从小鼠中免疫磁性分离血管壁驻留的 CD34+ 干细胞

Summary

本研究为血管壁驻留CD34⁺ 干细胞（CD34⁺ VW-SCs）的分离、培养和功能测定建立了一种稳定高效的方法。这种易于遵循且省时的分离方法可以被其他研究人员用来研究心血管疾病涉及的潜在机制。

Abstract

驻留 CD34⁺ 血管壁驻留干细胞和祖细胞 （VW-SCs） 因其在调节血管损伤和修复中的关键作用而日益得到认可。建立一种稳定有效的方法培养功能性小鼠CD34⁺ VW-SCs对于进一步研究这些细胞在各种生理和病理条件下的增殖、迁移和分化机制至关重要。所述方法结合磁珠筛选和流式细胞术纯化原代培养的驻留 CD34⁺ VW-SCs。然后通过免疫荧光染色和 Ca²⁺ 成像对纯化的细胞进行功能鉴定。简而言之，来自鼠主动脉和肠系膜动脉外膜的血管细胞是通过组织阻滞附着获得的，然后进行传代培养，直到达到至少 1 × 10⁷ 的细胞计数。随后，使用磁珠分选和流式细胞术纯化CD34 ⁺ VW-SCs。CD34⁺ VW-SCs 的鉴定涉及细胞免疫荧光染色，而功能多能性是通过将细胞暴露于特定培养基进行定向分化来确定的。此外，在暴露于 ATP、咖啡因或 thapsigargin （TG） 的 Fura-2/AM 负载细胞中，使用商用成像工作站评估功能性内部 Ca²⁺ 释放和外部 Ca²⁺ 进入。该方法为分离、培养和鉴定血管壁驻留CD34⁺ 干细胞提供了一种稳定高效的技术，为VW-SCs调控机制的 体外 研究和靶向药物的筛选提供了机会。

Introduction

血管壁在血管发育、稳态调节和血管疾病的进展中起着关键作用。近年来，许多研究揭示了动脉中存在各种干细胞谱系。2004年，徐清波教授课题组首次报道了成体血管壁外围存在血管干/祖细胞，表达CD34、Sca-1、c-kit和Flk-1¹。这些血管干细胞表现出多向分化和增殖潜力。在正常情况下，它们保持相对静止;然而，当被特定因素激活时，它们可以分化成平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。或者，它们可以通过旁分泌效应调节血管周围基质和微血管的形成，以促进受伤血管的修复或重塑 2,3,4,5,6。最近，发现血管壁中的常驻CD34⁺干细胞在股动脉导^{丝损伤后的}内皮细胞再生中起作用2。因此，CD34⁺ VW-SCs的分离和定量以及CD34⁺干细胞基本生物学特性的检验对于进一步研究CD34⁺ VW-SCs调控过程中的信号通路至关重要。

目前有多种细胞分离方法可用，包括基于细胞培养特性或细胞物理特性的技术，例如密度梯度离心法，该方法导致分选的细胞含有许多非靶细胞和相对较低的^纯度7,8,9,10,11,12 .另一种常用的技术是荧光/磁性辅助细胞分选。荧光激活细胞分选 （FACS） 是一个技术要求高的复杂系统，它相对昂贵、耗时，并且可能会影响分选细胞的活性^13,14。然而，磁激活细胞分选（MACS）更高效、更方便，具有高回收率和细胞活性，对下游应用的影响较小⁸.因此，在该方案中，我们应用MACS纯化CD34 ⁺ VW-SCs，并通过流式细胞术进一步鉴定细胞。建立基于MACS的分离方法用于研究血管壁干细胞将是非常宝贵的。首先，它允许实验性遗传和细胞生物学研究。其次，通过对血管壁驻留干细胞进行高效分离和培养，可以系统地评估和筛选调节干细胞功能的信号因子。第三，鉴定干细胞中的关键表型为评估细胞状态提供了重要的"质量控制"。因此，鉴定纯化方法可能可用于与源自血管的类似干细胞的类似应用。

本报告详细演示了一种稳定可靠的 CD34⁺ VW-SC 培养方法，包括通过流式细胞术、免疫荧光染色和 Ca²⁺ 信号转导测量进行的细胞鉴定和功能评估。本研究为进一步深入研究CD34⁺ VW-SCs在生理和病理条件下的功能及其调控机制提供了基础。

Protocol

本研究获得批准，并按照《中国实验动物管理使用指南》对动物进行处理。本研究严格遵守动物实验的伦理要求，并经动物伦理委员会批准（批准文号:SWMU2020664）。本研究使用8周龄的健康C57BL / 6小鼠，体重在18-20g之间。这些动物被安置在西南医科大学（SWMU）的实验动物中心。

