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方法文章

用于体内应用的腺相关病毒悬浮培养生产及碘克沙醇密度梯度离心纯化

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DOI：

10.3791/66460

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2024年2月9日

 ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Florida

本文内容

摘要

腺相关病毒在悬浮细胞培养中生产，并通过两次碘克沙醇密度梯度离心进行纯化。本方法包含多个步骤，可提高病毒总产量，降低病毒沉淀风险，并进一步浓缩最终病毒产物。预期最终滴度可达 1012 病毒颗粒/mL，适用于临床前的 体内 实验应用。

摘要

本方案描述了通过碘克沙醇密度梯度离心法生产与纯化重组腺相关病毒（rAAV）的方法，这是一种不依赖血清型的AAV纯化技术，最早于1999年被报道。重组腺相关病毒载体广泛应用于基因治疗中，用于将转基因递送至多种人类细胞类型。在本研究中，通过将编码转基因、载体衣壳和腺病毒辅助基因的质粒转染悬浮培养的Expi293细胞来产生重组病毒。碘克沙醇密度梯度离心法依据病毒颗粒的密度对完整的AAV颗粒进行纯化。此外，该目前已被广泛应用的方法包含三个额外步骤，分别用于提高病毒总产量、降低因污染蛋白导致沉淀的风险以及进一步浓缩最终病毒产物：使用聚乙二醇（PEG）和氯化钠溶液从细胞培养上清中沉淀病毒颗粒、进行第二轮碘克沙醇密度梯度离心，以及通过离心过滤装置进行缓冲液置换。via该方法可稳定获得滴度达1012病毒颗粒/mL、纯度极高的病毒制剂，适用于in vivo实验。

引言

重组腺相关病毒（rAAV）载体是治疗遗传性疾病（包括脊髓性肌萎缩症、视网膜营养不良和A型血友病）的常用工具1,2,3。rAAV载体经过改造，去除了野生型AAV中存在的病毒基因；野生型AAV是一种小型无包膜的二十面体病毒，含有长度为4.7 kb的线性单链DNA基因组4。AAV最早于20世纪60年代在腺病毒制备物中被发现，当时作为一种污染物5。尽管其衣壳较小，限制了可包装的转基因大小（不含ITR时最大为4.9 kb）6，但AAV仍是一种有效的转基因递送载体，因其对人类无致病性，可在多种分裂和非分裂细胞类型中实现转基因表达，并且免疫原性较弱7。

作为依赖性细小病毒属（dependoparvovirus）的成员，重组腺相关病毒（rAAV）的生产依赖于腺病毒或单纯疱疹病毒中存在的辅助基因的表达8。目前已开发出多种rAAV的生产策略，其中在携带腺病毒E1A/E1B辅助基因的HEK293细胞中进行生产是当前最成熟且广泛应用的方法9。rAAV生产的一般流程始于将三种质粒共转染至HEK293细胞：分别包含位于反向末端重复序列（ITRs）内的目的基因、AAV的rep和cap基因，以及额外的腺病毒辅助基因。转染后72小时，收集细胞并进行处理，以纯化含有目的基因的rAAV。

在开发用于治疗目的的新型重组腺相关病毒（rAAV）载体过程中，一个主要目标是提高载体的转导效率。提高靶细胞的转导效率意味着临床所需rAAV剂量的减少，从而降低从抗体介导的中和反应到急性毒性等不良免疫原性反应的发生可能性10,11为了提高重组腺相关病毒（rAAV）载体的转导效率，可对包装的基因组或衣壳进行改造。调节转导效率的有效方法 通过 包装基因组设计包括引入强效且组织特异性的启动子、精心选择mRNA加工元件，以及优化编码序列以提高翻译效率12对衣壳的改造旨在增强其对靶向人细胞类型的嗜性。在开发新型重组腺相关病毒（rAAV）转基因递送载体衣壳的研究中，通常主要采用两种策略：一是通过对AAV衣壳进行理性设计，引入特定突变以靶向特定细胞受体；二是利用高复杂度的组合衣壳文库进行定向进化，从中筛选出对特定细胞类型具有嗜性的衣壳，而不针对单一特定受体（尽管有部分研究团队将这两种方法结合使用）。13,14,15在定向进化方法中，利用特定血清型骨架并在衣壳外表面的可变区域引入突变，构建组合式衣壳文库。16组合式衣壳文库通常由非人类来源的AAV血清型构建，从而降低临床应用中预先存在的免疫反应风险10因此，适用于所有血清型的纯化方法是理想选择，可避免针对这些文库所用的、作为骨架的较少见血清型进行特异性优化。

