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由人多能干细胞生成神经视网膜

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DOI：

10.3791/66246

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2023年12月22日

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1Medical School of Chinese PLA, 2Senior Department of Ophthalmology, The Third Medical Center of Chinese PLA General Hospital, 3Stem Cell and Regenerative Medicine Lab, Beijing Institute of Radiation Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种优化的三维神经视网膜诱导系统，可减少视网膜类器官的黏附与融合，具有高重复性和高效率。

摘要

视网膜病变是全球范围内导致失明的主要原因之一。研究其发病机制对于视网膜病变的早期诊断和及时治疗至关重要。然而，伦理限制阻碍了从人体获取直接证据。近年来，大量研究表明，通过不同的诱导方案，人类多能干细胞（PSCs）可被分化为视网膜类器官（ROs），在疾病建模、药物筛选以及基于干细胞的治疗方面具有巨大潜力。本研究描述了一种优化的诱导方案，可高效生成神经视网膜（NR），显著降低囊泡化和融合的发生概率，从而提高第60天前的制备成功率。该方法基于PSCs在解离后自我重排的能力，并结合特定的辅助因子，能够特异性地驱动NR的分化。此外，该技术操作简便、成本低廉，具有显著的可重复性和高效性，为视网膜疾病的个体化模型研究提供了广阔前景，同时也为细胞治疗、药物筛选和基因治疗测试等应用提供了充足的细胞资源。

引言

眼睛是人类感觉器官中主要的信息来源，视网膜是哺乳动物眼睛中的主要视觉感觉组织1。视网膜病变是全球范围内导致眼病和失明的主要原因之一2。全球约有285万人因视网膜病变而遭受不同程度的视力障碍3。因此，研究其发病机制对于早期诊断和及时治疗至关重要。目前大多数关于人类视网膜病变的研究主要依赖于动物模型4,5,6。然而，人类视网膜是一种复杂的多层组织，包含多种细胞类型。传统的二维（2D）细胞培养和动物模型系统通常难以真实再现人类视网膜正常的时空发育过程及药物代谢特征7,8。

近年来，三维培养技术已发展到能够利用多能干细胞（PSCs）生成类器官组织9,10由人多能干细胞（PSCs）在三维悬浮培养系统中生成的视网膜类器官（ROs）不仅包含七种视网膜细胞类型，还呈现出与人类视网膜相似的明显分层结构 体内11,12,13人类多能干细胞来源的视网膜类器官已获得广泛应用并易于获取，目前是最理想的 体外 研究人类视网膜发育与疾病的模型14,15在过去几十年中，众多研究人员已证实，人类多能干细胞（PSCs），包括胚胎干细胞（ESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs），可通过多种诱导方案分化为视网膜类器官（ROs）。这些进展在视网膜病变的疾病建模、药物筛选以及基于干细胞的治疗方面具有巨大潜力16,17,18.

然而，从人类多能干细胞（PSCs）生成神经视网膜（NR）是一个复杂、繁琐且耗时的过程。此外，组织类器官在批次间的差异可能导致实验结果的可重复性降低19,20。多种内在和外在因素均可影响视网膜类器官（ROs）的产量，例如起始细胞的数量或物种、转录因子以及小分子化合物的使用21,22,23。自Sasai实验室首次生成人类RO以来11，多年来已提出多种改进方法，以提高诱导过程的简便性和效率13,21,24,25。遗憾的是，迄今为止，尚未在所有实验室中建立生成RO的金标准方案。事实上，不同诱导方法所产生的RO之间存在一定程度的差异，视网膜标志物的表达水平及其结构的稳定性也存在较大变异22,26。这些问题可能严重增加样本收集和研究结果解读的难度。因此，亟需一种更为统一且稳健的分化方案，以在最小化RO异质性的前提下最大化生成效率。

本研究描述了一种基于Kuwahara等人12和Döpper等人27方法的优化诱导方案，并提供了详细的实验步骤。该新方法显著降低了类器官发生空泡化和融合的概率，提高了生成视网膜神经层（NR）的成功率。这一进展在视网膜疾病建模、药物筛选以及细胞治疗应用方面具有重要意义。

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方案

本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则，并经中国人民解放军总医院机构伦理委员会批准。WA09（H9）胚胎干细胞系购自WiCell研究所。

