两性多发性硬化症建模:MOG_35-55 诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎

多发性硬化症（MS）是一种影响中枢神经系统（CNS）的慢性自身免疫性炎症性疾病。它显示存在炎症细胞的血管周围浸润、脱髓鞘、轴突缺失和胶质增生¹。其病因尚不清楚，其临床方面、影像学和病理学特征表明该疾病具有显著的异质性²。

由于其病因和复杂性未知，目前尚无动物模型概括人类多发性硬化症中显示的所有临床和放射学特征 ^3,4。然而，采用各种动物模型来研究 MS ^3,4 的不同方面。在这些模型中，疾病的发生通常是非常人为的，并且人类和小鼠之间临床症状发作的时间范围不同。例如，在人类中，在临床表现出现之前，疾病的病理生理过程多年未被发现。相反，实验者可以在 MS 诱导后的数周甚至数天内检测到动物模型^{的症状 4}.

三种基本动物模型产生多发性硬化症特征的脱髓鞘特征:病毒诱导的特征（例如，泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒）、毒性物质诱导的特征（例如铜酮、溶血卵磷脂）以及实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE^{） 的不同}变体5。每个模型都有助于研究疾病的某些特定方面，但没有一个模型可以复制MS⁶的所有特征。因此，考虑到具体的实验需求和要解决的科学问题，选择正确的模型至关重要。

由于针对髓鞘衍生抗原的免疫程序，EAE是通过触发易感小鼠对中枢神经系统成分的自身免疫反应来诱导的。广泛的免疫病理学和神经病理学机制之间的相互作用导致免疫小鼠中 MS 的主要病理特征（即炎症、脱髓鞘、轴突丢失和神经胶质增生）^{的发展 7,8}。小鼠在免疫接种后第二周左右开始出现临床症状，通常表现出从尾巴到肢体和前肢的上行麻痹。临床评分（即疾病相关缺陷积累的量化）通常使用 5 分制⁷ 进行评估。

蛋白质或肽的主动免疫或脑致癌 T 细胞的被动转移可用于在具有不同遗传背景的小鼠（例如 SJL/J、C57BL/6 和非肥胖糖尿病 （NOD） 小鼠）中诱导 EAE。髓鞘蛋白脂质蛋白 （PLP）、髓鞘碱性蛋白 （MBP） 和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 （MOG） 是通常产生免疫原的自身中枢神经系统蛋白的例子。特别是，用免疫显性 PLP 表位 （PLP_139−151） 免疫的 SJL/J 小鼠发展为复发缓解 （RR） 病程，而用免疫显性 MOG_35-55 肽免疫的 C57BL/6J 小鼠表现出慢性性质^{的 EAE 1}。尽管存在一些局限性，例如提供有关 MS 进展、B 细胞在疾病中的作用、由内而外的机制或研究髓鞘再生的困难的信息很少，但 EAE 模型为理解自身免疫和神经炎症过程做出了巨大贡献，增加了 MS 领域的知识，从而允许开发针对这种疾病的新治疗方法^4，6.

在本研究中，我们专注于一种特殊形式的活性 EAE，即髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽 35-55 （MOG_35-55） 诱导的形式^{9、10、11、12}。MOG_35-55 诱导的 EAE 模拟了一种慢性 MS 形式。免疫后，小鼠在免疫后第一周内经历无症状阶段，然后疾病通常在免疫后的第二周出现，而在免疫后的第三周和第四周之间，疾病变成慢性的，不可能从累积的缺陷中完全恢复^7,8,13.有趣的是，在文献中的大多数研究中，男性和女性在发病率、发病、病程或进展方面没有观察到差异¹⁴，即使比较男性和女性疾病的研究较少。

相比之下，在人类中，已知这些参数具有强烈的性别二态^{性 2}。多发性硬化症影响女性多于男性;然而，男性通常会患上更具侵袭性的疾病²。这一证据表明，性腺激素起着重要而复杂的作用¹⁵;然而，性激素在病理学中的作用和作用机制仍不清楚。此外，来自动物模型的数据支持雌激素和雄激素都以性别特异性的方式对病理学的不同区域产生积极影响的观点^16,17。