碘克沙醇密度梯度离心法可用于纯化高滴度且具有高感染活性的重组腺相关病毒（rAAV）17。本方案采用悬浮细胞培养方式生产rAAV，以减少大量制备AAV时所需的人工操作。方案中还包括一步离心处理，用于澄清细胞裂解液，以减少污染性蛋白的存在，并降低病毒沉淀的风险。该方法是一种经济有效的策略，可制备适用于临床前研究的高纯度rAAV制剂。

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方案

本实验方案中所用溶液和缓冲液的成分见表1。

溶液成分
AAV 裂解缓冲液1.2 mL 5 M NaCl 溶液
2 mL 1 M Tris-HCl pH 8.5 溶液
80 µL 1 M MgCl2 溶液
用 mQ 水定容至 40 mL
AAV 沉淀溶液40 g PEG 8000
50 mL 5 M NaCl 溶液
用 mQ 水定容至 100 mL
15% 碘克沙醇组分7.5 mL OptiPrep
3 mL 10X DPBS
6 mL 5 M NaCl 溶液
30 µL 1 M MgCl2 溶液
用 mQ 水定容至 30 mL
25% 碘克沙醇组分12.5 mL OptiPrep
3 mL 10X DPBS
30 µL 1 M MgCl2 溶液
60 µL 酚红溶液
用 mQ 水定容至 30 mL
40% 碘克沙醇组分33.3 mL OptiPrep
5 mL 10X DPBS
50 µL 1 M MgCl2 溶液
用 mQ 水定容至 50 mL
60% 碘克沙醇组分50 mL OptiPrep
100 µL 酚红溶液
AAV 缓冲液溶液8 mL 5 M NaCl
20 µL 10% Pluronic F-68
用 PBS 定容至 200 mL

表1：本实验方案中所用溶液的组分。

1. Expi293 细胞的三重转染

  1. 以每毫升 5 × 105 个活细胞（vc/mL）的初始密度接种 Expi293 细胞（参见材料表）。
  2. 将细胞在 37 °C、8% CO2 及 125 rpm 摇床速度条件下培养，直至细胞密度达到 3–5 × 106 vc/mL。使用台盼蓝染色法结合自动细胞计数仪（参见材料表）监测细胞密度和活率。
  3. 当细胞达到目标密度时，按 1:10 比例用新鲜培养基稀释，使总体积为原体积的 10 倍。如有需要，转移至更大规格的培养瓶中。继续放入培养箱中培养。
  4. 按照步骤 1.2–1.3 所述方法继续扩增细胞，直至在 1 L 培养瓶中的 250 mL 培养基内达到至少 2 × 106 vc/mL 的细胞密度。
  5. 转染前一天，将细胞用培养基稀释至 2 × 106 vc/mL，总体积为 250 mL，必要时弃去多余细胞。过夜培养。
  6. 转染当天，取一半细胞在 18 °C 下以 58 × g 离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于等体积（125 mL）的新鲜培养基中。细胞活率应接近 98%。
  7. 准备两个 50 mL 圆锥形离心管，分别标记为“PEI”和“DNA”。
  8. 在标记为“PEI”的离心管中，将 1.2 mL PEI（聚乙烯亚胺，参见材料表）用 OptiMEM 培养基稀释至总体积为 12.5 mL。
  9. 在标记为“DNA”的离心管中，配制等摩尔浓度的质粒 DNA 溶液，总 DNA 量为 500 µg，用 OptiMEM 培养基定容至 12.5 mL。
  10. 将 DNA 溶液加入 PEI 溶液中，轻轻翻转数次以充分混匀，并在室温下静置孵育 10 分钟。
    注意：为确保 PEI 与 DNA 形成带电复合物，DNA-PEI 溶液必须完整孵育满 10 分钟。
  11. DNA-PEI 溶液孵育 10 分钟后，使用移液管缓慢将 DNA-PEImax 混合液加入 Expi293 细胞中。将转染后的细胞放回培养箱，继续培养 72 小时（图 1）。

