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方法文章

构建视网膜损伤模型 非洲爪蟾 蝌蚪

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DOI：

10.3791/65771

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2023年10月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Paris-Saclay Institute of Neuroscience, CNRS, Université Paris-Saclay

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们已开发出多种在Xenopus laevis蝌蚪中诱导视网膜损伤或视网膜变性的实验方案。这些模型为研究视网膜再生机制提供了可能。

摘要

视网膜神经退行性疾病是导致失明的主要原因。在众多正在探索的治疗策略中，激活自我修复机制近年来尤为引人关注。在视网膜修复的细胞来源中，穆勒胶质细胞（Müller glial cell）备受重视，因其在无羊膜动物中具有干细胞潜能和极强的再生能力。然而，这种潜能在哺乳动物中极为有限。研究具有再生能力的动物模型中视网膜再生的分子机制，有助于揭示如何激活哺乳动物穆勒胶质细胞中潜在的视网膜再生能力。这是再生医学领域发展治疗策略的关键步骤。为此，我们建立了多种视网膜损伤模型 非洲爪蟾：一种机械性视网膜损伤，一种可实现硝基还原酶介导的光感受器条件性消融的转基因品系，一种基于CRISPR/Cas9介导的视网膜色素变性模型 视紫红质 敲除，以及由眼内CoCl驱动的细胞毒性模型2 注射。本文重点介绍这一系列可诱导多种退行性病变并用于研究视网膜再生的实验方案，同时阐述其优势与局限性。 非洲爪蟾.

引言

全球数百万人患有各种导致失明的视网膜退行性疾病，例如视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变或年龄相关性黄斑变性（AMD）。迄今为止，这些疾病在很大程度上仍无法治愈。目前正在评估的治疗方法包括基因治疗、细胞或组织移植、神经保护治疗、光遗传学以及假体装置。另一种新兴策略是通过激活具有干细胞潜能的内源性细胞来实现自我再生。在此背景下，穆勒胶质细胞——视网膜主要的胶质细胞类型——成为备受关注的细胞来源之一。在损伤发生后，它们能够去分化、增殖并生成神经元1,2,3。尽管这一过程在斑马鱼或Xenopus中非常有效，但在哺乳动物中却效率极低。

尽管如此，已有研究表明，使用适当的有丝分裂原蛋白处理或过表达多种因子可诱导哺乳动物穆勒胶质细胞重新进入细胞周期，并在某些情况下进一步触发其后续的增殖与分化 神经发生承诺1,2,3,4,5然而，这在治疗应用上仍然远远不足。因此，深入理解再生过程中的分子机制十分必要，以鉴定出能够有效将穆勒细胞的干细胞样特性转化为新型细胞治疗策略的分子。

为此，我们建立了多种损伤模型 非洲爪蟾 引发视网膜细胞变性的因素。本文介绍了（1）一种非细胞类型特异性的机械性视网膜损伤模型，（2）一种利用NTR-MTZ系统靶向视杆细胞的条件性且可逆的细胞消融模型，（3）一种CRISPR/Cas9介导的 视紫红质 敲除，一种视网膜色素变性的模型，可引发进行性视杆细胞退化, 以及（4）CoCl2-诱导的细胞毒性模型，该模型可根据剂量特异性地靶向视锥细胞或导致更广泛的视网膜细胞变性。我们重点阐述了每种范式的特性、优势与局限性。

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方案

动物饲养和实验操作均按照机构指南进行，并在机构许可证 A91272108 下实施。研究方案已获机构动物护理委员会 CEEA #59 批准，并获得法国省级动物保护部门 Direction Départementale de la Protection des Populations 的授权，授权编号分别为 APAFIS #32589-2021072719047904 v4 和 APAFIS #21474-2019071210549691 v2。有关本方案中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息，请参见材料表。

1. 机械性视网膜损伤

注意：此处描述的损伤范式方案包括对 45 期及以后阶段的蝌蚪进行机械性视网膜穿刺。因此，该方法并不针对任何特定类型的视网膜细胞，而是在穿刺部位损伤整个视网膜厚度。