1. 培养基与试剂的配制

  1. 人ESC培养基与传代溶液
    1. 维持培养基（MM）：配制500 mL完全MM（基础培养基 + 5倍补充剂；参见 材料表无菌操作。在室温（RT）下解冻5倍浓缩补充剂，或在2-8 °C过夜解冻。使用前预温至室温，充分搅拌直至补充剂澄清无浑浊。
    2. 1% 细胞外基质（ECM）：使用预冷的移液枪头和无菌离心管，分装 200 µL ECM（参见 材料表每管置于冰上。将各管储存于 -20 °C 冰箱中。在冰上融化 ECM，并用预冷的 DMEM/F12 以 1:100 的比例稀释。
    3. 0.5 mM pH = 8.0 EDTA：配制500 mL的0.5 mM EDTA，将500 µL的0.5 M EDTA和0.9 g NaCl加入500 mL的1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中（参见 材料表充分混匀，2-8 °C 保存。
  2. 视网膜分化培养基
    1. 无生长因子化学成分明确培养基（gfCDM）：通过混合45% Iscove改良Dulbecco培养基-谷氨酰胺（IMDM-GlutaMAX）、45% Ham's F12-谷氨酰胺（F12-Glutamax）、10% 无血清替代物（KSR）、1% 胆固醇脂质浓缩液和450 µM 巯基甘油配制gfCDM（参见 材料表).
  3. 小分子化合物
    1. Y-27632 2HCl：将50 mg Y-27632粉末加入3.122 mL二甲基亚砜（DMSO）中。分装并储存Y-27632（见 材料表在-80 °C避光保存2年，浓度为50 mM。使用时将原液稀释2,500倍（20 µM），相当于每毫升gfCDM中加入0.4 µL的Y-27632。
    2. IWR1-endo：加入2.4424 mL DMSO溶解10 mg IWR1-endo（见 材料表) 配制成10 mM的储存液。分装后于-80 °C保存，可保存长达2年。为达到诱导所需的3 µM终浓度，每毫升gfCDM中加入0.3 µL的10 mM IWR1-endo。
    3. SB431542：配制50 mM SB431542，加入10 mg SB431542（参见 材料表) 加入0.5203 mL DMSO中，充分混匀。在-80 °C下溶于溶剂中保存，最长可保存2年。配制工作浓度为10 µM的SB431542时，取2 µL 50 mM储备液加入10 mL gfCDM中。
    4. LDN-193189 2HCl：将5 mg LDN-193189 2HCl溶解（参见 材料表) 溶于 10.4297 mL DMSO 中，配制成 1 mM 的母液。根据生产商建议，储存于 -20 °C 或 -80 °C。每 10 mL gfCDM 中加入 0.1 µL 母液，使 LDN-193189 的诱导浓度为 100 nM。
    5. 重组人骨形态发生蛋白4（BMP4）：用4 mM HCl溶液以50–200 µg/mL浓度重悬（见 材料表). 重悬后储存于 2 °C 至 8 °C 可保存 1 个月，或储存于 -20 °C 可保存 1 年。使用 1.5 nM BMP4 诱导 NR。
  4. 长期NR培养基
    1. 视黄酸（RA）：称取6 mg RA粉末（见 材料表) 并加入 3.9941 mL DMSO 中。分装保存于 −80 °C，浓度为 5 mM，三个月内使用。为获得 0.5 µM 的工作浓度，将 10 µL 原液加入 100 mL 神经视网膜分化培养基（NRDM）中，临用前添加。
      注意：制备和保存过程中需避光。
    2. 牛磺酸：加入牛磺酸粉末（参见 材料表称取200 mg样品溶于7.9904 mL DMSO中，配制200 mM储备液。分装后于2–8 °C保存。工作浓度的牛磺酸（0.1 mM）通过每100 mL NRDM中加入50 µL储备液获得。
    3. NRDM：用 DMEM/F12-GlutaMAX 培养基配制 NRDM，添加 1% N2 补充剂、10% 胎牛血清、0.5 mM RA 和 0.1 mM 牛磺酸（参见 材料表). 2-8 °C 下可保存长达 2 周，或 -20 °C 下保存 6 个月，以确保组分的活性。
  5. 封闭缓冲液：用DPBS按1:9稀释，配制10%的工作液使用（见 材料清单). -20 °C 保存，可保存长达 5 年。
    ​注意：除称重外，所有其他操作均须在II级生物安全柜中进行，以确保无菌；若在制备过程中需添加已称量的试剂，应使用0.22 µm滤器进行过滤。

