用于体内应用的腺相关病毒悬浮培养生产及碘克沙醇密度梯度离心纯化

摘要

腺相关病毒在悬浮细胞培养中生产，并通过两次碘克沙醇密度梯度离心进行纯化。本方法包含多个步骤，可提高病毒总产量，降低病毒沉淀风险，并进一步浓缩最终病毒产物。预期最终滴度可达 10¹² 病毒颗粒/mL，适用于临床前的 体内 实验应用。

摘要

本方案描述了通过碘克沙醇密度梯度离心法生产与纯化重组腺相关病毒（rAAV）的方法，这是一种不依赖血清型的AAV纯化技术，最早于1999年被报道。重组腺相关病毒载体广泛应用于基因治疗中，用于将转基因递送至多种人类细胞类型。在本研究中，通过将编码转基因、载体衣壳和腺病毒辅助基因的质粒转染悬浮培养的Expi293细胞来产生重组病毒。碘克沙醇密度梯度离心法依据病毒颗粒的密度对完整的AAV颗粒进行纯化。此外，该目前已被广泛应用的方法包含三个额外步骤，分别用于提高病毒总产量、降低因污染蛋白导致沉淀的风险以及进一步浓缩最终病毒产物：使用聚乙二醇（PEG）和氯化钠溶液从细胞培养上清中沉淀病毒颗粒、进行第二轮碘克沙醇密度梯度离心，以及通过离心过滤装置进行缓冲液置换。via该方法可稳定获得滴度达10¹²病毒颗粒/mL、纯度极高的病毒制剂，适用于in vivo实验。

引言

重组腺相关病毒（rAAV）载体是治疗遗传性疾病（包括脊髓性肌萎缩症、视网膜营养不良和A型血友病）的常用工具^1,2,3。rAAV载体经过改造，去除了野生型AAV中存在的病毒基因；野生型AAV是一种小型无包膜的二十面体病毒，含有长度为4.7 kb的线性单链DNA基因组⁴。AAV最早于20世纪60年代在腺病毒制备物中被发现，当时作为一种污染物⁵。尽管其衣壳较小，限制了可包装的转基因大小（不含ITR时最大为4.9 kb）⁶，但AAV仍是一种有效的转基因递送载体，因其对人类无致病性，可在多种分裂和非分裂细胞类型中实现转基因表达，并且免疫原性较弱⁷。

作为依赖性细小病毒属（dependoparvovirus）的成员，重组腺相关病毒（rAAV）的生产依赖于腺病毒或单纯疱疹病毒中存在的辅助基因的表达⁸。目前已开发出多种rAAV的生产策略，其中在携带腺病毒E1A/E1B辅助基因的HEK293细胞中进行生产是当前最成熟且广泛应用的方法⁹

方案

本实验方案中所用溶液和缓冲液的成分见表1。

溶液	成分
AAV 裂解缓冲液	1.2 mL 5 M NaCl 溶液
	2 mL 1 M Tris-HCl pH 8.5 溶液
	80 µL 1 M MgCl2 溶液
	用 mQ 水定容至 40 mL
AAV 沉淀溶液	40 g PEG 8000
	50 mL 5 M NaCl 溶液
	用 ....

结果

该方法可用于获得至少10的滴度¹² 每毫升病毒颗粒数。可获得滴度（图3) 通过使用提供的ITR引物进行qPCR检测 补充表1，通过 ddPCR 或任何其他滴定方法。使用次优滴度可能导致 帽 编码衣壳蛋白的基因，其包装效率较低。

另一个可能导致结果不理想的原因是Expi293细胞的转导效率较低。建议在转染当天，细胞密度保持在3-4 × 10⁶ vc/mL，并且细胞活力接近98%。在本研究中，作者按照此方案获得的病毒滴度为1.07 × 10¹² vg。该产量与此前包装AAVrh74¹⁸所获得的产量一致。