一些研究还表明黄体酮具有神经保护、早髓鞘和抗炎作用¹⁸ ，尽管 MS 患者的证据很少¹⁸，但神经活性类固醇（即神经系统 从头 合成的类固醇，如孕烯醇酮、四氢孕酮和二氢孕酮）也可能影响病理过程¹⁹.总的来说，这些数据支持这样一种观点，即外周和中枢神经系统内部产生的性激素在疾病发生和进展中具有重要的性别特异性作用。因此，在本工作中，我们敦促收集雄性和雌性动物的单独数据。

从组织病理学的角度来看，脊髓白质是该模型中 CNS 损伤的主要部位，其特征是单核炎症浸润和脱髓鞘的多灶性汇合区域⁸。因此，在描述该方案在C57BL / 6J小鼠中诱导MOG_35-55诱导的EAE时，我们将考虑两性的疾病结果，并提供一些关于脊髓的组织病理学见解。

本工作中的动物护理和处理是根据 2010^{年 9} 月 22 日欧盟理事会指令 （2010/63/UE） 进行的;本研究中报告的所有程序均已获得意大利卫生部 （407/2018-PR） 和都灵大学伦理委员会（项目编号 360384）的批准。我们建议按照 Kilkenny 等人最初于 2010 年发表的 ARRIVE 指南进行实验设计²⁰.在开始之前，请确保有必要的材料可用（请参阅 材料表）。在高压灭菌器中对用于制备MOG_35-55 乳液的所有玻璃器皿和器皿进行消毒。实验过程的总结如 图1所示。

1. MOG_35-55 乳液的制备

注意:为了制备乳剂，需要MOG_35-55，不完全弗洛伊德佐剂（IFA）， 结核分枝杆 菌菌株H37Ra（MT）和生理溶液（见 材料表）。

注意:热杀灭的 MT 可以刺激先天免疫反应。避免吸入、摄入和接触皮肤和眼睛，使用适当的个人防护装备，并在引擎盖下的有盖精密天平中称量 MT。

表1: 用于免疫程序的溶液的组成。

1. 在玻璃烧杯中制备溶液，首先加入液体成分，最后加入MT。
   注意:每只待免疫小鼠所需的乳剂总体积为300μL，如 表1所示。乳液非常粘稠，因此在制备和注射过程中，可能会有一些损失，尤其是在为几只小鼠制备溶液时。我们建议通过高估至少1.5-2倍的免疫小鼠数量来计算所需的最终乳剂体积。
2. 将烧杯放入冰块中，然后使用带有18G针头的玻璃注射器开始乳化溶液。
   注意:乳液也可以使用其他策略制备，例如，通过将两个无气玻璃注射器与三通旋塞阀连接并通过来回推动柱塞来混合溶液^21,22。
3. 乳化溶液至少15分钟;一般来说，30分钟的乳化就足够了。为了检查乳液的质量，在装满水的透明容器中加入一滴乳液:如果液滴保持其结构并保持完整，则乳液已准备就绪。
4. 将乳液直接放入将用于免疫接种的 1 mL 注射器中，并将其储存在 +4 °C 直至使用，以保持乳液的厚度并避免改变或污染。