1. 来自主动脉和肠系膜动脉的外膜组织阻滞培养

1. 常驻 CD34⁺ VW-SCs 隔离
   1. 用3%异氟烷吸入麻醉两只小鼠（遵循机构批准的方案）。通过捏脚趾确认充分麻醉。用医用胶带将小鼠置于仰卧位，并喷洒 70% 乙醇消毒剂以消毒小鼠的皮毛。使用无菌眼科剪刀和镊子打开胸腔和腹腔，露出心脏和肠道。解剖分离的主动脉和肠系膜动脉后，将主动脉和肠系膜床固定在含有硅弹性体的培养皿中，并填充有生理盐溶液。用另一套消毒的剪刀和镊子，迅速解剖主动脉和肠系膜动脉周围的脂肪。
   2. 将解剖的组织转移到含有1%青霉素 - 链霉素 - 两性霉素B溶液的6cm培养皿中（参见 材料表）。冲洗两次后，将动脉转移到立体显微镜下的组织培养罩中。
   3. 纵向切开动脉，用细镊子剥去主动脉的外层和肠系膜动脉的第一分支。将外层转移到含有 0.1-0.2 mL 培养基的 3.5 cm 培养皿中（参见 材料表）。将外层切成小块（约 1 mm³）。
   4. 将组织块转移到明胶包被的 T25 烧瓶中，确保在烧瓶底部均匀分布。在组织块之间保持适度的距离，以促进细胞爬行和生长。将烧瓶垂直置于培养箱（37°C，5%CO₂）中3小时，以使组织块粘附在烧瓶底部。
   5. 3小时后，加入5mL DMEM高葡萄糖生长培养基以浸没组织块。水平放置 T25 烧瓶。每隔 3 天通过显微镜监测组织块周围的细胞迁移。
      注:培养基应含有 20% 胎牛血清、0.2% 白血病抑制因子 （LIF）、0.2 mM β-巯基乙醇和 1% 青霉素/链霉素（参见材料表）。胎牛血清支持细胞增殖，而 LIF 和β-巯基乙醇阻碍细胞分化 ^7,8。
   6. 当 T25 烧瓶中的细胞达到约 80% 汇合时，将它们传代并培养到一个或两个 T75 烧瓶中。在五次传代中传代培养细胞，以确保正常生长和健康。
2. 常驻CD34⁺ 干细胞的磁性分离
   1. 当一个或两个 T75 烧瓶中的细胞达到 80% 汇合时，用胰蛋白酶解离细胞，并将它们重悬于 1 mL 分选缓冲液（2 mM EDTA 和 0.5% FBS）中。确定细胞数（10⁷ / T75烧瓶）并将细胞悬浮液以300× g 离心5分钟（在室温下）。
   2. 完全弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于每 10⁷ 个总细胞的 98 μL 分选缓冲液中。加入 2 μL CD34 抗体（参见 材料表）。充分混合，在 4°C 下在黑暗中孵育 30 分钟，偶尔摇晃。
   3. 通过加入 2 mL 分选缓冲液洗涤细胞，并在室温下以 300 x g 离心 10 分钟。
   4. 小心完全地取出上清液，并将细胞重悬于 80 μL 分选缓冲液中。
   5. 将 20 μL 抗 FITC MicroBeads（每 10⁷ 个细胞，参见 材料表）加入缓冲液中。通过重复移液充分混合，并在4°C下在黑暗中间歇性摇晃孵育15分钟。
   6. 通过加入 2 mL 缓冲液洗涤细胞两次，并以 300 x g 离心 5 分钟以重新沉淀细胞。完全弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL 缓冲液中。
   7. 将一根 MS 柱放置在适当分离器的磁场中，确保将收集管（例如，15 mL 离心管）放置在 MS 柱下方以收集分离的组分。（见 材料表）。用 500 μL 缓冲液冲洗色谱柱，并等待其完全流过。
   8. 将细胞悬浮液加载到色谱柱中，并将含有未标记细胞的流出物收集到 15 mL 管中。
   9. 从分离器中取出色谱柱，并将其放在新的 15 mL 离心管上。将 500 μL 缓冲液引入色谱柱中，然后通过将柱塞推入色谱柱，立即冲洗出磁性标记的细胞。
   10. 为了提高CD34⁺ 细胞的纯度，可以使用第二根MS色谱柱对洗脱的部分进行富集。重复上述分离过程。 通过 流式细胞术评估分选细胞的纯度。
       注:通常获得 10%-20% 的 CD34⁺ 细胞，约 70%-80% 的阴性细胞，以及约 10% 的损失，由于染色和离心程序。
   11. 为了进一步确认血管壁CD34⁺ 干细胞的纯度，通过流式细胞术鉴定分选的细胞。本研究表明纯度超过90%。

