磁珠分选法从鼠类分离血管壁定居的CD34+干细胞

摘要

本研究建立了一种稳定且高效的血管壁驻留CD34⁺干细胞（CD34⁺ VW-SCs）的分离、培养及功能鉴定方法。这种易于操作且节省时间的分离方法可被其他研究者用于探讨心血管疾病中的潜在机制。

摘要

定居于血管壁的CD34⁺ 血管壁定居干细胞和祖细胞（VW-SCs）在调控血管损伤与修复过程中的关键作用正日益受到重视。建立一种稳定且高效的培养功能性小鼠CD34⁺ VW-SCs的方法，对于进一步研究这些细胞在不同生理和病理条件下增殖、迁移及分化机制至关重要。本方法结合磁珠分选与流式细胞术，用于纯化原代培养的定居型CD34⁺ VW-SCs。纯化后的细胞通过免疫荧光染色和Ca²⁺成像进行功能鉴定。简言之，通过组织块贴壁法获取小鼠主动脉和肠系膜动脉外膜来源的血管细胞，并经传代培养至细胞数量至少达到1 × 10⁷。随后，利用磁珠分选和流式细胞术对CD34⁺ VW-SCs进行纯化。CD34⁺ VW-SCs的鉴定采用细胞免疫荧光染色，而其功能多向分化潜能则通过特定诱导分化培养基处理来确定。此外，使用商用成像工作站，对负载Fura-2/AM的细胞在ATP、咖啡因或毒胡萝卜素（TG）刺激下，检测其功能性胞内Ca²⁺释放和胞外Ca²⁺内流。该方法为分离、培养和鉴定血管壁定居的CD34⁺干细胞提供了一种稳定且高效的技术平台，有助于开展VW-SCs调控机制的in vitro研究以及靶向药物的筛选。

引言

血管壁在血管发育、稳态调节以及血管疾病进展中发挥着关键作用。近年来，大量研究揭示了动脉中存在多种干细胞谱系。2004年，徐清波教授团队首次报道在成年个体血管壁外周存在表达CD34、Sca-1、c-kit和Flk-1的血管干细胞/祖细胞¹。这些血管干细胞具有多向分化和增殖潜能。在正常情况下，它们处于相对静息状态；然而，在特定因子激活下，可分化为平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。此外，它们还可通过旁分泌效应调控血管周围基质及微血管形成，促进受损血管的修复或重塑^2,3,4,5,6。最近研究发现，血管壁内定居的CD34⁺干细胞在股动脉导丝损伤后参与了内皮细胞的再生过程²。因此，分离和定量CD34⁺血管壁干细胞（VW-SCs），并检测CD34⁺干细胞的基本生物学特性，对于进一步研究调控CD34⁺ VW-SCs的信号通路至关重要。

目前已有多种细胞分离方法，包括基于细胞培养特性或细胞物理性质的技术，例如密度梯度离心法，但该方法获得的分选细胞中常含有大量非目标细胞，纯度相对较低^{7,8,9,10,11,12}。另一种常用技术是荧光/磁珠辅助细胞分选。荧光激活细胞分选（FACS）系统复杂，技术要求高，且相对昂贵、耗时较长，还可能影响分选后细胞的活性^13,14。相比之下，磁珠激活细胞分选（MACS）效率更高、操作更便捷，具有较高的回收率和细胞活性，对后续实验应用的影响较小⁸。因此，在本实验方案中，我们采用MACS技术纯化CD34⁺血管壁干细胞（VW-SCs），并进一步通过流式细胞术对细胞进行鉴定。建立基于MACS的血管壁干细胞分离方法具有重要意义：首先，该方法可用于开展遗传学和细胞生物学实验研究；其次，高效分离与培养血管壁定居干细胞有助于系统评估和筛选调控干细胞功能的信号因子；第三，明确干细胞的关键表型特征可为评估细胞状态提供重要的“质量控制”依据。因此，开发可用于纯化此类细胞的方法，对于从血管来源的其他类似干细胞研究也具有借鉴意义。

本报告详细演示了一种稳定且可靠的CD34⁺血管壁间充质干细胞（VW-SCs）培养方法，包括通过流式细胞术、免疫荧光染色和Ca²⁺信号检测进行的细胞鉴定与功能评估。本研究为深入探讨CD34⁺ VW-SCs在生理和病理条件下的功能及其调控机制奠定了基础。