2. H9 胚胎干细胞的培养

  1. 解冻 H9-ESCs
    1. 向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 的 1% ECM。在 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 1 小时。
      注意：避免将 ECM 沿孔壁加入，因其可能粘附于表面。
    2. 从液氮罐中取出一支 H9-ESC 冻存管，在 37 °C 水浴中快速振荡 30 秒。
      注意：不要让冻存管完全解冻。
    3. 取出冻存管，用 75% 消毒酒精喷雾仔细消毒。将解冻后的 H9-ESC 加入含有 9 mL 含 10 µM Y-27632 的 MM 的 15 mL 离心管中。
    4. 在室温下以 190 × g 离心 5 分钟。用 1 mL 移液器小心吸除大部分上清液，保留约 50 µL 上清液以避免细胞损失。
    5. 向细胞沉淀中加入 1 mL 含 10 µM Y-27632 的 MM，用 1 mL 移液器轻轻吹打 5–10 次，充分重悬细胞沉淀。
    6. 孵育 1 小时后去除 ECM 包被。向每孔加入 2 mL 预热的含 10 µM Y-27632 的 MM。
    7. 每孔接种 0.5 mL 细胞悬液。轻轻左右摇动培养板，确保细胞均匀分布。
    8. 将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下培养至少 24 小时，期间勿扰动。
    9. 每日更换培养基。当克隆密度达到 70% 或以上时，需进行传代。
  2. H9-ESCs 的传代
    1. 按上述方法（步骤 2.1.1）准备 ECM 包被的培养板，每孔加入 2 mL MM。
    2. 从 6 孔板中移除用过的培养基。每孔用 1 mL DPBS 洗涤两次。
    3. 缓慢向每孔加入 1 mL EDTA，洗涤两次，并在室温下用 1 mL EDTA 孵育 4–7 分钟。
      注意：孵育期间，每隔 3 分钟在显微镜下观察 6 孔板。若大多数细胞接近从培养皿脱离，应立即进入下一步。避免长时间孵育，以减少对细胞的不利影响。
    4. 弃去 EDTA，加入 1 mL MM 终止消化。
    5. 轻轻敲击培养板，直至大部分细胞脱落。
    6. 用 5 mL 移液器小心将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中。用巴斯德移液器轻轻吹打 H9-ESC 克隆 3–5 次以混匀，然后将 20–100 µL 细胞悬液接种至新的 ECM 包被的 6 孔培养皿中，并前后轻轻摇动。
    7. 在显微镜下观察到细胞密度足够时，将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下培养至少 24 小时，期间勿扰动。
    8. 每日更换培养基。当克隆密度达到 70% 或以上时，需进行传代。

3. 人类核受体的生成

注意：当集落达到约70%融合度时，可按照图1中所述操作步骤诱导其分化为视网膜类器官（ROs）。

  1. 第0天 - 胚状体（EB）形成
    1. 用2 mL DPBS洗涤细胞后，向孔中加入含有20 µM Y27632的0.5 mL CDS（参见材料表）。在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育3分钟。
      注意：在显微镜下观察。尽可能缩短孵育时间，以避免对细胞产生有害影响。
    2. 加入3 mL含有20 µM Y27632的MM终止消化。以190 × g 离心5分钟，弃去上清液。
    3. 将细胞沉淀重悬于1 mL含有20 µM Y27632的gfCDM中，并进行细胞计数。将相当于1.2 × 106个细胞（每孔1.2 × 104个细胞）的体积加入到10 mL gfCDM中，该培养基已预先加入20 µM Y-27632、3 µM IWR1-endo、10 µM SB431542和100 nM LDN-193189（参见材料表）。
    4. 将100 µL细胞悬液加入96孔V型底锥形板的每一孔中。将培养板置于含5% CO2的湿润培养箱中，培养至第6天。
      注意：至少24小时内不要移动培养板，以促进胚状体的贴附。
  2. 第6天 - 视网膜诱导
    1. 第6天，加入含有55 ng/mL BMP4的10 mL gfCDM，以完成对胚状体的完全换液。将培养板放回培养箱。
      注意：移液时应沿96孔V型底锥形孔的孔壁进行，以避免产生气泡。换液时避免吸走任何类器官。
    2. 在第9天、第12天和第15天进行半量换液。用新鲜的gfCDM替换一半培养基，以逐步稀释BMP4。
  3. 第18天 - 视网膜神经上皮长期培养
    1. 第18天，使用5 mL巴斯德吸管小心地将形成的胚状体转移至15 mL离心管中，并用NRDM轻轻冲洗一次。将胚状体转移至低吸附性的6孔板或24孔板中（参见材料表）。将培养板放回培养箱。
    2. 每3天更换一次新鲜的NRDM。
      ​注意：换液期间关闭光源，因为视黄酸（RA）对光敏感。去除分化不良的类器官，并在显微镜下分离贴壁的类器官。