2. 免疫荧光细胞鉴定

1. 在预涂有0.04%明胶的盖玻片（直径8mm）上接种细胞。
2. 当细胞达到约60%-70%汇合时，用PBS冲洗两次，并用4%多聚甲醛固定细胞10分钟。
3. 用 PBS 洗涤细胞 3 分钟（3 次），并在室温下用 0.2% Triton X-100（在 PBS 中）透化细胞 5 分钟。
4. 用 PBS 洗涤细胞 3 分钟（3 次），并用 5% 驴血清（在 PBS 中）阻断抗体的非特异性结合 1 小时。
5. 用镊子将每个盖玻片在其边缘握住，然后将其排到一张无绒擦拭纸上，以去除阻塞缓冲液。
6. 将细胞在100倍稀释的一抗（CD34，Flk-1，c-kit，Sca-1，Ki67，参见 材料表）中在1%BSA（PBS中）中在4°C下孵育过夜。
7. 倒出溶液并用 PBS 洗涤细胞 3 分钟（3 次）。将细胞与 Alexa Fluor 488 标记的二抗（在 1% BSA 中以 1:200 的比例）（参见 材料表）在室温下在黑暗中孵育 1 小时。
8. 通过将 DAPI 储备溶液在 PBS 中稀释至 0.5 μg/mL 并将细胞孵育 5 分钟来进行 DAPI 复染。
9. 用PBS冲洗并用抗淬灭试剂密封盖玻片。在激光扫描共聚焦显微镜下捕获图像。

3. CD34⁺ VW-SCs的诱导分化和表征

1. 分别以适当的密度（40%-50%汇合度）将CD34 ⁺ 干细胞接种在盖玻片和6孔板上。
2. 通过在内皮细胞培养基 EBM-2 中培养细胞（参见材料表）1 周，诱导 CD34⁺ 细胞的内皮细胞定向分化。
3. 通过在成纤维细胞培养基FM-2（参见材料表）中培养细胞3天，诱导成纤维细胞定向从CD34 ⁺细胞分化。
4. 在488nm的激光激发和40x物镜下，将未分化和分化的细胞进行免疫荧光染色（如步骤2中所述）。检测内皮细胞标志物（CD31，VWF）和成纤维细胞标志物（PDGFRα，波形蛋白）的表达（参见 材料表）。
5. 用胰蛋白酶解离细胞，并通过离心（300× g，5分钟，室温）获得细胞沉淀。用 100 μL 分选缓冲液重悬细胞。将细胞悬浮液与纯化的抗小鼠CD16 / CD32单克隆抗体（1μg）（参见 材料表）在4°C下预孵育5分钟。
6. 在小鼠 Fc Block 存在下，将 2 μL PE 大鼠抗小鼠 CD34 （1:50）、CD31 （PECAM-1） 单克隆抗体 APC（2 μL，1:50）和 CD140a （PDGFRa） 单克隆抗体 FITC （2 μL，1:50） 直接加入预孵育细胞中，并在 4 °C 下进一步孵育 15 分钟。
7. 通过加入 2 mL 缓冲液洗涤细胞两次，并以 300 x g 离心 5 分钟（室温）以重新沉淀细胞。完全弃去上清液，将细胞重悬于 300 μL 缓冲液中。将装有染色细胞的流管放入准备进行流式细胞术的冰箱中。