  1. 蝌蚪麻醉剂的制备
    1. 配制10%的苯佐卡因储备液。取1 g苯佐卡因，加入2 mL二甲基亚砜（DMSO）和8 mL丙二醇，定容至10 mL。将储备液用铝箔避光，于4 °C保存数月。
    2. 使用时，取25 µL 10%苯佐卡因储备液加入50 mL蝌蚪饲养水（过滤并除氯的自来水）中，配制成0.005%的苯佐卡因溶液，充分混匀。
      注意：苯佐卡因浓度特别低，因为蝌蚪对麻醉剂的敏感性远高于成体。
  2. 穿刺针的准备
    1. 将一根直径为0.2 mm的无菌针固定在已灭菌的针持上（图1A）。
  3. 蝌蚪麻醉
    1. 用捞网从养殖缸中捕获蝌蚪，转移至盛有0.005%苯佐卡因溶液的新养殖缸中。等待数分钟，直至蝌蚪不再对刺激（轻敲养殖缸或直接触碰）产生反应。
      注意：可同时麻醉多只蝌蚪，但在麻醉液中停留时间应少于30分钟。
  4. 视网膜穿刺
    1. 用勺子取出一只蝌蚪，小心放置于盛有湿润滤纸的小培养皿（直径55 mm）中，使蝌蚪背侧朝上，居中放置。
    2. 在体视显微镜下，从眼球背侧轻轻插入穿刺针，穿透视网膜（图1A）。若需多次穿刺，应在不同位置重复操作。完成右眼穿刺后，将培养皿旋转180°，进行左眼穿刺。
    3. 将完成穿刺的蝌蚪连同培养皿小心浸入盛有1 L饲养水的大养殖缸中。持续观察，直至蝌蚪完全苏醒。

2. 利用 NTR-MTZ 系统进行条件性视杆细胞消融

该方案旨在诱导视杆细胞的特异性消融 非洲爪蟾 Tg(rho:GFP-NTR) 转基因品系6, 位于TEFOR巴黎-萨克雷动物实验中心，该中心托管了法国 非洲爪蟾 资源中心。该化学遗传系统利用硝基还原酶（NTR）将前药甲硝唑（MTZ）转化为一种细胞毒性DNA交联剂的能力，特异性消融表达NTR的视杆细胞（图 1B）。两种详细的制备方案 Tg(rho:GFP-NTR) 或 Tg(rho:NTR) 转基因动物并诱导其发生退行性变的研究此前已有发表 7,8此处，我们简要介绍视网膜变性的诱导方法以及如何监测变性过程 体内.

  1. 甲硝唑溶液的制备
    1. 使用磁力搅拌器和磁力搅拌子，将1.67 g甲硝唑（MTZ）粉末溶解于含0.1% DMSO的1 L蝌蚪饲养水中，置于避光瓶中，现配现用，配制成10 mM MTZ溶液。
      注意：MTZ对光敏感。完全溶解可能需要长达10分钟。
  2. 通过Tg(rho:GFP-NTR)品系的自然交配获得转基因蝌蚪
    注意：由于转基因雄性属于珍贵种质资源，我们倾向于采用自然交配方式获得胚胎，以避免牺牲雄性个体，从而可重复使用。
    1. 激素处理
      1. 使用25G针头将600 I.U.人绒毛膜促性腺激素（hCG）注射至野生型Xenopus laevis雌性的背淋巴囊中；向转基因雄性个体的背淋巴囊注射100–200 I.U. hCG。若需进行视杆细胞退变的活体监测（步骤2.4），建议使用白化型Xenopus而非色素型，以便更清晰地观察所获转基因蝌蚪眼部荧光强度的变化。
        注意：Xenopus雌性可在计划排卵前1至7天预先注射50 I.U. hCG进行诱导，但此步骤为可选。
    2. 交配与卵收集
      1. 在注射hCG后立即于20 °C条件下，将一只Tg(rho:GFP-NTR)转基因雄性与一只已注射hCG的雌性共同放入养殖缸中，持续至次日。使用较大体积的水体（至少10 L），并添加小物体以供卵附着，防止成体活动损伤卵。次日当蛙类不再抱对时，移除成体并收集胚胎。
    3. 胚胎与蝌蚪的培育
      1. 根据Xenopus发育正常表对胚胎和蝌蚪进行分期9。
      2. 将胚胎置于盛有蝌蚪饲养水的养殖缸中培养。自发育第45期起，以粉末状幼体饲料喂养蝌蚪，并使用气石对水体进行充氧。根据需要每日补充水分以补偿蒸发，并每周更换全部水体。
        注意：也可选择每周两次更换50%水体。详细方案参见文献10。
    4. 转基因胚胎筛选
      1. 自发育第37/38期起，在荧光体视显微镜下通过直接观察GFP荧光筛选并挑选转基因胚胎（图1C）。
  3. 蝌蚪甲硝唑处理
    1. 将Tg(rho:GFP-NTR)转基因蝌蚪转移至含10 mM MTZ溶液的养殖缸中，于20 °C避光条件下培养1周。以在含0.1% DMSO的蝌蚪饲养水中培育的转基因同胞蝌蚪作为对照组。
    2. 在处理期间每隔一天更换一次MTZ溶液和对照组溶液。MTZ处理期间按常规方式喂养蝌蚪。
    3. 若需进行个体荧光监测（步骤2.4），自步骤2.3.1起，将每只蝌蚪分别置于含30 mL MTZ溶液或对照溶液的小容器中。
      注意：MTZ处理可在发育第45期及之后的任意时间进行。
  4. 视杆细胞退变的活体监测
    注意：视杆细胞的进行性退变可实时监测。因此，应在MTZ处理前完成步骤2.4.1至2.4.4，并在处理后定期重复进行。
    1. 参照步骤1.1和1.3，分别进行麻醉剂配制和蝌蚪麻醉操作。
    2. 用勺子小心捞取一只蝌蚪，轻柔地将其放置于湿润滤纸上的小型培养皿（直径55 mm）中。在荧光体视显微镜下观察GFP荧光（激发波长 = 488 nm，发射波长 = 509 nm），并对眼部进行拍照。荧光强度的降低反映视杆细胞的退化情况。
      注意：为进行定量比较，所有蝌蚪成像时必须保持相同的仪器设置。
    3. 将完成成像的蝌蚪连同培养皿小心浸入盛有1 L饲养水的大养殖缸中。持续观察直至蝌蚪完全苏醒。
    4. 比较经MTZ处理组与对照组蝌蚪眼部的荧光强度，以监测并评估退变过程的有效性。

