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一种高效快速的小鼠肾小球标记与分析方法

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DOI：

10.3791/65973

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2024年2月9日

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1Key Laboratory of Transplant Engineering and Immunology, NHFPC, West China Hospital, Sichuan University, 2Core Facility of West China Hospital, Sichuan University, 3Regenerative Medicine Research Center, West China Hospital, Sichuan University

本文内容

摘要

本研究提供了一套易于使用、完整且简便的方法，用于标记和分析经CUBIC透明化处理的小鼠肾脏中的肾小球。利用异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖、光片荧光显微镜（LSFM）或常见的共聚焦显微镜，结合Imaris等软件，可轻松、可靠地获取肾小球数量和体积等数据。

摘要

肾小球是肾脏的基本功能单位，因此研究肾小球对于理解肾脏功能与病理机制至关重要。生物学成像能够提供直观的信息，因此对肾小球进行标记和观察具有重要意义。然而，目前常用的肾小球观察方法操作复杂，且结果可能丢失标记细节或三维（3D）信息。透明化脑成像鸡尾酒试剂与计算分析（CUBIC）组织透明化技术已在肾脏研究中广泛应用，可实现更精确的检测和更深的成像深度。我们发现，通过尾静脉注射中等分子量的FITC-葡聚糖，结合CUBIC透明化方法，可快速有效地标记小鼠肾小球。经透明化处理的小鼠肾脏可通过光片显微镜（或切片后使用共聚焦显微镜）扫描，获得整个肾脏中所有肾小球的三维图像序列。通过适当的软件处理，肾小球信号可被轻松数字化，并进一步分析以测定肾小球的数量、体积及其分布频率。

引言

肾小球的数量和体积对于多种肾脏疾病的诊断和治疗具有重要意义1,2,3,4,5。估算肾小球数量的金标准是物理分割器/分层器组合法。然而，该方法需要特殊的试剂和设备，导致其操作缓慢且成本高昂6,7,8,9。肾活检可提供大量信息，但显然该方法仅适用于粗略估计10,11。医学成像技术，包括磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）和X射线，也广泛应用于肾小球检测12,13,14,15，但这些技术需要大型仪器。一些新方法，如基质辅助激光解吸/电离（MALDI）成像质谱仪16或厚薄切片法17，也已被用于肾小球检测，但仍存在操作繁琐且费力的问题。

借助透明化技术，可以观察到更深层的组织，并从厚组织甚至完整器官中获取更丰富、更完整的信息18,19,20,21,22,23。因此，透明化技术已在肾脏研究中得到广泛应用24。在透明化肾脏中对肾小球的观察与检测也已成为研究内容之一。然而，已发表的文献中，要么仅简要提及肾小球检测25，要么采用难以实现的标记方法，例如转基因动物26、自制染料13或高浓度抗体孵育27来标记肾小球。此外，尽管已有研究对透明化肾脏中的肾小球进行了分析，但这些分析通常存在局限性13，或依赖于研究者自行建立的分析算法26。

我们此前已展示了一种更为便捷的小鼠肾脏肾小球标记方法28。通过使用 Imaris，我们发现可快速获取肾小球的数量、频率和体积。因此，本文提供了一套更为简便、全面且简化的技术流程，用于小鼠肾脏肾小球的标记与分析。