4. 人类核受体的分析

  1. 视网膜类器官的包埋
    1. 选择不同代次的H9-ESCs以诱导生成三批视网膜类器官。
      注意：三种评估方法（Kuwahara 等）各自形成的 NRs 数量分别设三个培养皿12，Döpper 等27，以及本研究中的改良方法）的诱导成功率进行计算。若在第30天通过光学显微镜观察到神经上皮样结构的形成，则视为诱导成功。
  2. 视网膜类器官的免疫荧光染色
    1. 将3-5个类器官转移至1.5 mL离心管中。用移液器吸除多余培养基，并在室温下用1 mL DPBS洗涤类器官一次。静置使类器官沉降，小心吸除DPBS。加入1 mL 4%多聚甲醛（见 材料清单每1.5 mL离心管加入并置于4 °C固定。
      注意：第6天和第18天的类器官（ROs）固定2小时；第30天固定12小时，第60天固定14小时。
    2. 固定后，使用梯度酒精脱水。将ROs分别在50%、60%和70%酒精中各放置15分钟，随后在80%、90%、95%、100%和100%酒精中各放置10分钟。然后加入1:1的100%酒精与二甲苯混合液处理10分钟，接着用二甲苯处理两次，每次10分钟。
    3. 将视网膜类器官（ROs）置于装有熔融石蜡的金属模具中（参见 材料表) 40分钟，然后将模具置于冰上淬灭以固定类器官。将包埋盒放入模具中，于-20 °C过夜冷冻。随后，小心剥离包埋盒。最后，在室温下保存。
    4. 使用石蜡切片机制作连续切片（5 µm 厚度）。将切片固定于防脱载玻片上，干燥后室温保存。
    5. 抗原修复前进行脱蜡和复水12,27.
    6. 加入10 mL 20倍浓度pH 6.0柠檬酸抗原修复液（参见 材料表) 加至 190 mL 去离子水（ddH₂O）中2O（双蒸馏 H2O）。在高火下微波加热4分钟，直至沸腾。加入石蜡切片后，转低火加热20分钟，以完成抗原修复。
    7. 让石蜡切片在通风处自然冷却，然后放入湿盒中。
    8. 使用记号笔（参见 材料表）以标记各步骤。室温下用 0.2% Triton X-100 孵育 30 分钟以破膜，随后用 TPBS 洗涤切片三次，每次 5 分钟。
    9. 在湿润孵育盒中，用 DPBS 稀释的 10% 驴血清封闭，每染色区域加 10 µL，室温孵育 1 小时。
    10. 加入用10%驴血清稀释的一抗，在湿盒中4 °C孵育过夜。用TPBS洗涤样本3次，每次10分钟，以去除未结合的抗体。
      注意：一抗如下：anti-PAX6（1:250）、anti-SOX2（1:200）、anti-KI67（1:200）、anti-CHX10（1:200）、anti-β tubulin III（1:250）和anti-NESTIN（1:200）（参见 材料表).
    11. 在湿盒中，用 DPBS 稀释的二抗室温孵育 1 小时。用 TPBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
      注意：避光保存，以防荧光二抗淬灭。二抗为 Alexa Fluor 488 标记的驴抗小鼠 IgG 和 Alexa Fluor 568 标记的驴抗兔 IgG，稀释比例为 1:400（参见 材料表).
    12. 用含 DAPI（1:500；参见 材料表在室温避光条件下孵育10分钟。用TPBS洗涤三次，每次10分钟。
    13. 滴加适量抗荧光封片剂（参见 材料表) 滴加到载玻片上，并用盖玻片覆盖。
    14. 使用流式组织细胞定量分析仪进行可视化（参见 材料表），或类似物。
    15. 显微镜分析后，将载玻片于 -20 °C 避光保存。

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结果

修改后方案的图示概览见图1。当H9-ESCs生长至70%–80%密度时，用于生成视网膜类器官（ROs）。H9-ESCs的单细胞悬液在96孔V型底锥形板中于第1天开始聚集，并在第6天形成边界清晰的圆形胚状体（EBs）。随着培养时间的延长，EBs的体积逐渐增大。在第30天，神经上皮样结构在长期神经视网膜（NR）分化过程中明显形成并增厚。

此外，将改进的方法与另外两种方法（Kuwahara 等12 和 Döpper 等27）进行了比较，以评估其重复性和效率（补充图 1）。本研究还观察到，采用改进方法在第 1 天形成的拟胚体（EBs）形态略差于另外两种方法。然而，在第 18 天，采用改进方法形成的神经上皮结构更为连续（图 2）。在第 30 天，采用改进方法获得的早期视网膜神经层（NRs）在形状和大小上相似，呈规则的圆形（