3. 利用 CRISPR/Cas9 介导的视紫红质基因敲除导致视杆细胞退化

注意：本方案旨在建立一种视网膜色素变性模型 Xenopus laevis 通过使用CRISPR/Cas9介导的方法诱导特定的视杆细胞退化 视紫红质 敲除. F0 中插入-缺失（indels）的百分比提供于11 约为75%。这种由CRISPR/Cas9介导的 视紫红质 敲除也可在 Xenopus tropicalis 蝌蚪 11.

  1. 溶液与试剂的制备
    1. crRNA 与 tracrRNA 的订购
      1. 购买靶向视紫红质（rho）基因的合成 CRISPR RNA（crRNA）以及标准的反式激活 crRNA（tracrRNA）。crRNA 包含一段rho基因特异性的靶序列（GCUCUGCUAAGUAAUACUGA），以及另一段可与 tracrRNA 杂交的序列（GUUUUAGAGCUAUGCU）。
    2. crRNA:tracrRNA 双链体（rho gRNA 双链体）
      1. 用无核酸酶的双链缓冲液将 crRNA 和 tracrRNA 分别重悬至 100 µM。
      2. 通过混合 3 µL 的 100 µM rho crRNA、3 µL 的 100 µM tracrRNA 以及 94 µL 双链缓冲液来制备 gRNA 双链体。最终浓度为 36 ng/µL rho crRNA 和 67 ng/µL tracrRNA。
      3. 将寡核苷酸在 95 °C 加热 5 分钟后缓慢冷却至室温以完成退火。分装后于 -20 °C 保存。
    3. CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物（即 gRNA 双链体/Cas9 蛋白）
      1. 使用前现配rho gRNA 双链体与 Cas9 蛋白的混合物。配制 20 µL 体系时，加入 10 µL rho gRNA 双链体溶液、2 µL Cas9 蛋白（储存浓度为 5 mg/mL）、2 µL 荧光素赖氨酸葡聚糖（储存浓度为 10 mg/mL）以及 6 µL 无 RNase 水。
      2. 为形成核糖核蛋白复合物，于 37 °C 孵育 10 分钟，随后让溶液自然冷却至室温。
      3. 配制 20 µL 对照溶液时，混合 2 µL Cas9 蛋白、2 µL 荧光素赖氨酸葡聚糖以及 16 µL 无 RNase 水。
    4. 10x、1x 和 0.1x MBS 溶液的制备
      1. 通过将 11.92 g HEPES、51.43 g 氯化钠（NaCl）、0.75 g 氯化钾（KCl）、2.1 g 碳酸氢钠（NaHCO3）以及 2.46 g 七水合硫酸镁（MgSO4, 7 H2O）加入 800 mL Ⅱ型水中，配制改良巴氏生理盐水储存液（10x MBS）。用 30% 氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 7.8，再用Ⅱ型水定容至 1 L，并通过高压灭菌进行灭菌。室温保存。
      2. 将 100 mL 10x MBS 盐溶液与 7 mL 0.1 M 二水合氯化钙（CaCl2, 2H2O）用Ⅱ型水稀释至 1 L，配制 1x MBS 溶液。室温保存。
      3. 用Ⅱ型水稀释 1x MBS 溶液，制备 0.1x MBS 溶液。室温保存。
    5. 成年个体用苯佐卡因溶液
      1. 将 5 mL 10% 苯佐卡因储存液（见步骤 1.1.1）加入 1 L 蝌蚪培养水中，配制 0.05% 苯佐卡因溶液。充分混匀。
        注：该溶液可用铝箔避光后于 4 °C 保存数月。使用前需恢复至室温。
    6. L-半胱氨酸溶液
      1. 使用前，将 2 g 盐酸-L-半胱氨酸一水合物加入 100 mL 0.1x MBS 溶液中，配制去胶溶液。用 30% NaOH 调节 pH 至 7.8。
