1,000 |
| 抗视网素抗体（兔） | Sigma-Aldrich | AB5585 | 稀释比例 1/500 |
| 抗视紫红质抗体（小鼠） | Sigma-Aldrich | MABN15 | 稀释比例 1/1,000 |
| 抗S-视蛋白抗体（兔） | Sigma-Aldrich | AB5407 | 稀释比例 1/500 |
| 细胞凋亡检测试剂盒（Dead End 荧光素 TUNEL 系统） | Promega | G3250 | |
| 苯佐卡因 | Sigma-Aldrich | E1501 | 10% 储备液 |
| bisBenzimide H 33258（Hoechst） | Sigma-Aldrich | B2883 | 储存液 10 mg/mL |
| 正丁醇 ≥99.5% | VWR 化学品 | 20810.298 | |
| 二水合氯化钙（CaCl₂）2，2H2O | Sigma-Aldrich（Supelco） | 1.02382 | 以 0.1 M 使用 |
| Cas9（EnGen Spy Cas9 NLS） | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark 毛细玻璃管型号 GC100TF-10 | 华纳仪器公司（哈佛仪器公司） | 30-0038 | |
| 六水合氯化钴(II)（CoCl2，6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | 100 mM 储存液 |
| 盖玻片 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL 抗体稀释液 | 安捷伦 | S202230-2 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 电子旋转切片机 | 赛默飞世尔科技 | Microm HM 340E | |
| 1% 水溶性伊红 | RAL 诊断 | 312740 | |
| 荧光素赖氨酸葡聚糖 | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| 荧光体视显微镜 | Olympus | SZX 200 | |
| 庆大霉素 | Euromedex | EU0410-B | |
| 甘油明胶（Mallory 法） | Diapath | E0012 | 以3%的比例溶于水中使用 |
| 苏木精（Mayer's Hemalun） | RAL 诊断 | 320550 | |
| HEPES 钾盐 | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| 人绒毛膜促性腺激素激素 | MSD动物健康 | Chorulon 1500 | |
| 盐酸烟雾，37%（HCl） | Sigma-Aldrich（SAFC） | 1.00314 | |
| L-半胱氨酸盐酸盐一水合物 | Sigma-Aldrich | C7880 | 在0.1x MBS（pH 7.8 - 8.0）中以2%浓度使用 |
| 七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）4，7H2O | Sigma-Aldrich（Supelco） | 1.05886 | |
| 甲硝唑 | Sigma-Aldrich（Supelco） | M3761 | 使用浓度为 10 mM |
| 显微操作加样头 | Eppendorf | 5242956003 | |
| 微移液管拉制仪（P-97 Flaming/Brown） | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | 程序：加热 700 / 拉制 100 / 速度 75 / 时间 90 / 解锁 p = 500 |
| 用于保存荧光的封片介质，FluorSave 试剂 | Millipore | 345789 | |
| 封片剂，Eukitt | 化学实验室 | CL04.0503.0500 | |
| MX35 超薄切片机刀片 | Epredia | 3053835 | |
| 25 G × 5/8″ 针头 | 泰尔茂 | AN*2516R1 | |
| 镀镍针夹 | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| 尼龙过滤织物（筛分织物）NITEX，孔径 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| 不含DMSO的石蜡组织包埋蜡 | Histolab | 00403 | |
| 32% 多聚甲醛溶液 | 电子显微镜科学公司 | EM-15714-S | 在 pH 7.4 的 1×PBS 中使用，浓度为 4% |
| Peel-A-Way 一次性包埋模具 | Epredia | 2219 | |
| 研钵杵 | VWR | 431-0094 | |
| 培养皿 100 mm | 康宁高赛尔 | SB93-101 | |
| 55 mm 培养皿 | 康宁高赛尔 | BP53-06 | |
| 10倍磷酸盐缓冲液（PBS） | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer 微注射系统 | Parker 仪器产品 | PicoSpritzer III | |
| 针 | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| 聚蔗糖（Ficoll PM 400） | Sigma-Aldrich | F4375 | 在0.1x MBS中以3%使用 |
| 氯化钾（KCl） | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| 微粒鱼苗饲料：sera Micron Nature | 血清 | 45475 (00720) | |
| 剪刀解剖 | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Superfrost 载玻片 | KNITTEL 玻璃 | VS11171076FKA | |
| 载玻片加热板 | 孔兹仪器 | HP-3 | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| 柠檬酸钠三钠盐二水合物（C6H5Na3O7，2H2O | VWR 化学品 | 27833.294 | |
| 碳酸氢钠（NaHCO₃）3) | Sigma-Aldrich（Supelco） | 1.06329 | |
| 30% 氢氧化钠水溶液 (NaOH) | VWR 化学品 | 28217-292 | |
| 体视显微镜 | Zeiss | Stemi 2000 | |
| 注射器 Omnifix-F Solo 一次性注射器 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| 反式激活crRNA（tracrRNA） | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC 荧光光源 | X-Cite | 200DC | |
| 二甲苯 ≥98.5% | VWR 化学品 | 28975-325 |
参考文献
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of t....
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