方案

本研究使用成年C57BL/6小鼠（6周龄，25-30 g）。所有操作均遵循当地有关动物福利和实验伦理的法规。本研究经四川大学华西医院生物医学研究伦理委员会批准。

1. 肾小球标记与组织制备

  1. 肾小球标记
    1. 将FITC-葡聚糖（10 mg）按1:1比例（1 mg:1 mL）溶解于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制工作探针溶液。
      注意：工作溶液可在4 °C保存1个月。
    2. 将C57小鼠置于小鼠尾静脉固定器中。用热水浸湿纱布，包裹小鼠尾部中段，加热尾部1分钟。
    3. 用75%乙醇擦拭小鼠尾部，直至左右尾静脉清晰可见。
    4. 用1 mL胰岛素注射器吸取100 µL工作探针溶液，缓慢注入小鼠尾静脉。
    5. 注射后，让探针溶液循环30分钟。在此期间允许小鼠在笼内自由活动。
    6. 待探针充分循环后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（1%，60–80 µg/kg）对小鼠进行深度麻醉。
  2. 肾脏取样与固定
    1. 将麻醉后的小鼠仰卧位固定于解剖板上，用医用胶带固定其四肢。
    2. 完成皮肤准备后，注射致死剂量的戊巴比妥钠（1%，10 mg/kg）实施安乐死。
    3. 沿腹中线做切口，暴露腹腔。
    4. 暴露肾脏后，在通风橱内使用手术刀和剪刀取出肾脏，并轻柔去除肾包膜。
    5. 收集肾脏组织，于4%多聚甲醛（PFA）中4 °C条件下过夜固定。
    6. 用PBS在室温（RT）下振荡洗涤样本，每次1小时，共洗涤三次。
    7. 制备用于显微成像的肾脏样本。
      1. 用于共聚焦显微镜的肾脏切片：使用脑切片模具（1 mm不锈钢，40–75 g）将肾脏切成1 mm厚的切片，以标准化切片厚度。将切片转移至4% PFA中，继续在4 °C条件下过夜固定。
      2. 用于光片显微镜的完整肾脏：将肾脏在4% PFA中4 °C条件下固定48小时。

2. 透明化

  1. 试剂准备
    1. 通过混合10% (wt/wt) N-丁基二乙醇胺、10% (wt/wt) Triton X-100 和80% ddH2O，配制CUBIC-L试剂。
    2. 通过混合45% (wt/wt) 安替比林、30% (wt/wt) 烟酰胺、0.5% (vol/vol) N-丁基二乙醇胺和24.5% ddH2O，配制CUBIC-R试剂。确保溶液pH为9.6–9.8，折射率（RI）为1.522。
      NOTE: CUBIC-L用于脱脂，CUBIC-R用于折射率匹配。
  2. 透明化处理流程
    1. 将肾脏样本收集至50 mL离心管中，加入CUBIC-L试剂，在37 °C、60 rpm条件下振荡透明化。每4小时（肾组织切片）或每24小时（完整肾脏）更换一次CUBIC-L，直至获得满意的光学透明度。
      ​NOTE: 此过程对肾组织切片需1天，对完整肾脏需5天。
    2. 在室温下用PBS轻柔振荡洗涤样本3次，每次1小时。
    3. 向样本中加入CUBIC-R试剂，在37 °C、60 rpm条件下振荡6小时。
    4. 可直接观察透明化后的样本，或将其置于装有CUBIC-R的避光管中，室温保存1周。

3. 图像采集

  1. 共聚焦成像
    注意：使用共聚焦显微镜对肾脏切片样本进行成像（物镜：A Plan Apo λ 4×/0.2 N1 或 Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1 物镜）。采集带有Z轴堆栈的大视野图像（例如，肾脏切片为 6052 µm × 6052 µm）。
    1. 按以下顺序开启共聚焦显微镜：激光电源、共聚焦控制开关、计算机、显微镜主机和共聚焦硬件。运行自检程序后，启动共聚焦软件。
    2. 选择合适的物镜。将样本从CUBIC-R试剂中取出，放入共聚焦培养皿中，并加盖以防止CUBIC-R试剂干燥。
    3. 将样本移至视野中央，并调节焦平面直至图像清晰。
    4. 执行三维重建（步骤 3.1.4.1）和大图像重建（步骤 3.1.4.2–3.1.4.3）。
      1. 三维重建（共聚焦）：将缩放平面沿一个方向移动，直到荧光信号不可见，此位置定义为顶部；然后将缩放平面沿相反方向移动，直到荧光信号再次不可见，此位置定义为底部。点击对话框右下角的 运行 按钮以开始扫描。
      2. 大图像重建（共聚焦）：将视野移至样本中央，并将当前位置设为中心。选择 2 × 2 的视野范围。
      3. 在 ND 多功能界面中，选择 Z 轴堆栈 以重建大图像，并在面板中设置不同参数。然后按下 运行 按钮以开始扫描。
  2. 光片荧光显微镜（LSFM）成像
    注意：使用光片荧光显微镜对完整肾脏进行成像（物镜：EC Plan-Neofluar 5×/0.16（中等折射率 n = 1.529）物镜）。
    1. 样本固定（LSFM）：
      1. 将透明化的肾脏粘附到样本固定适配器上，并等待其牢固附着。
      2. 将肾脏浸入样本槽中，并将样本槽推入显微镜系统。关闭舱门。
    2. 观察与扫描（LSFM）：
      1. 在 定位 界面中，将样本移动至合适的观察位置。切换至 采集 界面，设置光路，选择 488 nm 激光、LBF 405/488/561/640，光学分光滤光片模块选择 SBS LP 490，选择 相机 2，并将伪彩色调整为绿色。
      2. 在 通道 子菜单中填入先前记录的 左/右 Z 轴偏移 值。选择最小缩放倍数（0.36），并微调以获得最大清晰度。
    3. 确定整个器官的 X、Y 边界及 Z 轴范围。调节激光强度和曝光时间（建议小于 10 ms），点击 运行 开始扫描。
    4. 如果组织过大，可通过图像拼接合并两张或多张图像。使用显微镜软件（此处为 ZEISS ZEN 3.7）打开采集的文件。依次选择 处理 > 方法 > 拼接 > 方法参数 > 应用 完成图像拼接。