    7. 多聚蔗糖溶液
      1. 将 3 g 多聚蔗糖 加入 100 mL 0.1x MBS 溶液中，配制高密度多聚蔗糖溶液。该溶液可在 4 °C 保存数周。
  2. 体外受精与去胶
    注：爪蟾体外受精的更多细节可参见一篇专门的详细方案12。
    1. 向非洲爪蟾雌性个体注射激素以诱导排卵
      1. 在取卵前约 15 小时，向雌性个体的背侧淋巴囊注射 600 I.U. hCG，并于 18 °C 过夜饲养。
    2. 睾丸解剖
      1. 用 0.05% 苯佐卡因溶液对爪蟾雄性个体实施致死剂量麻醉（10–15 分钟）。作为辅助安乐死手段，使用锋利且坚固的剪刀在颅骨后方立即剪断脊柱。用解剖剪打开腹腔，取出睾丸，并剪除附着的脂肪和毛细血管。将每个睾丸立即置于含 1 mL 1x MBS 的冰上。
    3. 精子制备
      1. 使用微量离心管用的研杵研碎一个睾丸，并将悬液稀释于含 9 mL 1x MBS 的 15 mL 管中。向第二个睾丸管中加入 10 µg/mL 庆大霉素，于 4 °C 保存数天，用于后续受精实验。
    4. 体外受精
      1. 轻轻按摩经激素处理的雌性个体背部，将卵母细胞收集至培养皿（直径 100 mm）中。将数滴精子悬液滴加至卵母细胞上。等待 5 分钟后，用 0.1x MBS 覆盖。10 分钟后再进行去胶操作。
    5. 受精卵去胶
      1. 用去胶溶液替换 0.1x MBS 溶液，以去除受精卵的胶质层（约 5 分钟）。用 0.1x MBS 彻底冲洗胚胎 5–6 次 ，然后将其转移至盛有 0.1x MBS 的新 100 mm 培养皿中。
  3. 显微注射系统的准备
    1. 使用微电极拉制仪将玻璃毛细管尖端拉细13。
    2. 使用微量加样吸头将 2–10 µL CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物或对照溶液注入已拉细的毛细管中，并将毛细管装入显微注射仪的持针器。
    3. 在体视显微镜最高放大倍数下，用精细镊子折断毛细管尖端，并调节注射时间（约 400 ms），使每次脉冲的推出体积为 10 nL。设定推出压力约为 40 PSI。
  4. 单细胞期胚胎 显微注射 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物
    1. 将单细胞期胚胎置于涂有网格（1 mm 尼龙网）的 100 mm 培养皿中，皿内盛有 3% 多聚蔗糖溶液（图 1D）。
    2. 在体视显微镜下使用显微注射仪，向动物极的皮质区域、紧贴细胞质膜下方注射 10 nL CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物（相当于每个胚胎注射 500 pg gRNA 双链体 + 5 ng Cas9 蛋白）或对照溶液。
      注：溶液中含有的荧光素赖氨酸葡聚糖可用于后续筛选已注射的胚胎。
    3. 将注射后的胚胎转移至盛有洁净多聚蔗糖溶液的新 100 mm 培养皿中，并置于 21 °C 培养。
    4. 在第一天，定期挑选发育良好的胚胎，并在显微注射后约 5 小时将多聚蔗糖溶液更换为 0.1x MBS。
    5. 注射 24 小时后，在荧光体视显微镜下观察荧光素赖氨酸葡聚糖，筛选并挑选注射效果良好的rho 基因编辑胚胎（图 1E）。
      注：受精后越早进行显微注射，基因敲除效果越佳。
  5. 胚胎与蝌蚪的培养
    1. 将rho 基因编辑胚胎在培养皿中的 0.1x MBS 中培养至 37/38 期。每日清除死亡胚胎并更换 0.1x MBS 溶液。自 37/38 期起，在盛有蝌蚪培养水的水箱中继续培养胚胎；自 45 期起，按步骤 2.2.3 进行操作。

