磁珠分选法从鼠类分离血管壁定居的CD34+干细胞

摘要

本研究建立了一种稳定且高效的血管壁驻留CD34⁺干细胞（CD34⁺ VW-SCs）的分离、培养及功能鉴定方法。这种易于操作且节省时间的分离方法可被其他研究者用于探讨心血管疾病中的潜在机制。

摘要

定居于血管壁的CD34⁺ 血管壁定居干细胞和祖细胞（VW-SCs）在调控血管损伤与修复过程中的关键作用正日益受到重视。建立一种稳定且高效的培养功能性小鼠CD34⁺ VW-SCs的方法，对于进一步研究这些细胞在不同生理和病理条件下增殖、迁移及分化机制至关重要。本方法结合磁珠分选与流式细胞术，用于纯化原代培养的定居型CD34⁺ VW-SCs。纯化后的细胞通过免疫荧光染色和Ca²⁺成像进行功能鉴定。简言之，通过组织块贴壁法获取小鼠主动脉和肠系膜动脉外膜来源的血管细胞，并经传代培养至细胞数量至少达到1 × 10⁷。随后，利用磁珠分选和流式细胞术对CD34⁺ VW-SCs进行纯化。CD34⁺ VW-SCs的鉴定采用细胞免疫荧光染色，而其功能多向分化潜能则通过特定诱导分化培养基处理来确定。此外，使用商用成像工作站，对负载Fura-2/AM的细胞在ATP、咖啡因或毒胡萝卜素（TG）刺激下，检测其功能性胞内Ca²⁺释放和胞外Ca²⁺内流。该方法为分离、培养和鉴定血管壁定居的CD34⁺干细胞提供了一种稳定且高效的技术平台，有助于开展VW-SCs调控机制的in vitro研究以及靶向药物的筛选。

引言

血管壁在血管发育、稳态调节以及血管疾病进展中发挥着关键作用。近年来，大量研究揭示了动脉中存在多种干细胞谱系。2004年，徐清波教授团队首次报道在成年个体血管壁外周存在表达CD34、Sca-1、c-kit和Flk-1的血管干细胞/祖细胞¹。这些血管干细胞具有多向分化和增殖潜能。在正常情况下，它们处于相对静息状态；然而，在特定因子激活下，可分化为平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。此外，它们还可通过旁分泌效应调控血管周围基质及微血管形成，促进受损血管的修复或重塑^2,3,4,5,6。最近研究发现，血管壁内定居的CD34⁺干细胞在股动脉导丝损伤后参与了内皮细胞的再生过程²。因此，分离和定量CD34⁺血管壁干细胞（VW-SCs），并检测CD34⁺干细胞的基本生物学特性，对于进一步研究调控CD34⁺ VW-SCs的信号通路至关重要。

目前已有多种细胞分离方法，包括基于细胞培养特性或细胞物....

方案

本研究已获得批准，动物饲养和操作均遵循《中国实验动物管理和使用指南》。研究严格遵守动物实验伦理要求，并已获得西南医科大学动物伦理委员会的批准（批准号：SWMU2020664）。本研究采用8周龄健康C57BL/6小鼠，雌雄不限，体重为18–20 g。动物饲养于西南医科大学（SWMU）实验动物中心。

1. 主动脉和肠系膜动脉外膜组织块培养

1. 组织驻留型CD34⁺ VW-SCs 的分离
   1. 用3%异氟烷吸入麻醉两只小鼠（遵循机构批准的方案）。通过夹捏脚趾确认麻醉充分。用医用胶带将小鼠仰卧固定，喷洒70%乙醇消毒液对小鼠皮毛进行消毒。使用无菌眼科剪刀和镊子打开胸腔和腹腔，暴露心脏和肠道。分离出独立的主动脉和肠系膜动脉后，将主动脉和肠系膜血管床固定于含硅胶弹性体并盛有生理盐溶液的培养皿中。用另一套灭菌的剪刀和镊子，迅速剥离主动脉和肠系膜动脉周围的脂肪组织。
   2. 将解剖得到的组织转移至含有1%青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的6 cm培养皿中（参见 材料表用PBS缓冲液冲洗两次后，将动脉转移至体视显微镜下的组织培养超净台中。
   3. 纵向切开动脉，用精细镊子剥离主动脉和肠系膜动脉第一分支的外层组织。将外层组织转移至一个含有 0.1–0.2 mL 培养基的 3.5 cm 培养皿中（参见 材料表）。....

结果

CD34⁺ 血管壁干细胞（VW-SCs）的分离与纯化
通过组织贴壁法结合磁珠分选技术，可从小鼠胸主动脉和肠系膜动脉的外膜中获得高纯度的 CD34⁺ VW-SCs。血管壁中 CD34⁺ 细胞的比例通常为 10%–30%。流式细胞术证实，经磁珠分选获得的 CD34⁺ 细胞纯度超过 90%（图 1A）。细胞免疫荧光染色显示，CD34⁺ VW-SCs 主要表达 CD34、c-kit、Flk-1 和 Ki-67，而 Sca-1 的表达水平相对较低（图 1B）。

CD34⁺ 血管壁干细胞的分化
CD34⁺ 血管壁干细胞（VW-SCs）可在体外分化为内皮细胞和成纤维细胞。in vitro条件下，CD34⁺.......

讨论

本研究提供了一种从小鼠主动脉和肠系膜动脉中快速、便捷地获取功能性CD34⁺血管壁干细胞（VW-SCs）的方法。通过该方法获得的CD34⁺ VW-SCs具有增殖活性和多向分化潜能。三磷酸肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP₃Rs）、雷诺丁受体（RyRs）以及内质网钙库操纵性钙通道介导了CD34⁺ VW-SCs中的Ca²⁺释放与内流。该技术的建立将为进一步研究CD34⁺ VW-SCs在心血管疾病结构与功能重塑中所参与的机制奠定基础。

原代细胞分离最常用的方法包括组织块贴壁法和酶消化法^15,16在本报告中，通过结合组织块附着与磁珠分选技术，获得高纯度的CD34⁺ VW-SCs。经分选的血管壁CD34⁺ 干细胞表达 CD34，少数表达内皮细胞标志物 CD31，这与既往报道一致

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2% 明胶溶液	Sigma	G1393
抗 CD31 抗体	R&D	AF3628
抗 CD34 抗体	Abcam	ab81289
抗 c-kit 抗体	CST	77522
抗 FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
抗 FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
抗 Flk-1 抗体	Abcam	ab24313
抗 Ki67 抗体	CST	34330
抗 PDGFRα 抗体	Abcam	ab131591
抗 Sca-1 抗体	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) 单克隆抗体 (APA5)，FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) 单克隆抗体 (390)，APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 抗体，抗小鼠，FITC，REAfinity 克隆 REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
细胞培养罩	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
离心机	CENCE	L530
CO2 培养箱	Thermofisher Scientific	4111
共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss	zeiss 980
DMEM 高糖培养基	ATCC	30-2002
EBM-2 培养基	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ 系统	BD
胎牛血清	Millipore	ES-009-C
FM-2 培养基	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
白血病抑制因子	Millipore	LIF2010
显微镜	Olympus	IX71
MiniMACS   起始试剂盒	Miltenyi Biotec	130-090-312
青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液	Beyotime	C0224
纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭剂）	BD Pharmingen	553141
体视显微镜	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 程序	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF 单克隆抗体 (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-巯基乙醇	Thermofisher Scientific	21985023