4. 数据处理与定量分析

注意：使用 Imaris（图像分析）软件处理图像堆栈，利用Surface功能标记肾小球并进行分析。

  1. 肾小球计数
    1. 将大图像（共聚焦显微镜图像）或拼接图像（光片显微镜图像）导入图像分析软件。
    2. 在图像分析软件中打开文件。点击 Surface 按钮以创建新的表面。按照屏幕左下角的引导进行操作。
      1. 不勾选任何选项，直接点击 Next 按钮（右箭头按钮）。
      2. 勾选 Smooth 选项前的复选框，并输入适当的数值（例如 14.5），以控制表面的细节程度。在 Thresholding 中选择 Background Subtraction，并在输入框中填写肾小球的近似平均直径。点击 Next 按钮。
      3. 如有需要可进行调整，然后点击 Next 按钮。选择合适的范围后，再次点击 Next 按钮以生成表面。
    3. 点击 Filter，然后点击 Add 按钮，添加 Sphericity 以过滤非球形物体。点击 Duplicate 按钮复制此新表面。
    4. 点击 Statistics 按钮，然后点击 Overall 按钮；软件将显示肾小球的数量，即 Total Number of Surface。
  2. 肾小球体积
    1. 如上所述创建肾小球的表面。
    2. 当表面创建完成后，点击 Selection 按钮以选择目标对象，并显示每个对象的体积。点击 Save 按钮，将统计数据导出至电子表格以供进一步分析。
  3. 组织切片或整个肾脏的体积
    1. 将大图像（共聚焦显微镜图像）或拼接图像（光片显微镜图像）导入图像分析软件。
    2. 在图像分析软件中打开文件。点击 Surface 按钮以创建新的表面。按照屏幕左下角的引导进行操作。
      1. 不进行任何勾选，直接点击 Next 按钮（右箭头按钮）。
      2. 勾选 Smooth 选项前的复选框，并输入适当的数值（例如 50），以控制表面的细节程度。在 Thresholding 中选择 Absolute Intensity。点击 Next 按钮。
      3. 调整表面直至其覆盖整个组织，然后点击 Next 按钮。再次点击 Next 按钮以创建表面。
    3. 点击 Selection 按钮以选择整个组织的表面，并显示组织的体积。点击 Save 按钮，将统计数据导出至电子表格。

结果

本研究提供了一种简单高效的小鼠肾脏肾小球标记与分析方法。

通过血管内注射 FITC-葡聚糖可对肾小球（血管）进行良好标记。经过透明化处理后，肾脏变得透明（图 1A），可利用光片显微镜（图 1B）或共聚焦显微镜（图 1C）清晰观察到肾小球。共聚焦显微镜的扫描深度有限，因此肾脏应被切成约 1 mm 厚的切片。若使用光片显微镜，则可直接对整个肾脏进行扫描。