4. 通过细胞毒性眼内注射 CoCl2 诱导视网膜细胞变性

注意：本方案旨在通过向非洲爪蟾（Xenopus laevis）蝌蚪眼内注射氯化钴（CoCl2）诱导视网膜细胞变性。根据剂量不同，可引发视锥细胞特异性变性或更广泛的变性14。我们在此方案中使用发育至48期及以后阶段的非洲爪蟾（Xenopus laevis）蝌蚪，该方法也可用于热带爪蟾（Xenopus tropicalis）蝌蚪。

  1. 缓冲液与试剂的配制
    1. 使用时按1.1步骤配制0.005%苯佐卡因溶液。
    2. 配制 100 mM CoCl₂ 溶液2 将118.5 mg溶质加入5 mL 0.1x MBS中配制成储备液（配制0.1x MBS见步骤3.1.4）。将该储备液用铝箔避光，于4 °C保存数月。
      警告：CoCl2 被归类为对人类和动物生命有毒的化合物。请严格遵循安全数据表中关于操作、储存和废弃物处理的说明。
    3. 为实现视锥细胞特异性退化，配制 10 mM CoCl₂ 溶液2 使用时，将100 mM储存液用0.1x MBS稀释，配制成工作液。为诱导更广泛的视网膜细胞变性，配制25 mM CoCl₂溶液。2 溶液
  2. 注射系统的准备
    1. 使用微电极拉制仪打磨玻璃毛细管 13.
    2. 用一支已磨尖的毛细管吸取 2–10 µL 的 10 或 25 mM CoCl 溶液2 使用微量上样吸头将溶液或对照溶液（0.1x MBS）吸入毛细管，并将毛细管放入显微注射仪的持针器中。
    3. 在体视显微镜最高放大倍数下，用精细镊子折断毛细管尖端，并调节注射时间（约100毫秒），使每次脉冲喷射体积为15–40纳升。将喷射压力设定为约40 PSI。
      注意：液滴的大小应根据蝌蚪的发育阶段及其眼睛的尺寸进行调整。例如，在48-49期时，液滴体积约为15-20 nL，而在52-56期时为30-40 nL。从视觉上看，液滴的大小略大于晶状体。
  3. CoCl2 眼内注射
    1. 使用抄网在蝌蚪的养殖箱中捕捉蝌蚪。将其转移至50 mL的0.005%苯佐卡因溶液中。等待数分钟，直至蝌蚪不再对刺激产生反应。
      注意：可同时麻醉多只蝌蚪，但在麻醉剂中的时间应少于30分钟。
    2. 使用勺子捞取一只蝌蚪，并小心放入含有湿润滤纸的小型培养皿（直径55 mm）中。将蝌蚪背侧朝上置于培养皿中央图1F，G).
    3. 在体视显微镜下使用显微注射仪进行眼内注射 CoCl₂2 溶液。轻轻将毛细管插入眼球晶状体上方。当毛细管尖端进入眼内后，每眼注入两滴。注射右眼后，手动将培养皿旋转180°，以注射左眼。
      注意：确保注射操作在眼内进行，每次推出溶液后应观察到眼部轻微肿胀。蝌蚪离开水的时间应尽可能短。双眼注射过程应少于1分钟。
    4. 将注射后的蝌蚪小心地连同培养皿一起浸入含有1升饲养水的大型水族箱中图1H）。监测蝌蚪直至其完全苏醒。

