人类胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞在最佳阶段的冷冻保存

摘要

本研究提供了一种高效冻存人干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的详细方案。

摘要

视网膜色素上皮 由人胚胎干细胞（hESCs）衍生的视网膜色素上皮（RPE）细胞是用于视网膜退行性疾病患者细胞替代治疗的优质细胞来源；然而，关于这些治疗性细胞的稳定与安全保藏的研究仍十分有限。不同批次细胞的存活率和功能恢复存在高度变异性， 冻存后的视网膜色素上皮（RPE）细胞是最常遇到的问题之一。本方案旨在根据原始实验条件选择最佳冻存细胞时期，以实现解冻后最高的细胞复苏率。通过5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（5-ethynyl-2′-deoxyuridine）标记实验确定细胞处于对数生长期时进行冻存，可显著提高解冻后的细胞活力和复苏率。解冻后可快速获得稳定且具有功能的细胞，无需经历漫长的分化过程。本文所述方法可实现人胚胎干细胞来源的RPE细胞简单、高效且低成本的保存与复苏。尽管本方案主要针对RPE细胞，但该冻存策略也可适用于多种其他类型的分化细胞。 关键词：RPE细胞，冻存，解冻，细胞复苏率，对数生长期，5-乙炔基-2′-脱氧尿苷，人胚胎干细胞

引言

视网膜色素上皮（RPE）是一层具有色素的单层细胞，对维持视网膜正常功能至关重要¹。RPE功能障碍和细胞死亡与多种视网膜变性疾病密切相关，包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性以及Stargardt病^2,3。RPE替代治疗是这些疾病最具前景的治疗策略之一^4,5,6,7。稳定的供体RPE细胞供应对于细胞治疗至关重要。人胚胎干细胞（hESC）来源的RPE细胞是理想的细胞治疗来源，因其功能与原代RPE细胞相似，并可提供理论上无限的细胞供应⁸。然而，分化过程繁琐，且获得的RPE细胞因后续发生上皮-间质转化（EMT）而保质期相对较短。因此，hESC来源的RPE细胞的冷冻保存是实现长期储存和按需分发所必不可少的关键步骤⁹。

冷冻保存过程中引起的细胞损伤可能会无意中损害治疗效果^10,11。因此，近期关于冷冻保存的研究提出，在设计细胞治疗方案时应确定最佳的深低温储存条件¹²。成功的冷冻保存可确保细胞在冻融循环后实现高效的回收率、高存活率以及细胞功能的恢复。然而，以往对哺乳动物细胞贴壁单层进行冷冻保存的研究报道，解冻后的细胞存活率差异较大（35%–95%）^13,14,15。许多因素显著影响冷冻保存的效果，尤其是在冷冻阶段^16,17。最近的研究表明，不同时间点冷冻的视网膜色素上皮（RPE）细胞在解冻后表现出不同的恢复能力¹⁷。据我们所知，目前尚缺乏关于干细胞来源的RPE细胞最佳冷冻时间窗口的研究。在不同的研究中，细胞被冷冻的阶段各不相同：一些细胞在传代后不久或在达到融合前或色素沉着前即被冷冻^8,15,18，而另一些则在其他时间点被冷冻^9,19,20,21。此外，尚无明确证据表明用于冷冻保存的RPE细胞所处的相位或阶段是否会影响其解冻后的功能。在我们之前的研究中，我们首次证明，从细胞活力以及细胞特性与功能恢复的角度来看，hESC来源的RPE细胞在指数生长期（P2D5）是进行冷冻保存的最佳阶段¹⁷。

本研究建立的方法旨在将人胚胎干细胞（hESC）分化而来的视网膜色素上皮细胞（RPE）在最佳阶段进行冷冻保存，以在解冻后实现细胞活力和功能的最佳保存效果。通过在冷冻前采用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）标记法检测DNA合成的指数期，解冻后的RPE细胞表现出 >80%的存活率和贴壁率、RPE特异性基因表达、极性细胞形态、色素上皮衍生因子分泌、适当的跨上皮电阻以及吞噬能力^8,17,22. 尽管本方案主要关注 在hESC来源的RPE细胞上，由于并非所有治疗性细胞都能以相同效果进行冷冻保存，因此在指数生长期进行冻存的策略可应用于许多其他治疗性细胞。

