由人多能干细胞生成神经视网膜

摘要

本方案描述了一种优化的三维神经视网膜诱导系统，可减少视网膜类器官的黏附与融合，具有高重复性和高效率。

摘要

视网膜病变是全球范围内导致失明的主要原因之一。研究其发病机制对于视网膜病变的早期诊断和及时治疗至关重要。然而，伦理限制阻碍了从人体获取直接证据。近年来，大量研究表明，通过不同的诱导方案，人类多能干细胞（PSCs）可被分化为视网膜类器官（ROs），在疾病建模、药物筛选以及基于干细胞的治疗方面具有巨大潜力。本研究描述了一种优化的诱导方案，可高效生成神经视网膜（NR），显著降低囊泡化和融合的发生概率，从而提高第60天前的制备成功率。该方法基于PSCs在解离后自我重排的能力，并结合特定的辅助因子，能够特异性地驱动NR的分化。此外，该技术操作简便、成本低廉，具有显著的可重复性和高效性，为视网膜疾病的个体化模型研究提供了广阔前景，同时也为细胞治疗、药物筛选和基因治疗测试等应用提供了充足的细胞资源。

引言

眼睛是人类感觉器官中主要的信息来源，视网膜是哺乳动物眼睛中的主要视觉感觉组织¹。视网膜病变是全球范围内导致眼病和失明的主要原因之一²。全球约有285万人因视网膜病变而遭受不同程度的视力障碍³。因此，研究其发病机制对于早期诊断和及时治疗至关重要。目前大多数关于人类视网膜病变的研究主要依赖于动物模型^4,5,6。然而，人类视网膜是一种复杂的多层组织，包含多种细胞类型。传统的二维（2D）细胞培养和动物模型系统通常难以真实再现人类视网膜正常的时空发育过程及药物代谢特征^7,8。

近年来，三维培养技术已发展到能够利用多能干细胞（PSCs）生成类器官组织^9,10由人多能干细胞（PSCs）在三维悬浮培养系统中生成的视网膜类器官（ROs）不仅包含七种视网膜细胞类型，还呈现出与人类视网膜相似的明显分层结构 体内

方案

本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则，并经中国人民解放军总医院机构伦理委员会批准。WA09（H9）胚胎干细胞系购自WiCell研究所。

1. 培养基与试剂的配制

1. 人ESC培养基与传代溶液
   1. 维持培养基（MM）：配制500 mL完全MM（基础培养基 + 5倍补充剂；参见 材料表无菌操作。在室温（RT）下解冻5倍浓缩补充剂，或在2-8 °C过夜解冻。使用前预温至室温，充分搅拌直至补充剂澄清无浑浊。
   2. 1% 细胞外基质（ECM）：使用预冷的移液枪头和无菌离心管，分装 200 µL ECM（参见 材料表每管置于冰上。将各管储存于 -20 °C 冰箱中。在冰上融化 ECM，并用预冷的 DMEM/F12 以 1:100 的比例稀释。
   3. 0.5 mM pH = 8.0 EDTA：配制500 mL的0.5 mM EDTA，将500 µL的0.5 M EDTA和0.9 g NaCl加入500 mL的1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中（参见 材料表充分混匀，2-8 °C 保存。
2. 视网膜分化培养基
   1. 无生长因子化学成分明确培养基（gfCDM）：通过混合45% Iscove改良Dulbecco培养基-谷氨酰胺（IMD....

结果

修改后方案的图示概览见图1。当H9-ESCs生长至70%-80%密度时，用于生成视网膜类器官（ROs）。H9-ESCs的单细胞悬液在96孔V型底培养板中于第1天开始聚集，并在第6天形成边界清晰的圆形胚状体（EBs）。随着培养时间的延长，EBs的体积逐渐增大。在第30天，神经上皮样结构在长期神经视网膜（NR）分化过程中明显形成并增厚。

此外，将改进后的方法与另外两种方法（Kuwahara 等）进行了比较¹² 和 Döpper 等人²⁷）以评估其重复性和效率（补充图1）。本研究还观察到，采用改良方法在第1天形成的拟胚体形态略差于另外两种方法。然而，使用改良方法在第18天形成的神经上皮结构更为连续（图2）。第30天时，采用改良方法获得的早期神经球在形态和大小上相似，呈规则的圆形（图3.......