5. 染色以评估视网膜损伤或视网膜变性

  1. 蝌蚪固定与脱水
    1. 通过将100 mL的32%多聚甲醛（PFA）溶液稀释至700 mL的1×PBS中，配制4% PFA溶液。用NaOH调节pH至7.4。将该储备液分装，并于-20 °C保存数月。
    2. 用0.01%苯佐卡因处死蝌蚪，转移至含有4% PFA的离心管中，在室温下振荡固定2小时，或在4 °C过夜。用1×PBS漂洗3次，每次5分钟。
    3. 依次在70%和95%乙醇（用II型水配制）中各孵育30分钟进行逐步脱水，随后在100%乙醇中再进行三次每次1小时的孵育。此步骤后可将蝌蚪头部于-20 °C保存，或直接转移至100%丁醇中过夜，以进行后续操作。
  2. 石蜡切片
    1. 在62 °C下，用熔化的石蜡替换100%丁醇，孵育2小时。再更换石蜡，在62 °C下继续孵育2次，每次2小时。
    2. 将蝌蚪头部转移至一次性石蜡包埋模具中，并调整方向使双眼对齐，随后让石蜡冷却凝固。将包埋块于室温保存。
    3. 修去多余石蜡，将含有蝌蚪组织的包埋块安装在切片机的支撑座上。
    4. 使用切片机将包埋块切成适当厚度（10–12 µm）。将切下的带状切片转移至预先涂有3%甘油明胶（用水稀释）的载玻片上。
    5. 将载玻片置于42 °C的玻片加热器上数分钟，去除多余的甘油明胶。然后将载玻片在37 °C烘箱中过夜干燥。
    6. 将载玻片浸入盛有100%二甲苯的Coplin染色缸中，脱蜡2次，每次15分钟。随后用梯度乙醇复水：100%乙醇两次、70%乙醇、50%乙醇（均用II型水稀释），每次约5分钟，最后在水中漂洗2次，每次5分钟。
  3. 免疫荧光标记
    1. 通过将29.4 g柠檬酸三钠二水合物（C6H5Na3O7, 2H2O）溶于1 L II型水中，配制100 mM柠檬酸钠（CiNa）储备液；用盐酸（HCl）调节pH至6。经高压灭菌后于室温保存数月。使用时，取25 mL 100 mM CiNa储备液加入225 mL II型水中，再加入125 µL Tween-20，充分混匀（终浓度为10 mM CiNa，0.05% Tween-20），即得抗原修复液。
    2. 通过将100 mg bisBenzimide H 33258溶于10 mL I型水中，配制10 mg/mL Hoechst储备液。此储备液避光（用铝箔包裹）于4 °C保存数月。使用时，取300 µL Hoechst储备液加入400 mL 1×PBS中，配制成7.5 µg/mL的Hoechst工作液。
      注：该工作液最多可重复使用10次 ，避光（用铝箔包裹）于4 °C保存约6个月。
    3. 脱蜡后，将切片浸入抗原修复液中煮沸9分钟进行抗原修复。随后让溶液冷却20分钟。
    4. 用II型水漂洗一次，再用1×PBS漂洗一次。将载玻片平放于湿盒中，每张切片加400–600 µL封闭液（抗体稀释液 + 0.2% Triton X100），室温封闭30分钟。
    5. 弃去封闭液，每张切片加入200 µL用封闭液稀释的一抗溶液。用盖玻片将液体均匀覆盖于组织切片上，避免产生气泡。于4 °C湿盒中孵育过夜。
    6. 将载玻片转移至Coplin染色缸中，用含0.1% Triton X100的1×PBS漂洗3次，每次10分钟。取出后平放于湿盒中，每张切片加400 µL用封闭液稀释的二抗溶液，室温孵育2小时。
    7. 再次将载玻片转移至Coplin染色缸中，用含0.1% Triton X100的1×PBS漂洗3次，每次5分钟。
    8. 用Hoechst溶液对细胞核进行复染，孵育10分钟，随后用1×PBS漂洗3次，每次5分钟。
    9. 在载玻片上滴加专用于保存荧光的水性封片剂，加盖盖玻片。室温干燥1小时后，于4 °C保存。
    10. 使用荧光显微镜观察切片。
  4. 苏木精-伊红（H&E）染色评估视网膜损伤
    注：与通过免疫染色标记特定细胞类型不同，H&E染色可用于评估视网膜的一般组织学结构。
    1. 脱蜡后，将切片浸入苏木精溶液中染色2分钟，随后用自来水充分冲洗。
    2. 将切片浸入1%伊红溶液中染色1分钟，然后快速用水冲洗。
      注：伊红极易溶解；若切片在水中停留过久，染料会完全消失。
    3. 用100%乙醇漂洗2次，每次5分钟；再用二甲苯漂洗2次，每次5分钟。
    4. 在通风橱中，于每张切片上滴加4–5滴封片剂，加盖盖玻片。切片在通风橱中干燥，次日用显微镜观察。
  5. 凋亡细胞检测
    1. 脱蜡后（参见第5.2.6节），按照试剂盒生产商的说明书操作，检测凋亡相关的DNA片段化。
    2. 将切片浸入Hoechst溶液中进行细胞核染色（参见第5.3.8节），然后使用专用于保存荧光的水性封片剂封片。室温干燥1小时后，于4 °C保存。
    3. 使用荧光显微镜观察切片。