细胞的荧光显微镜图像；光学激发，发射分析，100 µm 比例尺。
图1：转染后两天表达GFP的Expi293细胞。 使用含有GFP基因的质粒转染后，Expi293细胞瞬时表达eGFP。细胞形态呈圆形。图像的曝光时间为15 ms。显微镜图像采用配备落射荧光照明装置和10x/0.30物镜的倒置显微镜获取。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. rAAV 载体纯化

  1. 72 小时后，将悬浮细胞转移至两个 250 mL 锥形管中，在 4 °C 条件下以 415 × g 离心 10 分钟。
  2. 将上清培养基倒入一个新的 500 mL 锥形管中，置于 0 °C 冰上保存，用于后续处理。
  3. 用 10 mL AAV 裂解缓冲液重悬每个细胞沉淀（表 1），将两份裂解液合并至其中一根管中。用额外的 5 mL AAV 裂解缓冲液冲洗另一根管，然后将冲洗液加入合并的裂解液中。于 -70 °C 冻存。
    注意：实验可在此处暂停。建议将上清培养基于 -70 °C 冻存，而非置于冰上。
  4. 向步骤 2.2 获得的上清培养基中加入 1:4 体积的 AAV 沉淀液。颠倒数次以充分混匀，并在 0 °C 冰上孵育至少 2 小时或过夜。
  5. 在 4 °C 条件下以 3000 × g 离心孵育后的溶液 1 小时。
  6. 弃去上清，用 5 mL AAV 裂解缓冲液重悬含有病毒沉淀的沉淀物。
  7. 将细胞裂解液在 37 °C 水浴中解冻。
  8. 将病毒沉淀与细胞裂解液合并，得到粗裂解液。用额外的 5 mL AAV 裂解缓冲液冲洗原先盛有病毒沉淀的离心管，并将冲洗液并入粗裂解液中。
  9. 将粗裂解液于 -70 °C 冻结，然后在 37 °C 解冻。重复此冻融循环一次。
    注意：粗裂解液在 37 °C 的停留时间应尽可能短，仅限完成解冻所需时间。
  10. 第三次解冻后，立即向粗裂解液中加入 4 µL 苯甲酸酶，颠倒混匀，在 37 °C 孵育 30 分钟。
  11. 在 18 °C 条件下以 650 × g 离心粗裂解液 10 分钟。
  12. 将上清转移至洁净的 50 mL 锥形管中，此即粗病毒液。弃去沉淀。
  13. 在 18 °C 条件下以 3000 × g 再次离心粗病毒液 30 分钟，以去除污染性蛋白。
  14. 将上清转移至洁净的 50 mL 锥形管中，此即澄清病毒液。
    注意：实验可在此处暂停。可将澄清病毒液于 -70 °C 冻存。
  15. 安装多通道蠕动泵并连接四根蠕动管（见材料表）。在每根管的两端连接毛细管。
  16. 将泵输入端的毛细管置于盛有去离子水的烧杯中，输出端的毛细管置于空烧杯中。以 25.0 rpm 运行蠕动泵，用去离子水冲洗管路。
  17. 充分冲洗后，继续运行泵直至管路内仅充满空气，排空管路。将所有毛细管平放在洁净的无尘纸上。
  18. 在泵输出端的支架上放置四个超速离心管。
  19. 使用 10 mL 血清移液管，小心地将 10 mL 澄清病毒液加入每个超速离心管中，注意避免引入气泡。
    注意：如有需要，每管澄清病毒液的体积可增至最多 12 mL。此时应相应减少步骤 2.25 中 60% 碘克沙醇的用量。