方案

本研究已获得批准，动物饲养和操作均遵循《中国实验动物管理和使用指南》。研究严格遵守动物实验伦理要求，并已获得西南医科大学动物伦理委员会的批准（批准号：SWMU2020664）。本研究采用8周龄健康C57BL/6小鼠，雌雄不限，体重为18–20 g。动物饲养于西南医科大学（SWMU）实验动物中心。

1. 主动脉和肠系膜动脉外膜组织块培养

1. 组织驻留型CD34⁺ VW-SCs 的分离
   1. 用3%异氟烷吸入麻醉两只小鼠（遵循机构批准的方案）。通过夹捏脚趾确认麻醉充分。用医用胶带将小鼠仰卧固定，喷洒70%乙醇消毒液对小鼠皮毛进行消毒。使用无菌眼科剪刀和镊子打开胸腔和腹腔，暴露心脏和肠道。分离出独立的主动脉和肠系膜动脉后，将主动脉和肠系膜血管床固定于含硅胶弹性体并盛有生理盐溶液的培养皿中。用另一套灭菌的剪刀和镊子，迅速剥离主动脉和肠系膜动脉周围的脂肪组织。
   2. 将解剖得到的组织转移至含有1%青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的6 cm培养皿中（参见 材料表用PBS缓冲液冲洗两次后，将动脉转移至体视显微镜下的组织培养超净台中。
   3. 纵向切开动脉，用精细镊子剥离主动脉和肠系膜动脉第一分支的外层组织。将外层组织转移至一个含有 0.1–0.2 mL 培养基的 3.5 cm 培养皿中（参见 材料表）。将外层切成小块（约1 mm）³).
   4. 将组织块转移至经明胶包被的T25培养瓶中，确保其在瓶底均匀分布。组织块之间应保持适当间距，以利于细胞爬行和生长。将培养瓶垂直放入培养箱中（37 °C，5% CO₂）。₂）孵育3小时，使组织块贴附于培养瓶底部。
   5. 孵育3小时后，加入5 mL高糖DMEM生长培养基以浸没组织块。将T25培养瓶水平放置。每隔3天在显微镜下观察组织块周围的细胞迁移情况。
      注意：培养基应包含 20% 胎牛血清、0.2% 白血病抑制因子（LIF）、0.2 mM β-巯基乙醇和 1% 青霉素/链霉素（参见 材料表）。胎牛血清支持细胞增殖，而白血病抑制因子（LIF）和β-巯基乙醇可抑制细胞分化^7,8.
   6. 当T25培养瓶中的细胞融合度达到约80%时，将细胞传代并接种至一个或两个T75培养瓶中。连续传代培养五次，以确保细胞正常生长和良好状态。
2. 分离驻留型CD34磁珠⁺ 干细胞
   1. 当一个或两个T75培养瓶中的细胞达到80%融合度时，用胰蛋白酶消化细胞，并将其重悬于1 mL分选缓冲液（2 mM EDTA和0.5% FBS）中。测定细胞数量（10⁷/T75 培养瓶）并将细胞悬液在 300 x g 5 分钟（室温下）。
   2. 完全弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于每10⁶个细胞98 µL分选缓冲液中⁷ 总细胞数。加入 2 µL CD34 抗体（参见 材料表充分混匀，4°C 避光孵育 30 分钟，期间偶尔振荡。
   3. 加入 2 mL 分选缓冲液重悬细胞，300 x g 离心 g 室温下孵育10分钟。
   4. 小心且彻底地移除上清液，将细胞重悬于 80 µL 分选缓冲液中。
   5. 加入20 µL Anti-FITC MicroBeads（每10⁷ 总细胞数，参见 材料表) 加入缓冲液中，通过反复吹打混匀，置于4 °C避光孵育15分钟，期间间歇性振荡。
   6. 用 2 mL 缓冲液洗涤细胞两次，300 x g 离心 g 离心5分钟以重新沉淀细胞。彻底弃去上清液，并将细胞重悬于1 mL缓冲液中。
   7. 将一根MS柱置于合适分离器的磁场中，并确保在MS柱下方放置收集管（例如15 mL离心管），用于收集分离组分。（参见 材料表用500 µL缓冲液洗涤柱子，等待其完全流尽。
   8. 将细胞悬液加入柱中，并收集含有未标记细胞的流穿液至15 mL离心管中。
   9. 将柱子从分离器上取下，置于新的15 mL离心管上。向柱中加入500 µL缓冲液，然后迅速将推杆插入柱中，洗脱磁性标记的细胞。
   10. 为了提高CD34的纯度⁺ 细胞，洗脱组分可使用第二根质谱柱进行富集。重复上述分离过程。评估分选后细胞的纯度 通过 流式细胞术
       ​注意：通常，10%–20% CD34⁺ 细胞获得率约为70%-80%的阴性细胞，染色和离心步骤导致约10%的细胞损失。
   11. 为进一步确认血管壁 CD34 的纯度⁺ 干细胞，通过流式细胞术鉴定分选后的细胞。本研究显示纯度超过90%。