2. 动物选择和免疫

1. 动物选择
   1. 在8-10周龄时选择两性成年C57BL / 6J小鼠，最佳体重为~20g。一定要为不同的实验组选择年龄和性别匹配的小鼠，因为对疾病的易感性可能随年龄和性别而变化。
      注意:小鼠在免疫当天的体重应相当，因为本程序针对特定体重范围（17-25g）进行了优化。
   2. 在22±2°C，在12:12光/暗循环下，在45cm x 25 cm x 15 cm聚丙烯小鼠笼中，在标准条件下将同性动物分组饲养（n = 4-5 /笼子），以避免社会隔离。 随意提供食物和水。
      注意:最终，为了进一步限制免疫动物病程的潜在变异性，我们还建议形成足够数量的实验组。还有研究 ^8,23 将免疫接种时间描述为决定 EAE 结果变化的条件。因此，我们建议在所有动物中大约在同一时间进行免疫接种，最好是在每日光/暗周期²³的光照时间内。为了限制压力，最好在免疫日之前对动物进行操作，并标记它们以轻松识别它们以进行日常评估，例如，剪耳或标签。
2. 免疫程序
   注意:确保该程序由经验丰富的调查员执行，以尽量减少对动物的压力并优化免疫接种。在开始免疫接种之前，请根据机构动物护理和伦理委员会指南选择麻醉方法。我们的实验室使用异氟醚进行短暂麻醉。
   1. 麻醉小鼠:4%异氟醚用于麻醉诱导，1.5-2%异氟醚用于麻醉维持。等待麻醉有效，并使用前脚脚趾捏住来评估麻醉水平。为防止小鼠在麻醉下出现眼睛干燥，请使用兽医批准的眼药膏。
   2. 在外侧尾静脉中静脉注射PT:用乙醇溶液轻轻塞住小鼠的尾巴，乙醇溶液可作为血管扩张剂，以显示静脉。聚焦于尾部的两条侧静脉之一，并使用装有 30 G 针头的 0.5 mL 注射器注射 500 ng PT（即，100 μL PT 稀释在生理溶液中以 5 μg/mL 的浓度）。
   3. 皮下注射MOG_35-55 乳剂:使用带有26G针头的1mL注射器，对先前制备的乳液进行三次皮下注射:两次在侧翼的喙部下方，一次在尾部底部。在每个部位注射的乳剂体积为100μL，每只小鼠中注射的乳剂总体积为300μL。
      注意:免疫接种日记录为免疫接种后第 0 天 （dpi）;48小时后（即在2dpi下），有必要进行另一次静脉注射PT，与先前进行的注射相同。可以使用鼠标约束器在没有麻醉的情况下进行注射。这里描述的程序旨在在免疫程序期间诱导和维持小鼠的麻醉，以避免动物可能的不适和运动或小鼠和研究人员的风险。因此，没有外科手术。然而，为了优化实验过程，重要的是在这些步骤中保持适当的无菌条件，并在这些程序后监测小鼠的状况。
   4. 为了验证小鼠是否已从注射中恢复过来，请在手术后将其放入干净的笼子中，并等待它恢复足够的意识以保持胸骨卧位。老鼠完全康复后，将其与其他动物一起放回笼子。