由于信号清晰，肾小球数量易于计数。实际上，标记效果非常显著，仅凭肉眼即可完成肾小球计数。肾小球的体积也可直接测量。当然，使用 Imaris 等软件可极大加快这一过程。利用 Surface 功能，可选取肾脏切片（图 2）、整个肾脏（图 3）或组织条带（图 4）中的全部肾小球，并直接获取肾小球的数量和体积（图 2C、图 3C、图 4C）。所选区域的体积也可同时测量（图 2B、图 3B、图 4B），从而可计算特定区域或整个肾脏中肾小球的体积比和频率（图 2D、图 3D、图 4D）。可选择肾脏的特定区域进行局部计算。我们展示了一条类似于活检样本的组织条带，其中肾小球的数量、体积和频率也可轻松获得（图 4）。

如图所示，本研究中呈现的结果为（N = 数量，F = 频率，V = 体积，V(a) = 平均体积，V(t) = 总体积）：

N切片中的肾小球 = 1128, N完整肾脏中的肾小球 = 14006, F肾小球切片 每毫米65个3，F肾小球在完整肾脏中的分布 = 105 每平方毫米3，V切片中总肾小球数/切片 = 2.24%，V整个肾脏中的肾小球总数/肾脏 = 5.54%，V(a)切片中的肾小球 = 373654 µm3，V(a)完整肾脏中的肾小球 = 521627 µm3，V(t)切片中的肾小球 = 421481724 µm3，V(t)完整肾脏中的肾小球 = 7305386256 µm3 (图 2D, 图 3D).

条带中肾小球数量 Nglomeruli in strip = 63，条带中肾小球密度 Fglomeruli in strip = 每 mm3 72 个，条带中肾小球总体积与条带体积比 Vtotal glomeruli in strip/Vstrip = 2.23%，条带中单个肾小球平均体积 V(a)glomeruli in strip = 307698 µm3，条带中肾小球总体积 V(t)glomeruli in strip = 19384977 µm3（图 4D）。

动态平衡；豆类图像分析；荧光显微镜；治疗前后比较。
图1：肾脏组织透明化及FITC-葡聚糖标记的肾小球。（A）肾脏组织透明化处理前后的对比。（B）使用光片荧光显微镜（LSFM）扫描的完整肾脏图像。（C）共聚焦显微镜扫描的肾脏切片图像（左：4倍，右：10倍）。比例尺 = 300 µm（4倍，共聚焦）；比例尺 = 100 µm（10倍，共聚焦）；比例尺 = 700 µm（5倍，缩放0.36，LSFM）。肾小球使用FITC-葡聚糖进行标记。请点击此处查看该图的高清版本。

三维细胞分析，显微镜中定量数据提取，体积测量，示意图。
图 2：共聚焦扫描的肾组织切片应用“表面”功能的结果。（A）生成了切片及所有肾小球的表面结构。粉色 = 肾小球，蓝色 = 肾组织切片的外表面，绿色 = 血管的原始标记（包括肾小球和部分大血管）。比例尺 = 300 µm。（B）当选中切片表面（左侧）或肾小球（右侧）时（被选中的对象会变为黄色），可直接获取相应数据（虚线框突出显示数据展示位置）。（C）可直接获得每个肾小球的数量、单个体积、总体积，以及整个切片的体积。（D）导出的数据可进一步分析，从而计算出肾小球的平均体积、肾小球体积与选定区域体积的比值等参数。请点击此处查看该图的放大版本。

肾脏体积分析示意图；三维可视化、数据图表、肾小球体积计算结果。
图3：应用于光片荧光显微镜（LSFM）扫描的完整肾脏的“表面”功能。（A）生成完整肾脏及所有肾小球的表面结构。粉色 = 肾小球，蓝色 = 完整肾脏的外表面，绿色 = 血管的原始标记（肾小球和部分大血管）。比例尺 = 1000 µm。（B）当选中肾脏表面（左侧）或肾小球（右侧）时（被选中的对象将变为黄色），可直接获取数据（虚线框突出显示数据展示区域）。（C）可直接获得每个肾小球的数量、单个体积以及肾小球总数，同时也能获得肾脏总体积。（D）导出的数据可进一步分析，从而计算出肾小球平均体积、肾小球体积与整个肾脏体积的比值等参数。请点击此处查看该图的放大版本。