方案

1. 细胞解离

1. 按照先前所述方法培养RPE细胞^17,22。
   注意：所有细胞在实验流程期间均在37 °C、5% CO₂的环境中培养。
2. 将所需量的PBS和培养基置于37 °C水浴中预热，并将细胞解离试剂放置于室温下。
3. 弃去培养液，每孔加入1 mL预热的PBS，洗涤两次。
4. 向6孔板中加入1 mL细胞解离试剂，在37 °C下消化15分钟。孵育后，在显微镜下观察细胞是否边缘收缩、发亮，以确认消化终止。
   注意：不推荐使用基于胰蛋白酶的解离方法，因其会导致细胞活力较低。
5. 用1 mL移液器轻柔吹打10次以充分解离细胞，并按1:10比例加入预热的培养基（不含Y-27632）稀释细胞悬液，然后在室温下以250 × g离心3分钟。
6. 离心后迅速倒去上清液，用2 mL培养基轻柔重悬细胞沉淀，并用移液器吹打10–15次使细胞充分悬浮。
7. 使用40 µm细胞筛过滤细胞悬液，获得单细胞悬液，并计算细胞数量。
   ​注意：单细胞悬液对于准确计数以及冻存后均匀接种细胞密度至关重要。

2. 确定细胞冻存的最佳时期

注意：由于不同分化方法和细胞系之间的细胞状态存在差异，因此在冻存前应确定各实验室培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞的指数生长期。

1. 4 °C 冰上过夜融化一管基底膜基质溶液。将基质用 12 mL 冷的 DMEM/F-12 稀释并充分混匀。每孔加入一个盖玻片，向 24 孔板的每个孔中加入 0.25 mL 稀释后的溶液进行包被。将培养板置于培养箱中孵育 室温孵育1小时或4 °C过夜，使用前弃去包被液，然后接种细胞。
   注意：分装体积的说明因批次而异，具体取决于蛋白浓度，详见产品说明书。
2. 将步骤1.7获得的RPE单细胞以每平方厘米10万个细胞的密度接种于基底膜基质包被的盖玻片上⁵/cm² 在1 mL培养基中培养，每2-3天更换一次培养基。
3. 在指定时间点（传代后第1、3、5、7和11天），将RPE细胞在含10 μM EdU的培养基中孵育24 h。随后按照说明书所述，对细胞进行固定、透化处理，并用反应混合液染色以检测掺入的EdU。
4. 在荧光显微镜下随机选取五个视野拍摄图像，计算EdU阳性细胞的百分比。绘制相应的EdU阳性比例-时间曲线以生成生长曲线。随后，根据生长曲线确定每种细胞系的冻存窗口期或指数生长期。
   ​注意：六边形细胞形态的重新出现表明细胞已退出指数生长期。

3. 冷冻保存

1. 按照步骤 1.1 至 1.7 操作，但消化时间缩短至 5 分钟，将细胞悬液在室温下以 250 × g 离心 3 分钟。
2. 离心后迅速倾倒弃去上清液，轻轻将细胞沉淀重悬于冻存液中，细胞密度为 2 × 10⁶ 个细胞/mL，取 1 mL 细胞悬液转移至 1.2 mL 冻存管中。
3. 立即将冻存管放入冻存盒中，在 −80 °C 过夜冷冻，以实现 −1 °C/min 的降温速率，随后将冻存管转移至液氮中进行长期保存。