2. 通过免疫荧光鉴定细胞

1. 将细胞接种于预先用0.04%明胶包被的盖玻片（直径8 mm）上。
2. 当细胞融合度达到约60%-70%时，用PBS洗涤两次，再用4%多聚甲醛固定10分钟。
3. 用PBS洗涤细胞3分钟（共3次），然后在室温下用含0.2% Triton X-100的PBS处理5分钟以通透细胞。
4. 用PBS洗涤细胞3分钟（共3次），再用含5%驴血清的PBS于室温封闭1小时，以阻断抗体的非特异性结合。
5. 用镊子夹住每张盖玻片边缘，将封闭液沥至无尘擦拭纸上以去除封闭液。
6. 将细胞与用含1% BSA的PBS稀释100倍的一抗（CD34、Flk-1、c-kit、Sca-1、Ki67，参见材料表）在4 °C孵育过夜。
7. 倾去溶液，用PBS洗涤细胞3分钟（共3次），然后在避光条件下，室温下用Alexa Fluor 488标记的二抗（1:200稀释于含1% BSA的PBS中）孵育1小时（参见材料表）。
8. 将DAPI储存液用PBS稀释至0.5 µg/mL，对细胞进行DAPI复染，孵育5分钟。
9. 用PBS冲洗，用抗荧光淬灭封片剂封片，然后在激光扫描共聚焦显微镜下采集图像。

3. CD34⁺ 血管壁干细胞的诱导分化及鉴定

1. 将CD34⁺干细胞以适当的密度（40%-50%融合度）分别接种于盖玻片和6孔板中。
2. 将CD34⁺细胞在内皮细胞培养基EBM-2（参见材料表）中培养1周，诱导其向内皮细胞方向分化。
3. 将CD34⁺细胞在成纤维细胞培养基FM-2（参见材料表）中培养3天，诱导其向成纤维细胞方向分化。
4. 对未分化及已分化的细胞进行免疫荧光染色（如步骤2所述），在488 nm激光激发 下使用40倍物镜观察。检测内皮细胞标志物（CD31、VWF）和成纤维细胞标志物（PDGFRα、Vimentin）的表达（参见材料表）。
5. 用胰蛋白酶消化细胞，通过离心（300 × g，5分钟，室温）收集细胞沉淀。用100 µL分选缓冲液重悬细胞。在4 ˚C条件下，用纯化的抗小鼠CD16/CD32单克隆抗体（1 µg）（参见材料表）预孵育细胞悬液5分钟。
6. 在存在小鼠Fc阻断剂的情况下，直接向预孵育的细胞中加入2 µL PE标记的抗小鼠CD34抗体（1:50）、CD31（PECAM-1）单克隆抗体APC（2 µL，1:50）以及CD140a（PDGFRa）单克隆抗体FITC（2 µL，1:50），并在4 °C进一步孵育15分钟。
7. 加入2 mL缓冲液洗涤细胞两次，于300 × g离心5分钟（室温）以重新收集细胞沉淀。彻底弃去上清液，将细胞重悬于300 µL缓冲液中。将染色后的细胞置于流式管中，放入冰盒，准备进行流式细胞术分析。