4. 血管CD34⁺干细胞中细胞内Ca²⁺信号的检测

1. 在实验前10小时将细胞接种在盖玻片上，密度高达70%汇合。
2. 取出盖玻片，用任何凡士林将它们固定在定制室的底部。
3. 用PBS洗涤盖玻片一次，在Tyrode溶液（NaCl 137mM，KCl 5.4mM，MgCl₂ 1.2mM，葡萄糖10mM，HEPES 10mM，CaCl₂ 2.4mM）中用Fura-2 / AM（5μM）替换（参见 材料表），并在黑暗中孵育细胞30分钟。
4. 用Tyrode溶液处理10分钟以去除染料，以允许fura-2 / AM去酯化。
5. 将腔室安装在配备有包含单色仪和CCD相机的宽场成像系统的倒置荧光显微镜的载物台上（参见 材料表）。
6. 打开 主窗口，进入 "抓取设置 "对话框和相机页面，然后按 实时 按钮进行 实时 图像显示。
7. 选择荧光图像类型，将 340 nm/380 nm 循环重复时间、图像尺寸和相机曝光时间设置为 380 nm 和 340 nm，以实现最佳图像亮度。
8. 拍摄单个快照，并绘制几条手绘线，用不同的颜色圈出单元格，并预定义感兴趣区域 （ROI），将背景指示为 ROI 0。
9. 在工作区视图中重新编辑已嵌入的协议，并创建新的工作区。
10. 执行协议，"Fluorescence 340 nm div Fluorescence 380 nm （Live Kinetic）"将显示在线动力学图。
11. 在数值视图中，将看到一个电子表格，显示灰度值列和相应的时间信息。使用剪贴板导出电子表格数据。
12. 计算 F340 nm/F380 nm，表明减去背景荧光 （ROI 0） 后细胞内 Ca²⁺ 变化。

Results

CD34⁺ VW-SCs的分离纯化
CD34⁺ VW-SCs的高纯度是通过组织附着和磁性微珠分选从小鼠主动脉和肠系膜动脉的外膜中获得的。CD34⁺ 细胞在血管壁中的百分比一般为10%-30%。流式细胞术证实，通过磁珠分选获得的CD34⁺ 细胞的纯度超过90%（图1A）。细胞免疫荧光染色显示，CD34⁺ VW-SCs主要表达CD34、c-kit、Flk-1和Ki-67，Sca-1的表达相对较低（图1B）。

CD34⁺ VW-SCs的分化
CD34⁺ VW-SCs能够在体外分化为内皮细胞和成纤维细胞。CD34⁺干细胞可被诱导分化为内皮细胞，内皮细胞标志物CD31和VWF的表达增加。此外，分化的成纤维...

Discussion

本研究提供了一种从小鼠主动脉和肠系膜动脉中获取功能性CD34⁺ VW-SCs的快速便捷的方法。该方法得到的CD34⁺ VW-SCs具有增殖活性和多向分化特性。三磷酸肌醇 1,4,5-三磷酸受体 （IP₃Rs）、兰尼定受体 （RyRs） 和储存操作的钙通道介导 Ca²⁺ 释放和进入 CD34⁺ VW-SCs。该技术的建立将为进一步研究CD34⁺ VW-SCs参与心血管疾病结构和功能重塑的机制奠定基础。

原代细胞分离的最常见方法包括组织块附着和酶解离^15,16。在本报告中，将组织块附着和磁珠分选相结合，以获得高纯度的CD34⁺ VW-SCs。分选的血管壁CD34⁺干细胞CD34呈阳性，少数表达内皮细胞标志物CD31，与之前的报道一致²。此外，江等

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% 明胶溶液	Sigma	G1393
抗 CD31 抗体	R&D	AF3628
抗 CD34 抗体	Abcam	ab81289
抗 c-kit 抗体	CST	77522
抗 FITC 微珠	Miltenyi Biotec	130-048-701
抗 FITC 微珠 MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
抗 Flk- 1 抗体	Abcam	ab24313
抗 Ki67 抗体	CST	34330
抗 PDGFRα 抗体	Abcam	ab131591
抗 SCA- 1 抗体	Invitrogen	710952
CD140a （PDGFRA） 单克隆抗体抗体 （APA5）， FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 （PECAM-1） 单克隆抗体 （390）， APC	eBioscience Invitrogen	17-0311-82
CD34 抗体， 抗小鼠， FITC， REAfinity 克隆 REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
细胞培养罩	江苏苏晶集团有限公司	SW-CJ-2FD
离心机	森斯	L530
CO2 孵化器	Thermofisher Scientific	4111
共聚焦激光扫描显微镜	蔡司	蔡司 980
DMEM 高糖培养基	ATCC	30-2002
EBM-2 培养基	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™系统
胎牛血清	Millipore	ES-009-C
FM-2 培养基	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
山羊抗兔 IgG （H+L） 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488	赛默飞世尔科技	A32731
白血病抑制因子	Millipore	LIF2010
显微镜	奥林巴斯	IX71
MiniMACS  起始套件	Miltenyi Biotec	130-090-312
青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液	Beyotime	C0224
纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32 （小鼠 BD Fc 阻滞）	BD 药剂	553141
立体显微镜	奥林巴斯	SZX10
TILLvisION 4.0 程序	T.I.L.L.Photonics GmbH	多色 V
VWF 单克隆抗体 （F8/86）	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-巯基乙醇	Thermofisher Scientific	21985023