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结果

机械性视网膜损伤
经受协议第1部分所述机械性损伤的蝌蚪视网膜切片显示，视网膜损伤累及组织的所有层，但局限在穿刺部位（图 2A、B）。

利用 NTR-MTZ 系统进行条件性视杆细胞消融
根据方案第 2 节所述，经 MTZ 处理的麻醉状态下的 Tg(rho:GFP-NTR) 转基因蝌蚪眼球在体视显微镜下进行观察分析（图 3A、B）。与对照组相比，GFP 荧光信号的减弱表明视杆细胞被逐步特异性消融（图 3B），该结果通过视网膜切片的 GFP 免疫染色进一步确认，如方案第 5 节所述（图 3C）。

通过 CRISPR...

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讨论

不同视网膜损伤模型的优缺点 非洲爪蟾 蝌蚪

机械性视网膜损伤
已在非洲爪蟾（Xenopus）蝌蚪中建立多种神经视网膜的手术损伤模型。神经视网膜可被完全移除15,16，也可仅部分切除16,17。本文所介绍的机械性损伤不涉及任何视网膜切除操作，而是采用我们先前在Xenopus蝌蚪中建立的一种简单的眼部穿刺方法6。由于该机械性视网膜损伤模型依赖手工操作，其表型在不同蝌蚪之间可能存在显著差异。此外，损伤的可重复性及损伤程度也可能因操作者不同而有所变化。因此，我们建议由同一人完成全部损伤操作。