肾小球体积分析；三维建模与数据指标；示意图展示体积计算方法。
图4：应用于选定肾组织条的“表面”功能。（A）生成组织条及所有肾小球的表面结构。粉色 = 肾小球，蓝色 = 肾组织条的外表面，绿色 = 血管的原始标记（包括肾小球及部分大血管）。比例尺 = 150 µm。（B）当选中组织条的表面（左）或肾小球（右）时（被选中的对象将变为黄色），可直接获取相关数据（虚线框突出显示数据展示位置）。（C）可直接获得肾小球的数量、每个肾小球的体积、肾小球总体积以及组织条的体积。（D）导出的数据可进一步分析，从而计算肾小球的平均体积以及肾小球体积与选定区域体积的比值。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

组织透明化技术可分为3类或4类29，30，31。基于有机溶剂的组织透明化方法（如DISCO和PEGASOS）、基于水相的组织透明化方法（如CUBIC）以及基于水凝胶包埋的组织透明化方法（如CLARITY）均已应用于肾脏组织的透明化处理25，26，28，32。正如我们所证实的，当肾小球（血管）使用FITC-葡聚糖标记时，CUBIC方法的效果最佳。此外，CUBIC的操作流程相对更为简便，且仅需普通的显微镜物镜27，因为处理后的样品无需浸泡在有机试剂中33。然而，不同的透明化方法及血管标记方法各有优缺点，研究人员可能需要尝试多种方法以满足其特定的研究需求。

既往研究注意到，当肾脏血管被标记时，在透明化肾脏中可观察到肾小球被标记13,25,26,28。这一现象的详细机制仍有待进一步研究，但可以推断，一种有效的血管系统标记方法同样能有效标记肾小球。根据实验结果，我们推荐使用中等分子量（如150 kDa）的FITC-葡聚糖进行血管内注射。然而，由于标记依赖于血液循环，当肾小球缺乏血流时，该方法可能无法实现对其标记。

光片显微镜（LSFM）能够实现大范围组织观察，因此更适合全肾肾小球的检测。然而，并非每个实验室都具备光片显微镜。因此，我们提供了一套使用普通共聚焦显微镜的替代方案。尽管肾脏需要被切成多个切片，但仍可获得全肾肾小球数量和体积等数据。此外，共聚焦显微镜产生的数据量较小，更便于数据处理。

Imaris 可提供直接的数据输出。然而，应注意使模拟信号与原始数据尽可能接近。此外，该软件处理大型文件可能需要较长时间，这可能会令人感到困扰。只要能够清晰地标记和可视化肾小球，数据处理就存在多种独特的解决方案。不同实验室的研究人员可以使用各自熟悉的软件和编程语言进行工作。

披露

所有作者均声明无利益冲突。

致谢

本研究由国家自然科学基金（82204951）和四川省科技计划项目（2020JDRC0102）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4% PFABiosharp7007171800固定剂
502 胶 Deli7146用于将肾脏固定在样本固定适配器上 
安替比林AladdinA110660透明试剂
脑切片模具RWD Life Science1mm 40-75组织切片
共聚焦显微镜NikonA1plus图像采集
异硫氰酸荧光素-葡聚糖Sigma-AldrichFD150S标记试剂
光片荧光显微镜 ZeissLight sheet 7 图像采集
小鼠Ensiweier成年 C57BL/6 小鼠（6 周龄，25–30 g） 
N-丁基二乙醇胺AladdinB299095透明试剂
烟酰胺AladdinN105042透明试剂
戊巴比妥钠Sigma-AldrichP3761
尾静脉固定器JINUOTAIJNT-FS35固定小鼠以进行尾静脉注射
吐温 X-100Sigma-AldrichT8787透明试剂

参考文献

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