3. EAE跟进

1. 体重和食物摄入量
   1. 使用电子精密天平每天监测动物的体重（BW），因为BW的减少是疾病进展的指标。
      注意:根据机构和伦理委员会的动物护理指南，这种减少不应超过一定百分比。通常，如果动物减掉了初始体重的 20% 以上（即以 0 dpi 记录的体重），则应将其作为人道终点的应用而牺牲。安乐死方法包括吸入（例如，5% 异氟烷）的深度不可逆麻醉，然后斩首。
   2. 监测食物摄入量 （FI） - 动物在一天内吃的食物 （g∙^day-1∙^animal-1），每周至少称量一次特定容器中的食物量，并将经过的天数除以两次连续测量和笼子中的动物数量。
      注意:此测量可以估计平均食物摄入量。由于临床疾病体征的出现和积累，包括四肢瘫痪，我们建议当动物不能用后肢站稳并够到食物容器或水瓶时，在笼子的地板上放置一些浇水的食物。为了尽可能精确地评估随访期间的食物摄入量，我们还测量了这种食物的干重，然后再为小鼠润湿。
2. EAE期间发情周期性的评估
   1. 检查发情周期至少两个周期，评估 McLean 等人 ²⁴ 描述的阴道细胞学涂片。根据阴道涂片样本中三种主要细胞类型（有核上皮细胞、角化鳞状上皮细胞和白细胞）的存在对发情周期的阶段进行分类，如下所示:
      1. 根据几乎完全存在的圆形、形成良好的有核上皮细胞簇，将其分类为发情期。
      2. 根据密集堆积的角质化鳞状上皮细胞簇的主要存在分类为发情期。
      3. 根据主要存在小的深色白细胞和少量角质化鳞状上皮细胞，将其分类为中胚层。
      4. 根据高度突出的深色小白细胞和罕见的角质化鳞状上皮细胞以及可能出现的有核上皮细胞，将其归类为发情期。
         注意:在评估两性疾病时，重要的是要检查由于发情周期引起的女性变异性。我们建议重点评估发情周期，特别是在免疫接种后第一周和第二周之间（即在EAE的急性期）。先前已经表明，免疫程序会导致发情周期在这一阶段最显着的改变²⁵.此外，重要的是要考虑到，由于后肢麻痹和后肢缺乏张力，当动物达到高临床评分（尤其是 >3）时进行涂片是困难的。
3. 临床评分
   1. 让盲法调查员每天评估动物的临床评分。为每只动物分配一个从0到5的评分（见表2），以评估Racke⁷所描述的疾病^过程26。
      注意:与体重减轻类似，根据机构和伦理委员会的动物护理指南，人道终点对于临床评分的增加也是必要的。一般来说，如果动物不再能够自主进食（根据我们使用的量表，这通常发生在动物至少达到 4 分时），它应该被牺牲作为人道终点的应用。
4. 通过旋转测试评估电机性能
   注意:EAE 进展的评估通常通过每天分配临床评分来进行，该评分由训练有素的盲法研究者完成。然而，对疾病的进展进行更定量和客观的评估可能是有用的。在先前的研究²⁶中，旋转试验用于测量免疫动物的运动性能。正如van den Berg等人²⁷所描述的那样，为了对病程进行更定量和更精确的临床评估，通过旋转试验对运动性能的评估可以支持临床评分评估。详细描述见van den Berg et ^al.27。
   1. 让小鼠每天进行旋转训练，从1 dpi开始直到牺牲（即28 dpi）。每个会话由一个 300 秒的会话组成，在此期间，杆速必须从 4 rpm 线性增加到 40 rpm。
   2. 登记动物的分数。当鼠标无法保持平衡并从设备上掉下来时，它会掉在地上并触发传感器，并记录时间。因此，性能被评分为下降的延迟。

表2: 用于评估 EAE 进展的临床评分系统。

4. 脊髓水平 EAE 诱导的组织病理学体征的评估

注意:在这里，我们简要报告了牺牲动物并收集脊髓进行组织病理学分析的程序;有关详细说明，请参阅这些参考文献^{10、26、28、29}。

1. 固定和组织取样
   注:有关详细说明，请参阅这些参考文献^10,26。
   1. 在疾病的慢性期以28 dpi处死动物。
      1. 通过深度不可逆麻醉（腹膜内注射唑拉西泮和替他明80mg / kg /甲苯噻嗪10mg / kg）麻醉小鼠。
      2. 用生理盐水溶液经心灌注小鼠，然后用4%多聚甲醛（PFA）溶液灌注。
         注意: 使用 PFA 时要注意:因为它有毒，请使用适当的个人防护设备避免吸入、摄入和接触皮肤和眼睛。称量粉末，制备溶液，并在罩下进行灌注。
   2. 从脊柱上取下脊髓³⁰.
   3. 将脊髓储存在4%PFA溶液中24小时。
   4. 在0.01M盐水磷酸盐缓冲液（PBS）中进行多次洗涤。
   5. 将脊髓嵌入石蜡块³⁰.
2. 组织学程序
   注:有关详细说明，请参阅Montarolo et ^al.10。
   1. 使用切片机切割10μm厚的横脊髓切片，并将它们收集在明胶涂层的载玻片上。定向切片平面以匹配对应于小鼠脊髓图谱³¹的横截面的图纸。
   2. 执行第³² 节的脱蜡。
   3. 用苏木精和曙红³² 染色切片。
   4. 脱水部分³².
   5. 用安装介质覆盖这些部分，并在化学罩下在室温下干燥。
      注意:苏木精-伊红染色可以检测血管周围炎症浸润（PvIIs）²⁶的存在，这被评估为疾病的征兆²⁸。
3. 脊髓切片的定量分析
   1. 使用连接到具有 20 倍物镜²⁹ 的数码相机的光学显微镜获取染色切片的图像。
   2. 分析采集的图像以获得PvIIs的数量，表示为每mm²的浸润数。
      注意:对于采集图像的分析，利用图像分析软件很有用。本研究中提出的神经病理学发现在每只小鼠 （n = 8/组） 的 10 个完整的脊髓横截面中量化，代表整个脊髓水平。