  20. 使用蠕动泵，从最低密度到最高密度依次将碘克沙醇梯度液（表 1）铺置于澄清病毒液下方。先加入 15% 梯度液，随后依次为 25%、40% 和 60% 梯度液。将 22 mL（每超速离心管 5.5 mL）15% 碘克沙醇梯度液转移至洁净的 50 mL 锥形管中。将泵输入端的毛细管插入该管中，确保所有毛细管均接触管底。
  21. 启动泵，使管路充满碘克沙醇梯度液。当碘克沙醇梯度液到达泵输出端毛细管末端时，停止泵。
  22. 将一根输出端毛细管插入每个含有澄清病毒液的超速离心管中，确保毛细管接触管底。
    注意：毛细管中不得残留空气。由于碘克沙醇在蠕动管中流动速度可能略有差异，因此在插入澄清病毒液前，必须确保每根输出端毛细管完全充满碘克沙醇。可能需要多次启停泵以实现此目的。
  23. 启动泵，使超速离心管逐渐充满液体。当 15% 梯度液即将被吸入输入端毛细管时，停止泵。必须确保无气泡进入蠕动管路。
    注意：若气泡进入输入端毛细管，可短暂反向运行泵以将其排出。
  24. 将 22 mL（每超速离心管 5.5 mL）25% 碘克沙醇梯度液转移至 50 mL 锥形管中。确保所有毛细管接触管底，然后启动泵。当 25% 梯度液即将被吸入输入端毛细管时，停止泵。
  25. 重复步骤 2.24，依次加入 20 mL（每超速离心管 5 mL）40% 碘克沙醇梯度液和 24 mL（每超速离心管 6 mL）60% 梯度液。
  26. 若超速离心管中仍有未填充空间，继续加入 60% 梯度液，直至管内完全充满液体。
  27. 加样至液面在管口形成凸面但不溢出为止。停止泵，小心移除每根输出端毛细管，注意不要扰动碘克沙醇梯度。
  28. 为每个超速离心管加盖并插入垫片，装入 Type 70 Ti 转子（见材料表）。
    注意：确保转子平衡。未经适当培训，不得操作超速离心机。
  29. 将 Type 70 Ti 转子装入超速离心机，在 18 °C 条件下以 489,000 × g 离心 1 小时。
  30. 离心结束后，从超速离心机中取出转子。使用尖嘴钳小心地从转子中取出每个超速离心管，注意不要扰动碘克沙醇梯度。
  31. 使用带夹子的支架固定一根超速离心管。
  32. 将 20 号针头连接至 5 mL 注射器，备用。用无尘纸擦去超速离心管盖。
  33. 用针头在超速离心管管壁上穿刺，位置位于 40%-60% 碘克沙醇界面下方约 3 mm 处（图 2）。
  34. 缓慢吸取界面及部分 40% 梯度层，避免吸取 40% 梯度层上部，总吸取量约为 4 mL。
  35. 用手指堵住超速离心管顶部开口，拔出注射器，将吸取的 AAV 组分转移至 50 mL 锥形管中。将注射器弃入锐器盒，超速离心管弃去。
  36. 对每个超速离心管重复步骤 2.31–2.35。
  37. 用 AAV 裂解缓冲液将吸取的 AAV 组分稀释约两倍，终体积为 40 mL。
  38. 按照步骤 2.16–2.17 所述方法冲洗蠕动管路。
    注意：实验可在此处暂停。可将稀释后的 AAV 组分于 0 °C 保存过夜。
  39. 将 20 mL 稀释后的 AAV 组分分别加入两个新的超速离心管中。
  40. 进行第二轮碘克沙醇密度梯度离心时，仅使用 10 mL（每管 5 mL）40% 梯度液和 14 mL（每管 7 mL）60% 梯度液，按上述方法将稀释后的 AAV 组分铺置于梯度下方。重复步骤 2.29–2.36 进行超速离心和吸取。
    注意：在存放蠕动泵和管路前，需按照步骤 2.16–2.17 所述方法用去离子水冲洗管路。

