我们描述了一种通过肠道操作建立的小鼠术后肠梗阻模型。在手术后24小时评估了胃肠道传输功能、病理变化以及免疫细胞的活化情况。
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本文内容
摘要
摘要
大多数患者在术后会出现术后肠梗阻（POI），这与发病率、死亡率以及住院时间的增加相关。POI 是手术过程中机械性损伤所导致的后果，会引起胃肠道运动功能的紊乱。POI 的发生机制与神经元敏感性异常、上皮屏障功能受损以及局部炎症反应增强有关。然而，其具体机制仍不明确。因此，实验性小鼠模型对于阐明 POI 损伤的病理生理机制以及开发新型治疗方法至关重要。
本文介绍了一种通过肠道操作（IM）建立的小鼠术后肠梗阻（POI）模型，该模型模拟了临床手术过程；具体操作是使用棉签对腹部进行1至3次按摩，从而对小肠造成机械性损伤。术后24小时，通过FITC-葡聚糖灌胃及检测消化道各节段的荧光信号，评估胃肠道传输功能，结果显示IM导致胃肠道传输延迟。此外，通过苏木精-伊红染色和流式细胞术分析了黏膜下层组织水肿及免疫细胞浸润情况。IM操作中施加适当的压力以及在肠道上产生充血效应，是该方法成功的关键。这一小鼠POI模型可用于研究腹部手术后肠道损伤与恢复的机制。
引言
术后肠梗阻（POI）是一种在人类健康领域中具有重大挑战性的综合征，尤其在接受腹部手术的患者管理中尤为突出。POI以胃肠道运动功能恢复延迟为特征，导致住院时间延长和医疗成本增加，然而目前尚无公认的定义、病因或治疗方法1。近期研究表明，免疫细胞在POI进展中发挥关键作用2,3,4，但仍需进一步研究以阐明其潜在机制。
在本实验方案中，我们介绍了一种通过腹腔内手术诱导小鼠术后肠功能障碍（POI）的动物模型，该模型能够较好地模拟腹部手术对消化道的影响。我们的目标是提供一种标准化的小鼠POI建模方法，以帮助研究人员深入探究其病理生理机制，并探索新的治疗干预手段。
开发和利用该技术的理论基础在于需要可靠的临床前模型来研究术后肠梗阻（POI）。传统的POI研究方法往往缺乏转化相关性，或无法充分反映导致该病症的多种因素之间的复杂相互作用。通过建立一种能紧密模拟临床情况的小鼠模型，研究人员可以在受控的实验环境中更准确地探究POI的潜在机制，并评估潜在的治疗干预措施。
与替代技术相比，本方案中介绍的小鼠POI模型具有多项优势。首先，我们将实验结果与最新研究....
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方案
动物饲养和实验操作均遵循《实验动物护理与使用指南原则（中国）》，并经北京友谊医院伦理审查委员会批准（编号：20-2056）。本研究采用 C57BL/6 小鼠（8–12 周龄）。
1. 手术准备
- 在计划建模前 12 小时对所有小鼠进行禁食，以满足实验条件的标准化要求（图 1A）。
- 准备并灭菌手术器械。
- 准备麻醉剂三溴乙醇和加热垫。监测加热垫以防止过热，并保持其温度恒定（37.5 °C）。
2. 麻醉
- 用三溴乙醇对每只小鼠进行麻醉。
- 将三溴乙醇稀释，用生理盐水配制成 20 mg/mL 的溶液。按每 10 g 体重 0.2 mL 的剂量，通过腹腔注射给予三溴乙醇工作液。在小鼠眼睛上涂抹眼用软膏，以防止麻醉期间眼睛干燥。
- 确保小鼠在 5 分钟内完全麻醉，并维持麻醉状态至少 20 分钟。
- 通过观察小鼠是否无法保持直立姿势并检查肌肉是否松弛来评估麻醉深度。观察其自主运动、眨眼反射以及对反射刺激（如用力捏脚趾或尾巴）的反应是否消失。
- 通过观察胸壁和腹部的运动来监测小鼠的呼吸频率和呼吸模式。在理想麻....