4. 血管内 CD34⁺ 干细胞中细胞内 Ca²⁺ 信号的检测

1. 实验前10小时将细胞以最高70%汇合度接种于盖玻片上。
2. 取出盖玻片，用凡士林将其固定在定制腔室底部。
3. 用PBS洗涤盖玻片一次，更换为含Fura-2/AM（5 µM）的Tyrode溶液（NaCl 137 mM，KCl 5.4 mM，MgCl₂ 1.2 mM，葡萄糖10 mM，HEPES 10 mM，CaCl₂ 2.4 mM）（见材料表），在避光条件下孵育30分钟。
4. 用Tyrode溶液处理10分钟以去除染料，使Fura-2/AM完成去酯化。
5. 将腔室安装在倒置荧光显微镜载物台上，显微镜配备包含单色器和CCD相机的宽场成像系统（见材料表）。
6. 打开主窗口，进入Grab Settings对话框的相机页面，点击live按钮以实现live图像显示。
7. 选择荧光图像类型，设置340 nm/380 nm循环重复次数、图像尺寸以及380 nm和340 nm处的相机曝光时间，以获得最佳图像亮度。
8. 拍摄单张快照，并用不同颜色的手绘线条圈选细胞，预定义感兴趣区域（ROIs），将背景标记为ROI 0。
9. 在工作区视图中重新编辑已嵌入的协议，并创建一个新的工作区。
10. 执行该协议，"Fluorescence 340 nm div Fluorescence 380 nm (Live Kinetic)"将显示在线动力学曲线图。
11. 在数值视图中，将显示一个电子表格，包含灰度值及其对应的时间信息。使用剪贴板导出表格数据。
12. 计算F340 nm/F380 nm比值，通过减去背景荧光（ROI 0）反映细胞内Ca²⁺的变化。

结果

CD34⁺ 血管壁干细胞（VW-SCs）的分离与纯化
通过组织贴壁法结合磁珠分选技术，可从小鼠胸主动脉和肠系膜动脉的外膜中获得高纯度的 CD34⁺ VW-SCs。血管壁中 CD34⁺ 细胞的比例通常为 10%–30%。流式细胞术证实，经磁珠分选获得的 CD34⁺ 细胞纯度超过 90%（图 1A）。细胞免疫荧光染色显示，CD34⁺ VW-SCs 主要表达 CD34、c-kit、Flk-1 和 Ki-67，而 Sca-1 的表达水平相对较低（图 1B）。

CD34⁺ 血管壁干细胞的分化
CD34⁺ 血管壁干细胞（VW-SCs）可在体外分化为内皮细胞和成纤维细胞。in vitro条件下，CD34⁺...

讨论

本研究提供了一种从小鼠主动脉和肠系膜动脉中快速、便捷地获取功能性CD34⁺血管壁干细胞（VW-SCs）的方法。通过该方法获得的CD34⁺ VW-SCs具有增殖活性和多向分化潜能。三磷酸肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP₃Rs）、雷诺丁受体（RyRs）以及内质网钙库操纵性钙通道介导了CD34⁺ VW-SCs中的Ca²⁺释放与内流。该技术的建立将为进一步研究CD34⁺ VW-SCs在心血管疾病结构与功能重塑中所参与的机制奠定基础。

原代细胞分离最常用的方法包括组织块贴壁法和酶消化法^15,16在本报告中，通过结合组织块附着与磁珠分选技术，获得高纯度的CD34⁺ VW-SCs。经分选的血管壁CD34⁺ 干细胞表达 CD34，少数表达内皮细胞标志物 CD31，这与既往报道一致

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2% 明胶溶液	Sigma	G1393
抗 CD31 抗体	R&D	AF3628
抗 CD34 抗体	Abcam	ab81289
抗 c-kit 抗体	CST	77522
抗 FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
抗 FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
抗 Flk-1 抗体	Abcam	ab24313
抗 Ki67 抗体	CST	34330
抗 PDGFRα 抗体	Abcam	ab131591
抗 Sca-1 抗体	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) 单克隆抗体 (APA5)，FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) 单克隆抗体 (390)，APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 抗体，抗小鼠，FITC，REAfinity 克隆 REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
细胞培养罩	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
离心机	CENCE	L530
CO2 培养箱	Thermofisher Scientific	4111
共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss	zeiss 980
DMEM 高糖培养基	ATCC	30-2002
EBM-2 培养基	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ 系统	BD
胎牛血清	Millipore	ES-009-C
FM-2 培养基	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
白血病抑制因子	Millipore	LIF2010
显微镜	Olympus	IX71
MiniMACS   起始试剂盒	Miltenyi Biotec	130-090-312
青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液	Beyotime	C0224
纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭剂）	BD Pharmingen	553141
体视显微镜	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 程序	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF 单克隆抗体 (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-巯基乙醇	Thermofisher Scientific	21985023