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讨论

人类类器官在空间和时间上均可重现胎儿视网膜的发育过程，早期类器官在发育的相应阶段表现出与胎儿视网膜高度相似的特征15在组织形态和分子表达方面，人类视网膜类器官（RO） closely mirror 视网膜组织的实际生长状态，在疾病建模、药物筛选和再生医学领域提供了巨大且前所未有的机遇。目前，已有多种不同的方法被建立用于从人类多能干细胞（PSCs）生成视网膜类器官（ROs） 体外，并且正在进行持续的改进和优化以进一步提高效率9Sasai 实验室首次报道了利用人胚胎干细胞（ESCs）生成多能干细胞（PSC）来源的视杯状结构（ROs）11人类ESC首先被制备成单细胞悬液，随后将等量细胞接种于96孔V型底锥形板中，细胞快速聚集形成类圆形的胚体（EB）。通过外源添加关键细胞信号通路因子，促进EB中视泡结构的形成，随后在悬浮培养中进一步成熟为具有层状结构的视杯样类器官（RO）。神经视网膜（NR）包含一种胶质细胞和六种不同类型的神经元， recapitulates视网膜发育的多个方面，如细胞...

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披露

所有作者均声明不存在利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.01 M TPBSServicebioG0002洗涤切片
4% 多聚甲醛ServicebioG1101-500ML固定视网膜类器官
5 mL 巴斯德吸管NEST Biotechnology318516移取视网膜类器官
96 孔 V 型底锥形板Sumitomo BakelitMS-9096VZ
粘附载玻片CITOTEST188105固定切片
AggreWell 培养基STEMCELL Technologies5893培养基
无水乙醇SINOPHARM10009218脱水 
Anti-CHX10Santa Cruzsc-365519一抗
抗荧光淬灭封片液ZSGB-BIOZLI-9556
Anti-KI67Abcamab16667一抗
Anti-NESTINSigmaN5413一抗
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)BeyotimeAT809一抗
Anti-PAX6Abcamab195045一抗
细胞解离液（CDS）STEMCELL Technologies7922细胞解离
CHIR99021SelleckchemS2924GSK-3α/β 抑制剂
胆固醇脂质浓缩液Gibco12531018250×
柠檬酸抗原修复液ServicebioG1202-250ML20×，pH 6.0
CS10STEMCELL Technologies1001061细胞冻存液
DAPIRoche10236276001细胞核复染剂
二甲基亚砜（DMSO）SigmaD2650
DMEM/F12Gibco11330032培养基
DMEM/F12-GlutaMAXGibco10565018培养基
驴抗小鼠 Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32766二抗
驴抗兔 Alexa Fluor 568InvitrogenA10042二抗
乙二胺四乙酸（EDTA）BiosharpBL518A0.5 M，pH 8.0，用于细胞解离
细胞外基质（ECM）Corning354277包被培养板
F12-GlutamaxGibco31765035培养基
胎牛血清GibcoA5669701
流式组织细胞定量分析仪TissueGnosticsTissueFAXS Plus扫描切片
IMDM-GlutaMAXGibco31980030培养基
IWR1-endoSelleckchemS7086Wnt 抑制剂
KnockOut 血清替代物Gibco10828028
LDN-193189 2HClSelleckchemS7507BMP 抑制剂
低吸附 24 孔板Corning3473
低吸附 6 孔板Corning3471
维持培养基（MM）STEMCELL Technologies85850培养基
N2 添加剂Gibco17502048
正常驴血清SolarbioSL050封闭缓冲液
ParaplastLeica39601006组织包埋
PBS pH 7.4 基础液（1x）GibcoC10010500BT不含 Ca⁺、Mg⁺
重组人骨形态发生蛋白-4（rhBMP4）R&D314-BP关键蛋白因子
视黄酸SigmaR2625粉末，避光保存
SB431542SelleckchemS1067ALK5 抑制剂
SU5402SelleckchemS7667酪氨酸激酶抑制剂
Super PAP PenZSGB-BIOZLI-9305
牛磺酸SigmaT0625-10G
硫代甘油SigmaM1753
吐温 X-100SigmaX100通透处理
WA09 胚胎干细胞系WiCell Research Institute细胞系
二甲苯SINOPHARM10023418脱蜡
Y-27632 2HCLSelleckchemS1049ROCK 抑制剂

参考文献

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