讨论

人类类器官在空间和时间上均可重现胎儿视网膜的发育过程，早期类器官在发育的相应阶段表现出与胎儿视网膜高度相似的特征¹⁵在组织形态和分子表达方面，人类视网膜类器官（RO） closely mirror 视网膜组织的实际生长状态，在疾病建模、药物筛选和再生医学领域提供了巨大且前所未有的机遇。目前，已有多种不同的方法被建立用于从人类多能干细胞（PSCs）生成视网膜类器官（ROs） 体外，并且正在进行持续的改进和优化以进一步提高效率⁹Sasai 实验室首次报道了利用人胚胎干细胞（ESCs）生成多能干细胞（PSC）来源的视杯状结构（ROs）¹¹人类ESC首先被制备成单细胞悬液，随后将等量细胞接种于96孔V型底锥形板中，细胞快速聚集形成类圆形的胚体（EB）。通过外源添加关键细胞信号通路因子，促进EB中视泡结构的形成，随后在悬浮培养中进一步成熟为具有层状结构的视杯样类器官（RO）。神经视网膜（NR）包含一种胶质细胞和六种不同类型的神经元， recapitulates视网膜发育的多个方面，如细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.01 M TPBS	Servicebio	G0002	洗涤切片
4% 多聚甲醛	Servicebio	G1101-500ML	固定视网膜类器官
5 mL 巴斯德吸管	NEST Biotechnology	318516	移取视网膜类器官
96 孔 V 型底锥形板	Sumitomo Bakelit	MS-9096VZ
粘附载玻片	CITOTEST	188105	固定切片
AggreWell 培养基	STEMCELL Technologies	5893	培养基
无水乙醇	SINOPHARM	10009218	脱水
Anti-CHX10	Santa Cruz	sc-365519	一抗
抗荧光淬灭封片液	ZSGB-BIO	ZLI-9556
Anti-KI67	Abcam	ab16667	一抗
Anti-NESTIN	Sigma	N5413	一抗
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)	Beyotime	AT809	一抗
Anti-PAX6	Abcam	ab195045	一抗
细胞解离液（CDS）	STEMCELL Technologies	7922	细胞解离
CHIR99021	Selleckchem	S2924	GSK-3α/β 抑制剂
胆固醇脂质浓缩液	Gibco	12531018	250×
柠檬酸抗原修复液	Servicebio	G1202-250ML	20×，pH 6.0
CS10	STEMCELL Technologies	1001061	细胞冻存液
DAPI	Roche	10236276001	细胞核复染剂
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	11330032	培养基
DMEM/F12-GlutaMAX	Gibco	10565018	培养基
驴抗小鼠 Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32766	二抗
驴抗兔 Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	二抗
乙二胺四乙酸（EDTA）	Biosharp	BL518A	0.5 M，pH 8.0，用于细胞解离
细胞外基质（ECM）	Corning	354277	包被培养板
F12-Glutamax	Gibco	31765035	培养基
胎牛血清	Gibco	A5669701
流式组织细胞定量分析仪	TissueGnostics	TissueFAXS Plus	扫描切片
IMDM-GlutaMAX	Gibco	31980030	培养基
IWR1-endo	Selleckchem	S7086	Wnt 抑制剂
KnockOut 血清替代物	Gibco	10828028
LDN-193189 2HCl	Selleckchem	S7507	BMP 抑制剂
低吸附 24 孔板	Corning	3473
低吸附 6 孔板	Corning	3471
维持培养基（MM）	STEMCELL Technologies	85850	培养基
N2 添加剂	Gibco	17502048
正常驴血清	Solarbio	SL050	封闭缓冲液
Paraplast	Leica	39601006	组织包埋
PBS pH 7.4 基础液（1x）	Gibco	C10010500BT	不含 Ca⁺、Mg⁺
重组人骨形态发生蛋白-4（rhBMP4）	R&D	314-BP	关键蛋白因子
视黄酸	Sigma	R2625	粉末，避光保存
SB431542	Selleckchem	S1067	ALK5 抑制剂
SU5402	Selleckchem	S7667	酪氨酸激酶抑制剂
Super PAP Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305
牛磺酸	Sigma	T0625-10G
硫代甘油	Sigma	M1753
吐温 X-100	Sigma	X100	通透处理
WA09 胚胎干细胞系	WiCell Research Institute		细胞系
二甲苯	SINOPHARM	10023418	脱蜡
Y-27632 2HCL	Selleckchem	S1049	ROCK 抑制剂