讨论

双碘海醇密度梯度纯化法是一种通用方法，因其适用于所有腺相关病毒（AAV）突变体，而不论其受体特异性如何。早期的AAV纯化方法依赖于病毒颗粒的密度，包括在氯化铯（CsCl）中进行等密度离心以及连续蔗糖密度梯度离心¹⁹。随后，发展出针对特定血清型的方法，利用结合在Sepharose柱上的单克隆抗体进行纯化²⁰。1999年开发出一种基于密度的新型纯化方法，采用不连续的碘海醇梯度，所得AAV的感染性高于从CsCl梯度中分离的病毒²¹。进入21世纪初，AAV纯化方法继续发展，一些研究团队采用高效液相色谱法纯化重组AAV（rAAV），从粗裂解液中回收率超过70%^22,23,24。这些方法至今仍用于大规模生产工艺中²⁵。尽管色谱法在AAV分离中已取得进展，碘海醇密度梯度离心纯化.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5810 R 台式离心机	Eppendorf	22625501
8通道蠕动泵	Watson-Marlow	020.3708.00A
自动细胞计数仪	NanoEntek	EVE-MC
Avanti J-E 高速离心机	Beckman Coulter	369001
苯并酶（Benzonase）	Thermo Scientific	88701
生物安全柜	Labconco	322491101
带摇床的CO2培养箱			设定为8% CO2和37 °C
锥形离心管	Thermo Scientific	339652	50 mL
锥形离心管	Thermo Scientific	339650	15 mL
一次性微量移液器	Fisherbrand	21-164-2G	毛细管
不含CaCl2和MgCl2 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）(10x)	Sigma-Aldrich	D1408
ECLIPSE Ts2R-FL 倒置显微镜	Nikon
Expi293 表达培养基	Gibco	A1435101
Expi293F 细胞	Gibco	A14527
带滤芯吸头	USA Scientific	1126-7810	1000 µL
带滤芯吸头	USA Scientific	1120-8810	200 µL
带滤芯吸头	USA Scientific	1120-1810	20 µL
带滤芯吸头	USA Scientific	1121-3810	10 µL
皮下注射针头	Tyco Healthcare	820112	20 GA x 1-1/2 A
带盖冰桶	VWR	10146-184
JS-5.3 转子	Beckman Coulter	368690
氯化镁溶液（1 M）	Millipore Sigma	M1028-100ML
金属支架和夹具	Fisherbrand	05-769-6Q
微量离心管	Eppendorf	22600028	1.5 mL
尖嘴钳
Optima XE-90 超速离心机	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I 低血清培养基	Gibco	31985062
OptiPrep 密度梯度介质（碘克沙醇）	Serumwerk	AXS-1114542	60% 碘克沙醇溶液
P1000 移液器	Gilson	F144059M
P2 移液器	Gilson	F144054M
P20 移液器	Gilson	F144056M
P200 移液器	Gilson	F144058M
酚红 溶液	Sigma-Aldrich	P0290
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	P4474
Pipet-Aid XP 移液控制器	Drummond Scientific	4-000-101
质粒 pCapsid	De novo 或 Addgene 等	N/A	我们使用了 pACGrh74。
质粒 pHelper	Addgene	112867
质粒 pTransgene	De novo 或 Addgene 等	N/A	我们使用了 pdsAAV-GFP。
Pluronic F-68 聚醇溶液（10%）	Mp Biomedicals	92750049
聚乙二醇 8000	Research Products International	P48080-500.0
聚乙烯亚胺盐酸盐 Max（PEI-Max）	Polysciences	NC1038561	用水稀释至 40 μM
聚丙烯离心管，无菌	Corning	431123	500 mL
聚丙烯离心管，无菌	Corning	430776	250 mL
聚丙烯 Optiseal 管	Beckman Coulter	361625
血清移液管	Alkali Scientific	SP250-B	50 mL
血清移液管	Alkali Scientific	SP225-B	25 mL
血清移液管	Alkali Scientific	SP210-B	10 mL
血清移液管	Alkali Scientific	SP205-B	5 mL
摇瓶	Fisherbrand	PBV1000	1 L
摇瓶	Fisherbrand	PBV50-0	500 mL
摇瓶	Fisherbrand	PBV250	250 mL
摇瓶	Fisherbrand	PBV12-5	125 mL
氯化钠溶液（5 M）	Fisher Scientific	NC1752640
无菌注射器	Fisherbrand	14-955-458	5 mL
注射器滤器	Millipore	SLGV013SL	0.22 微米
Tris-HCl pH 8.5（1 M）	Kd Medical	RGE3363
台盼蓝溶液	Gibco	15250061
离心管架组件	Beckman Coulter	361646
管间隔件（x4）	Beckman Coulter	361669
蠕动泵用管路	Fisher Scientific	14190516
70 Ti 型固定角钛转子	Beckman Coulter	337922
超低温冰箱			设定为 -70 °C
Vivaspin 20 离心浓缩器	Sartorius	VS2041
水浴锅			设定为 37 °C