免疫接种后的EAE随访
评估如下。

体重和食物摄入量
双因素方差分析（ANOVA）（性别和时间作为自变量）显示，两性EAE动物的BW均有所下降，尤其是在诱导后第二周内（F（1,57）= 4.952，p < 0.001; 图2A）。然而，BW中的性二态性始终保持不变（图2A）。就 BW 的百分比而言 （F（1,57） = 23.935，p < 0.001;图2B），与初始BW相比，男性和女性在12 dpi至17 dpi之间显示出巨大的损失（p < 0.001），但从未超过20%的总损失（图2B）。因此，尽管BW损失在疾病发作之前就开始了，但在EAE的急性期达到最大值（图2A，B）。在BW损失方面，两性之间没有差异。然而，女性在慢性期（诱导后第三至第四周）往往更早地减轻体重，恢复得更少（图2B）。

此外，双因素方差分析（性别和时间作为自变量）也显示FI显著降低（F（9， 39） = 6.682，p < 0.001; 图2C）在两性中，特别是在免疫后的第二周，由于EAE严重程度的增加，这使得动物更难获得放置在笼子上层容器中的食物。正如我们建议的那样，随后将食物放在笼子地板上，以减少对动物的进一步压力。这使得FI恢复到初始水平（图2C），BW部分恢复（图2A，B）。

女性发情周期评估
使用学生 t 检验比较在发情期不同阶段花费的时间。分析显示，无症状期（EAE 发作前）和症状期（EAE 发作后）与非发情期（即发情期和发情期）相比，无症状期（EAE 发作前）和症状期（EAE 发病后）在发情期（即发情期和发情期）所花费的时间存在差异（p = 0.042;图2D），主要是由于症状期发情时间的增加（p = 0.017）和发情前期时间减少的趋势（p = 0.08）。

已经描述过，诱导程序导致女性发情周期的改变，特别是影响发情期25。在这个阶段，已知雌激素水平的增加会产生抗炎和神经保护作用16 ，因此，可能在症状前阶段负责这些激素的保护作用。然而，当我们在发病后阶段看到雌激素水平下降时，它们的保护作用也会结束。

临床评分和旋转性能
双因素方差分析（性别和时间作为自变量）显示男性和女性的临床评分 （CS） 时间显着增加 （F（56-813） = 27.951，p < 0.001; 图3A）。特别是，从 10 dpi 开始，两性都显示出 CS 显着增加 （p < 0.001），一直保持到终点 （28 dpi）（图 3A）。女性的CS即使不显著（p = 0.156），也高于男性（图3A）。就疾病发病而言，它通常发生在 10 dpi 左右，女性发病比男性更早（图 3B）。此外，与男性相比，女性的累积 CS 显著更高 （p = 0.017;图3C）。