利用 NTR-M...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究获得了 Retina France 协会、法国基金会、罕见病基金会（FMR）、Bardet-Biedl 综合征协会（BBS）以及盲人与视觉障碍者国家联盟（UNADEV）向 M.P. 提供的资助，上述资助由多机构专题研究所（ITMO NNP，神经科学、认知科学、神经病学与精神病学）/生命科学与健康联盟（AVIESAN）合作支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-丙二醇（丙基）è乙二醇Sigma-Aldrich398039
无水乙醇 ≥99.8%VWR 化学品20821-365
抗活化型半胱天冬酶3抗体（兔）细胞信号传导9661S稀释比例 1/300
抗GFP抗体（鸡）AveslabsGFP-1020稀释比例 1/500
抗M-视蛋白抗体（兔）Sigma-AldrichAB5405稀释比例 1/500
抗小鼠二抗，Alexa Fluor 594（山羊）Invitrogen Thermo ScientificA11005稀释比例 1/1,000
抗Otx2抗体（兔）AbcamAb183951稀释比例 1/100
抗兔二抗，Alexa Fluor 488（山羊）Invitrogen Thermo ScientificA11008稀释比例 1/1,000
山羊抗兔二抗，Alexa Fluor 594Invitrogen Thermo ScientificA11012稀释比例 1/1,000
抗视网素抗体（兔）Sigma-AldrichAB5585稀释比例 1/500
抗视紫红质抗体（小鼠）Sigma-AldrichMABN15稀释比例 1/1,000
抗S-视蛋白抗体（兔）Sigma-AldrichAB5407稀释比例 1/500
细胞凋亡检测试剂盒（Dead End 荧光素 TUNEL 系统）PromegaG3250
苯佐卡因 Sigma-AldrichE150110% 储备液
bisBenzimide H 33258（Hoechst）Sigma-AldrichB2883储存液 10 mg/mL
正丁醇 ≥99.5%VWR 化学品20810.298
二水合氯化钙（CaCl₂）2，2H2OSigma-Aldrich（Supelco）1.02382以 0.1 M 使用
Cas9（EnGen Spy Cas9 NLS）New England BiolabsM0646T
Clark 毛细玻璃管型号 GC100TF-10华纳仪器公司（哈佛仪器公司）30-0038
六水合氯化钴(II)（CoCl2，6H2OSigma-AldrichC8661100 mM 储存液
盖玻片 24 x 60 mmVWR631-1575
Dako REAL 抗体稀释液 安捷伦S202230-2
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD8418
电子旋转切片机赛默飞世尔科技Microm HM 340E 
1% 水溶性伊红RAL 诊断312740
荧光素赖氨酸葡聚糖  Invitrogen Thermo ScientificD1822
荧光体视显微镜OlympusSZX 200
庆大霉素EuromedexEU0410-B
甘油明胶（Mallory 法）DiapathE0012以3%的比例溶于水中使用
苏木精（Mayer's Hemalun）RAL 诊断320550
HEPES 钾盐Sigma-AldrichH0527
人绒毛膜促性腺激素激素MSD动物健康Chorulon 1500
盐酸烟雾，37%（HCl）Sigma-Aldrich（SAFC）1.00314
L-半胱氨酸盐酸盐一水合物Sigma-AldrichC7880在0.1x MBS（pH 7.8 - 8.0）中以2%浓度使用
七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）4，7H2OSigma-Aldrich（Supelco）1.05886
甲硝唑 Sigma-Aldrich（Supelco）M3761使用浓度为 10 mM
显微操作加样头Eppendorf5242956003
微移液管拉制仪（P-97 Flaming/Brown）Sutter Instrument Co.Model P-97程序：加热 700 / 拉制 100 / 速度 75 / 时间 90 / 解锁 p = 500
用于保存荧光的封片介质，FluorSave 试剂Millipore345789
封片剂，Eukitt化学实验室CL04.0503.0500
MX35 超薄切片机刀片Epredia3053835
25 G × 5/8″ 针头泰尔茂AN*2516R1
镀镍针夹Fine Science Tools26016-12
尼龙过滤织物（筛分织物）NITEX，孔径 1,000 µmSefar06-1000/44
不含DMSO的石蜡组织包埋蜡Histolab00403
32% 多聚甲醛溶液电子显微镜科学公司EM-15714-S在 pH 7.4 的 1×PBS 中使用，浓度为 4%
Peel-A-Way 一次性包埋模具Epredia2219
研钵杵VWR431-0094
培养皿 100 mm康宁高赛尔SB93-101
55 mm 培养皿康宁高赛尔BP53-06
10倍磷酸盐缓冲液（PBS）EuromedexET330-A
PicoSpritzer 微注射系统Parker 仪器产品PicoSpritzer III
针 Fine Science Tools26002-20
聚蔗糖（Ficoll PM 400）Sigma-AldrichF4375在0.1x MBS中以3%使用
氯化钾（KCl）Sigma-AldrichP3911
微粒鱼苗饲料：sera Micron Nature血清45475 (00720)
剪刀解剖Fine Science Tools14090-09
Superfrost 载玻片  KNITTEL 玻璃VS11171076FKA 
载玻片加热板孔兹仪器HP-3
氯化钠（NaCl）Sigma-AldrichS7653
柠檬酸钠三钠盐二水合物（C6H5Na3O7，2H2OVWR 化学品27833.294
碳酸氢钠（NaHCO₃）3)Sigma-Aldrich（Supelco）1.06329
30% 氢氧化钠水溶液 (NaOH)VWR 化学品28217-292
体视显微镜ZeissStemi 2000
注射器 Omnifix-F Solo 一次性注射器 1 mLB-BRAUN9161406V
反式激活crRNA（tracrRNA）Integrated DNA Technologies1072533
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
Tween-20Sigma-AldrichP9416
X-Cite 200DC 荧光光源X-Cite 200DC
二甲苯 ≥98.5% VWR 化学品28975-325

参考文献

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  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
  3. García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
  4. Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).
  5. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
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  7. Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
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  9. Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
  10. McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
  11. Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807(2022).
  12. Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
  13. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
  14. Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
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视网膜再生Muller胶质细胞机械性视网膜损伤光感受器消融CRISPR视紫红质敲除氯化钴注射荧光体视显微镜视网膜变性
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