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结果
在本实验方案中，通过肠操作（IM）手术诱导术后肠梗阻（POI），该方法模拟了临床手术的影响。假手术组仅进行切口，但不进行肠操作。在POI手术后24小时，处死POI小鼠及假手术对照组小鼠。通过灌胃给予FITC-葡聚糖检测消化道的关键功能——内容物传输功能。由于在小肠近端的FITC荧光强度增加，表明POI模型构建成功（图2B）。通过计算平均胃肠传输指数（GCs）来量化IM引起的传输功能障碍，并用以反映手术操作的一致性（图2C）。
HE染色显示了消化道不同节段的形态学特征（图3）。在POI诱导后24小时，十二指肠和回肠的黏膜下层及平滑肌层出现肿胀（图3A、B）。与假手术小鼠相比，POI小鼠十二指肠的HE染色显示免疫细胞浸润增加（图3A）。
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讨论
手术的成功依赖于多个关键步骤。首先，在肠道壁内（IM）手术过程中保持操作的一致性至关重要，以对小肠造成广泛的损伤。在IM操作过程中施加适当的压力，以及由此在肠壁上产生的充血效应，是手术成功的关键。用棉签擦拭后观察到整个消化道变为粉红色，并出现红色出血点，是手术成功的指标。此外，术后平均GC值维持在约5，表明与假手术小鼠相比，该模型构建成功。通过苏木精-伊红（HE）染色显示的黏膜下层组织水肿及免疫细胞浸润的显微镜检查，也是验证术后肠麻痹（POI）严重程度的关键步骤。
为了优化实验结果或解决遇到的问题，可能需要对实验方案进行调整。例如，为了准确显示肠上皮的形态学变化，建议使用卡诺氏固定液（Carnoy's fixative）将肠道组织连同其内容物一起包埋9。这种独特的包埋方法可实现快速固定，对于保持组织形态至关重要。然而，如果研究目标集中在上皮层或固有层，建议采用改良的瑞士卷技术进行肠道组织的石蜡包埋10。该技术可压缩肠道组织间的间隙，并确保绒毛方向一致，从而便于将整个小肠包埋于单个石蜡样本.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢北京临床研究中心和北京友谊医院的实验动物中心提供动物护理。本工作由国家关键技术研发项目资助&D 计划（编号：2015BAI13B09）、北京市自然科学基金（编号：7232035）、国家自然科学基金（编号：82171823、82374190）以及北京友谊医院杰出青年学者项目（编号：yyqcjh2022-4）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 M HEPES | Thermo | 15630080 | |
| APC 抗小鼠 I-A/I-E (MHC-II) | Biolegend | 107614 | |
| APC 抗小鼠 TCRb | Biolegend | 109212 | |
| APC/Cy7 抗小鼠 CD4 | Biolegend | 100414 | |
| APC/Cy7 抗小鼠 Ly6G | Biolegend | 127624 | |
| Brilliant Violet 421 抗小鼠 CD69 | Biolegend | 104545 | |
| Brilliant Violet 421 抗小鼠 F4/80 | Biolegend | 123132 | |
| Brilliant Violet 785 抗小鼠/人 CD44 | Biolegend | 103041 | |
| BUV395 抗小鼠 CD8a | BD | 563786 | |
| BUV737 抗小鼠 CD3e | BD | 612771 | |
| 胶原酶 IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 培养显微镜 | CKX53 | Olympus | |
| 牛胰脱氧核糖核酸酶 I (DNase I) | Sigma-Aldrich | DN25-5G | |
| DL-二硫苏糖醇溶液 | Sigma-Aldrich | 43816-10ML | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-100G | |
| FITC 抗小鼠 CD45 | Biolegend | 147709 | |
| FITC-葡聚糖 (70 kWM) | Sigma-Aldrich | FD70-100MG | 胃肠道转运实验 |
| HE 染色试剂盒 | solarbio | G1120 | |
| PE 抗小鼠 CD11b | Biolegend | 101208 | |
| PE 抗小鼠 PD-1 | Biolegend | 114118 | |
| PE/Cy7 抗小鼠 CD11c | Biolegend | 117318 | |
| Percoll | GE (Pharmacia) | 17-0891-01 | |
| Symphony A5 流式细胞仪 | BD | - | 免疫细胞检测与分选 |
| 三溴乙醇 | Sigma-Aldrich | T48402 | 麻醉剂 |
| Varioskan LUX | Thermo | N16699 | 多功能微孔板读板仪 |
| Zombie Aqua 可固定活力检测试剂盒 | Biolegend | 423102 | 荧光细胞活力染料 |
参考文献
- Chapman, S. J., Pericleous, A., Downey, C., Jayne, D. G. Postoperative ileus following major colorectal surgery. Br J Surg. 105 (7), 797-810 (2018).
- Farro, G., et al. CCR2-dependent monocyte-derived macrophages resolve inflammation and restore gut motili....
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重印与许可