旋转性能过程类似于临床评估（图2D）。从疾病发作开始，它在EAE的急性期下降，在免疫后第二周达到最低性能。双因素方差分析（性别和时间作为自变量）显示男性和女性的旋转性能时间显着减少 （F（46-673） = 5.365，p < 0.001; 图3D）。特别是，男性在 16 dpi （p = 0.022） 时表现出最低性能，而女性在 17 dpi （p < 0.001） 时表现出最低性能。男性往往比女性表现更好，尤其是在疾病的慢性期（21-28 dpi），这可能是由于较低的CS（图3A，D）。

脊髓的组织病理学评估
脊髓切片中 PvII 的单因素方差分析（性别作为自变量）突出了男性和女性之间的明显差异（图 4A）。女性的 PvII 数量明显高于男性 （F（1,14）= 63.107，p < 0.001; 图4B）。这些数据可能反映了在雌性中观察到的累积 CS 较高、旋转性能较差以及更具侵袭性的疾病，尤其是在 EAE 的慢性期。

这些数据还反映了这样一个事实，即与雄性小鼠相比，雌性小鼠对更具侵袭性的EAE的发展表现出更高的易感性14，这是该疾病模型与人类MS之间的主要区别之一。与男性相比，女性的疾病发病较早，原发性进展型的患病率适度降低，总体残疾进展较少 2,33,34。

图1:实验程序的时间示意图。 用 BioRender.com 创建。缩写:i.v. = 静脉注射;s.c. = 皮下;MOG35-55 = 髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽 35-55;= dpi = 免疫接种后的天数。 请点击这里查看此图的较大版本.

图2:EAE对雄性和雌性小鼠体重、食物摄入量和雌性小鼠发情周期的影响评估。 从免疫接种当天（0 dpi）到牺牲当天（28 dpi），图表显示了（A）每日体重，（B）体重百分比和（C）两性动物的每周食物摄入量评估（n = 15 /组）。（D）在雌性小鼠的无症状阶段（发病前，图表左列）或症状阶段（发病后，图表右列）期间，通过阴道细胞学涂片评估的发情周期不同阶段花费的时间（表示为平均时间百分比）。统计分析显示， p±≤ 0.05 有显著影响（# = 男性与女性;* = 不同时间点之间的比较）。缩写:EAE = 实验性自身免疫性脑脊髓炎;BW = 体重;FI = 食物摄入量;DPI = 免疫接种后天数。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:受 EAE 影响的雄性和雌性小鼠的临床评分和旋转性能的评估。 （A）评估两性动物的每日临床评分（从0到28 dpi）（n = 15 /组）。（B）受EAE影响的雄性（左列）和雌性（右列）小鼠的发病日期（平均dpi）。（C） 受 EAE 影响的雄性（左列）和雌性（右列）小鼠达到的平均累积临床评分。（D） 评估两性动物的每日旋转性能（以跌倒潜伏期测量）从 6 到 28 dpi（0 代表在测试的前 5 天内获得的基线值）。数据以平均值±SEM表示。 统计分析显示 ，p≤ 0.05（# = 男性与女性;* = 不同时间点之间的比较）有显著影响。缩写:EAE = 实验性自身免疫性脑脊髓炎;CS = 临床评分;Cum CS = 累积临床评分;DPI = 免疫接种后天数。 请点击这里查看此图的较大版本.

图4:两性受EAE影响的小鼠脊髓炎症分析。 （A）用苏木精-伊红染色的横脊髓切片的代表性图像突出显示了雄性（上图）和雌性（下图）小鼠中PvII（箭头）的存在。（B） 测量受 EAE 影响的男女小鼠脊髓中 PvII 的存在（n = 8/组）。数据以平均值±SEM表示。 统计分析显示 ，p ≤ 0.05（# = 男性与女性）有显著影响。比例尺 = 200 μm（10 倍放大倍率）。缩写:EAE = 实验性自身免疫性脑脊髓炎;* = 中央运河;PvII = 血管周围炎症浸润。 请点击这里查看此图的较大版本.

作者在本文的研究、作者身份和/或出版方面没有任何利益冲突需要声明。