本研究提供了一套易于使用、完整且简便的方法，用于标记和分析经CUBIC透明化处理的小鼠肾脏中的肾小球。利用异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖、光片荧光显微镜（LSFM）或常见的共聚焦显微镜，结合Imaris等软件，可轻松、可靠地获取肾小球数量和体积等数据。
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摘要
摘要
肾小球是肾脏的基本功能单位，因此研究肾小球对于理解肾脏功能与病理机制至关重要。生物学成像能够提供直观的信息，因此对肾小球进行标记和观察具有重要意义。然而，目前常用的肾小球观察方法操作复杂，且结果可能丢失标记细节或三维（3D）信息。透明化脑成像鸡尾酒试剂与计算分析（CUBIC）组织透明化技术已在肾脏研究中广泛应用，可实现更精确的检测和更深的成像深度。我们发现，通过尾静脉注射中等分子量的FITC-葡聚糖，结合CUBIC透明化方法，可快速有效地标记小鼠肾小球。经透明化处理的小鼠肾脏可通过光片显微镜（或切片后使用共聚焦显微镜）扫描，获得整个肾脏中所有肾小球的三维图像序列。通过适当的软件处理，肾小球信号可被轻松数字化，并进一步分析以测定肾小球的数量、体积及其分布频率。
引言
肾小球的数量和体积对于多种肾脏疾病的诊断和治疗具有重要意义1,2,3,4,5。估算肾小球数量的金标准是物理分割器/分层器组合法。然而，该方法需要特殊的试剂和设备，导致其操作缓慢且成本高昂6,7,8,9。肾活检可提供大量信息，但显然该方法仅适用于粗略估计10,11。医学成像技术，包括磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）和X射线，也广泛应用于肾小球检测12,13,14,15，但这些技....
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方案
本研究使用成年C57BL/6小鼠（6周龄，25-30 g）。所有操作均遵循当地有关动物福利和实验伦理的法规。本研究经四川大学华西医院生物医学研究伦理委员会批准。
1. 肾小球标记与组织制备
- 肾小球标记
- 将FITC-葡聚糖（10 mg）按1:1比例（1 mg:1 mL）溶解于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制工作探针溶液。
注意：工作溶液可在4 °C保存1个月。 - 将C57小鼠置于小鼠尾静脉固定器中。用热水浸湿纱布，包裹小鼠尾部中段，加热尾部1分钟。
- 用75%乙醇擦拭小鼠尾部，直至左右尾静脉清晰可见。
- 用1 mL胰岛素注射器吸取100 µL工作探针溶液，缓慢注入小鼠尾静脉。
- 注射后，让探针溶液循环30分钟。在此期间允许小鼠在笼内自由活动。
- 待探针充分循环后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（1%，60–80 µg/kg）对小鼠进行深度麻醉。
- 将FITC-葡聚糖（10 mg）按1:1比例（1 mg:1 mL）溶解于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制工作探针溶液。
- 肾脏取样与固定
- 将麻醉后的小鼠仰卧位固定于解剖板上，用医用胶带固定其四肢。
- 完成皮肤准备后，注射致死剂量的戊巴比妥钠（1%，10 mg/kg）实施安乐死。
- 沿腹中线做切口，暴露腹腔。
- 暴露肾脏后，在通风橱内使用手....
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结果
本研究提供了一种简单高效的小鼠肾脏肾小球标记与分析方法。
通过血管内注射 FITC-葡聚糖可对肾小球（血管）进行良好标记。经过透明化处理后，肾脏变得透明（图 1A），可利用光片显微镜（图 1B）或共聚焦显微镜（图 1C）清晰观察到肾小球。共聚焦显微镜的扫描深度有限，因此肾脏应被切成约 1 mm 厚的切片。若使用光片显微镜，则可直接对整个肾脏进行扫描。
由于信号清晰，肾小球数量易于计数。实际上，标记效果非常显著，仅凭肉眼即可完成肾小球计数。肾小球的体积也可直接测量。当然，使用 Imaris 等软件可极大加快这一过程。利用 Surface 功能，可选取肾脏切片（图 2）、整个肾脏（图 3）或组织条带（<.......
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讨论
组织透明化技术可分为3类或4类29，30，31。基于有机溶剂的组织透明化方法（如DISCO和PEGASOS）、基于水相的组织透明化方法（如CUBIC）以及基于水凝胶包埋的组织透明化方法（如CLARITY）均已应用于肾脏组织的透明化处理25，26，28，32。正如我们所证实的，当肾小球（血管）使用FITC-葡聚糖标记时，CUBIC方法的效果最佳。此外，CUBIC的操作流程相对更为简便，且仅需普通的显微镜物镜27，因为处理后的样品无需浸泡在有机试剂中33。然而，不同的透明化方法及血管标记方法各有优缺点，研究人.......
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披露
所有作者均声明无利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金（82204951）和四川省科技计划项目（2020JDRC0102）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% PFA | Biosharp | 7007171800 | 固定剂 |
| 502 胶 | Deli | 7146 | 用于将肾脏固定在样本固定适配器上 |
| 安替比林 | Aladdin | A110660 | 透明试剂 |
| 脑切片模具 | RWD Life Science | 1mm 40-75 | 组织切片 |
| 共聚焦显微镜 | Nikon | A1plus | 图像采集 |
| 异硫氰酸荧光素-葡聚糖 | Sigma-Aldrich | FD150S | 标记试剂 |
| 光片荧光显微镜 | Zeiss | Light sheet 7 | 图像采集 |
| 小鼠 | Ensiweier | 成年 C57BL/6 小鼠（6 周龄，25–30 g） | |
| N-丁基二乙醇胺 | Aladdin | B299095 | 透明试剂 |
| 烟酰胺 | Aladdin | N105042 | 透明试剂 |
| 戊巴比妥钠 | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| 尾静脉固定器 | JINUOTAI | JNT-FS35 | 固定小鼠以进行尾静脉注射 |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 透明试剂 |
参考文献
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Hum....
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重印与许可