4. 解冻

1. 将培养基放入37 °C水浴中预热，并将10 mL预热的培养基预先加入15 mL离心管中。
2. 使用自动化解冻系统快速解冻直接从液氮储存中取出的冷冻管。
3. 向冷冻管中滴加0.5–1 mL预热的培养基，以确保冻存细胞逐步适应新环境。然后将1.5–2 mL细胞悬液转移至15 mL离心管中含10 mL培养基的溶液中，在室温下以250 × g离心3分钟。
4. 离心后迅速倾倒去除上清液，将沉淀重悬于2 mL预热的培养基中，并使用血细胞计数板对细胞进行计数，采用标准台盼蓝排斥法（0.4%台盼蓝染色）测定细胞回收率和存活率。
5. 将细胞以10⁵个活细胞/cm²的密度接种于基底膜基质包被的表面，在添加Y-27632（终浓度：10 µM）的培养基中培养。24小时后去除Y-27632。
6. 为测定贴壁率，在解冻24小时后再次解离细胞并计数细胞数量。

5. 最佳冷冻阶段的验证

1. 为了验证步骤2.4中确定的最佳冻存时期，解冻在不同时间点冻存的RPE细胞，并培养28天。收集细胞进行qPCR和免疫染色分析，以评估RPE标志物的表达，方法如前所述¹⁷。

结果

在此，将第35天传代的hESC来源的RPE细胞以10⁵/cm²的密度进行传代和接种。接种后约一周内，在滞后期（约2天）细胞逐渐失去典型的六边形形态和色素沉着。在对数生长期（约5天，图1A），RPE细胞逐渐重新获得六边形形态，并进入减速期（约6天），此时细胞呈现更明显的多边形形态。若继续培养一周，细胞增殖显著减少，细胞间连接起主要作用，细胞边缘明显亮起；此时细胞已不再处于对数生长期（图1A，P2D11）。除细胞形态外，还进行了EdU细胞增殖检测以辅助判断细胞所处阶段。图1B显示，P2D5细胞具有较高的增殖率（处于对数生长期），而P2D11细胞则已进入减速期。

在液氮中冷冻保存1至3个月后，RPE细胞被解冻。解冻后，部分细胞降解为亚细胞碎片，部分细胞发生凋亡，其余细胞存活下来。24小时后，P2D5阶段冷冻的RPE细胞贴壁率高于其他时间点冷冻的细胞（

讨论

本研究介绍了一种适用于科研和临床需求的人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮（RPE）细胞的高效冻融方案。与永生化RPE细胞系ARPE-19不同，具有典型上皮细胞表型和功能的干细胞来源RPE细胞对低温保存更为敏感。若保存不当，解冻后24小时内的细胞存活率不足32%¹⁷。低温保存的时机是一个关键参数。对于永生化细胞，通常建议在对数生长期进行冻存。然而，分化后的细胞已退出细胞周期，因此细胞生长阶段对低温保存效果的影响在分化细胞中很少被考虑。我们发现，人胚胎干细胞分化的RPE细胞在传代后可短暂恢复增殖能力，并进入对数生长期。在对数生长期进行RPE细胞的低温保存可获得更优的保存效果¹⁷。

本方案的局限性在于仅测试了两种冷冻保存培养基。不同的冷冻保存培养基可能通过不同机制防止冷冻损伤²³；因此，冷冻保存培养基可能影响视网膜色素上皮（RPE）细胞冷冻保存的最佳阶段。冷冻保存培养基是否会影响最佳冷冻时间，尚需进一步评估。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40 μm 细胞筛	Corning	431750
Click-iT EdU 细胞增殖成像试剂盒，Alexa Fluor 488 染料	Thermo Fisher Scientific	C10337
程序降温冻存容器	Nalgene	5100-0001
CryoStor CS10	Biolife Solutions	07930	冻存培养基 #1
不含钙、镁的 DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Genxin	Selcell	YB050050	冻存培养基 #2
人胚胎干细胞	由美国 Wicell 提供	H9 细胞系
Matrigel，适用于人胚胎干细胞的基质	Corning	354277	基底膜基质
ThawSTAR CFT2 自动化细胞复苏系统	BioLife Solutions	AST-601
0.4% 台盼蓝溶液	Sigma	T8154
TryPLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563029	细胞解离试剂
XVIVO-10 培养基	Lonza	BEBP04-743Q	RPE 培养基
Y-27632	Selleck	S1049