密度梯度离心结果；试管中分层溶液显示大分子分离。
图 2：碘克沙醇梯度，标注 40%-60% 碘克沙醇界面。（A）第一次碘克沙醇梯度。酚红被用于 40% 和 60% 碘克沙醇组分中，由于两组分间 pH 值不同，呈现不同颜色。箭头指示了注射器插入位置，以收集 rAAV 组分，该位置位于 40%-60% 碘克沙醇界面下方。 （B）第二次碘克沙醇梯度。此步骤仅使用 40% 和 60% 碘克沙醇组分。箭头指示了注射器插入位置，以收集 rAAV 组分。请点击此处查看此图的放大版本。

3. 缓冲液置换与病毒浓缩

  1. 在获得第二轮碘克沙醇密度梯度离心的AAV组分后，用AAV缓冲液将其稀释两倍。
  2. 通过向滤膜上方加入 20 mL AAV 缓冲液来平衡离心滤器。以 3000 x g 在 18 °C 5 分钟后弃去流出液。
  3. 将稀释后的 AAV 组分加入离心过滤装置中。以 3000 x g 在 18 °C 5 分钟后弃去流出液。
  4. 向滤膜上方加入 20 mL AAV 缓冲液。将装置在 3000 x g 在 18 °C 5 分钟后弃去流出液。
    注意：若离心滤膜发生堵塞，导致溶液流过效率降低，可小心使用P200移液器在滤膜上方反复吸取溶液。务必注意不要使移液器吸头接触滤膜。
  5. 重复步骤 3.4 两次。
    注意：确保AAV浓缩过程中滤器顶部始终保留至少1 mL体积，以避免过度浓缩。可能需要调整离心时间以防止过度浓缩。若AAV过度浓缩，可能发生沉淀。
  6. 最终滴度在10的范围内12 vg/mL，离心浓缩病毒至终体积约1 mL。
    注意：根据所使用的血清型骨架及病毒的包装效率，您可能需要将病毒浓缩至较小体积。
  7. 使用 p1000 移液器将浓缩的 AAV 从离心过滤器顶部转移至微量离心管中。使用 p200 移液器用 50 µL 加入AAV缓冲液以收集任何残留的病毒，并与其余浓缩的AAV合并。
  8. 暂置一旁 2 µL 用于滴度测定的浓缩 AAV 分装样品。参见 补充表1 查看可用于qPCR的ITR引物。
  9. 将浓缩的 AAV 通过一个 0.2 µm 使用注射器滤器进行灭菌。
    注意：对小体积样品进行灭菌时，应选择小直径的注射器滤器，以尽量减少病毒损失。使用小直径的低蛋白结合滤器可将病毒损失降至最低（数据未显示）。
  10. 灭菌后的 AAV 可立即用于转导细胞，或保存于 4 °C 四周期间使用。应于 -70 °C 用于长期保存。

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结果

该方法可用于获得至少10的滴度12 每毫升病毒颗粒数。可获得滴度（图3) 通过使用提供的ITR引物进行qPCR检测 补充表1，通过 ddPCR 或任何其他滴定方法。使用次优滴度可能导致 帽 编码衣壳蛋白的基因，其包装效率较低。

另一个可能导致结果不理想的原因是Expi293细胞的转导效率较低。建议在转染当天，细胞密度保持在3-4 × 106 vc/mL，并且细胞活力接近98%。在本研究中，作者按照此方案获得的病毒滴度为1.07 × 1012 vg。该产量与此前包装AAVrh7418所获得的产量一致。

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讨论

双碘海醇密度梯度纯化法是一种通用方法，因其适用于所有腺相关病毒（AAV）突变体，而不论其受体特异性如何。早期的AAV纯化方法依赖于病毒颗粒的密度，包括在氯化铯（CsCl）中进行等密度离心以及连续蔗糖密度梯度离心19。随后，发展出针对特定血清型的方法，利用结合在Sepharose柱上的单克隆抗体进行纯化20。1999年开发出一种基于密度的新型纯化方法，采用不连续的碘海醇梯度，所得AAV的感染性高于从CsCl梯度中分离的病毒21。进入21世纪初，AAV纯化方法继续发展，一些研究团队采用高效液相色谱法纯化重组AAV（rAAV），从粗裂解液中回收率超过70%22,23,24。这些方法至今仍用于大规模生产工艺中25。尽管色谱法在AAV分离中已取得进展，碘海醇密度梯度离心纯化...

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披露

作者无任何披露事项需要报告。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5810 R 台式离心机Eppendorf22625501
8通道蠕动泵 Watson-Marlow020.3708.00A
自动细胞计数仪 NanoEntekEVE-MC
Avanti J-E 高速离心机Beckman Coulter369001
苯并酶（Benzonase）Thermo Scientific88701
生物安全柜Labconco322491101
带摇床的CO2培养箱 设定为8% CO2和37 °C
锥形离心管Thermo Scientific33965250 mL
锥形离心管Thermo Scientific33965015 mL
一次性微量移液器Fisherbrand21-164-2G毛细管
不含CaCl2和MgCl2 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）(10x)Sigma-AldrichD1408
ECLIPSE Ts2R-FL 倒置显微镜Nikon
Expi293 表达培养基GibcoA1435101
Expi293F 细胞GibcoA14527
带滤芯吸头USA Scientific1126-78101000 µL
带滤芯吸头USA Scientific1120-8810200 µL
带滤芯吸头USA Scientific1120-181020 µL
带滤芯吸头USA Scientific1121-381010 µL
皮下注射针头Tyco Healthcare82011220 GA x 1-1/2 A
带盖冰桶VWR10146-184
JS-5.3 转子Beckman Coulter368690
氯化镁溶液（1 M）Millipore SigmaM1028-100ML
金属支架和夹具 Fisherbrand05-769-6Q
微量离心管Eppendorf226000281.5 mL
尖嘴钳
Optima XE-90 超速离心机Beckman CoulterA94471
Opti-MEM I 低血清培养基Gibco31985062
OptiPrep 密度梯度介质（碘克沙醇）SerumwerkAXS-111454260% 碘克沙醇溶液
P1000 移液器GilsonF144059M
P2 移液器GilsonF144054M
P20 移液器GilsonF144056M
P200 移液器GilsonF144058M
酚红 溶液Sigma-AldrichP0290
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichP4474
Pipet-Aid XP 移液控制器Drummond Scientific4-000-101
质粒 pCapsidDe novo 或 Addgene 等 N/A我们使用了 pACGrh74。 
质粒 pHelperAddgene112867
质粒 pTransgeneDe novo 或 Addgene 等 N/A我们使用了 pdsAAV-GFP。
Pluronic F-68 聚醇溶液（10%）Mp Biomedicals92750049
聚乙二醇 8000Research Products InternationalP48080-500.0
聚乙烯亚胺盐酸盐 Max（PEI-Max）PolysciencesNC1038561用水稀释至 40 μM
聚丙烯离心管，无菌Corning431123500 mL
聚丙烯离心管，无菌Corning430776250 mL
聚丙烯 Optiseal 管Beckman Coulter361625
血清移液管Alkali ScientificSP250-B50 mL
血清移液管Alkali ScientificSP225-B25 mL
血清移液管Alkali ScientificSP210-B10 mL
血清移液管Alkali ScientificSP205-B5 mL
摇瓶FisherbrandPBV10001 L
摇瓶FisherbrandPBV50-0500 mL
摇瓶FisherbrandPBV250250 mL
摇瓶FisherbrandPBV12-5125 mL
氯化钠溶液（5 M）Fisher ScientificNC1752640
无菌注射器Fisherbrand14-955-4585 mL
注射器滤器MilliporeSLGV013SL0.22 微米
Tris-HCl pH 8.5（1 M）Kd MedicalRGE3363
台盼蓝溶液Gibco15250061
离心管架组件Beckman Coulter361646
管间隔件（x4）Beckman Coulter361669
蠕动泵用管路Fisher Scientific14190516
70 Ti 型固定角钛转子Beckman Coulter337922
超低温冰箱设定为 -70 °C
Vivaspin 20 离心浓缩器SartoriusVS2041
水浴锅 设定为 37 °C

参考文献

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