高分辨率串联质谱法用于研究菊三七（Gynura bicolor DC）的化学成分

摘要

我们介绍了一种将高分辨率质谱分析与分子对接相结合的通用方案，用于中药研究。

摘要

所需化学成分的分离与分析是中药基础研究中的重要课题。超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱法（UPLC-Q-TOF-MS/MS）已逐渐成为鉴定中药成分的主流技术。Gynura bicolor DC.（BFH）是中国一种药食两用的多年生无茎草本植物，具有清热、润肺、止咳、散瘀、消肿等药用功效。多酚类和黄酮类化合物含有大量异构体，阻碍了对BFH中复杂化合物的鉴定。本文提出了一种基于溶剂提取及UPLC-Q-TOF-MS整合数据研究BFH化学成分的系统性方案。

本文所述方法包括样品预处理、质谱校准、质谱采集、数据处理及结果分析的系统性操作流程。样品预处理涵盖样品采集、清洗、干燥、粉碎和提取等步骤。质谱校准包括多点校正和单点校正。数据处理包括数据导入、方法建立、分析处理和结果呈现。本文展示了菊三七（Gynura bicolor DC.，BFH）中酚酸类、酯类和糖苷类化合物典型裂解模式的代表性结果。此外，还详细讨论了有机溶剂选择、提取方法、数据整合、碰撞能量选择及方法优化等内容。该通用型实验方案可广泛应用于中药中复杂化合物的鉴定。

引言

中药在中国已有数千年的临床应用历史，在维护中国人民健康方面发挥着重要作用¹。中药的组成多样且复杂，许多关于化学成分的定性研究已广泛报道了中药的化学构成²。中药中的化学成分大致可分为以下几类：生物碱、有机酸、苯丙素类、香豆素类、木脂素类、醌类、黄酮类、萜类、三萜皂苷、甾体皂苷、强心苷以及鞣质³。由于中药中含有大量未知成分及难以区分的异构体，目标化学成分的分离与分析成为中药基础研究中的重要课题⁴。

超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF-MS）已应用于分析中药（TCM）中的化学成分，这些成分可通过超高效液相色谱进行分离^5,6。质谱的高分辨率可提供丰富的离子信息，用于数据库比对分析，质量误差可控制在5 ppm以内⁷。开启碰撞能量后，二级质谱模式可获得二级碎片离子，其强度和数量受碰撞能量大小的影响⁸。

Gynura bicolor DC.（BFH）是一种多年生无茎草本植物，在中国为特有珍稀濒....

方案

1. 样品预处理

1. 用纯水清洗BFH全草，直至无可见残留物和杂质。将清洗干净的BFH放入培养皿中，然后置于烘箱内（图1B）。设置烘箱温度为50 °C，干燥24小时。
   注意：BFH全株采自中国四川省。
2. 使用高速多功能粉碎机将干燥的BFH粉碎。将粗粉过50目筛（图1C）。收集细粉于密封袋中，并储存于干燥塔内。
3. 准确称取6份BFH样品，每份0.25 g，分别放入6个锥形瓶中。向每个锥形瓶中加入30 mL有机溶剂（分别为50%乙醇-水、70%乙醇-水、氯仿、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇）（图1D）。
4. 将混合物转移至超声波清洗仪中，在25 °C条件下超声提取30分钟。在14,000 × g 条件下离心5分钟。准备注射器和0.22 μm有机系微孔滤膜。将所有上清液过滤至2 mL样品瓶中。

2. 质谱校准

1. 使用1,000 µL量程移液器，将500 µL的0.1 M氢氧化钠溶液转移至100 mL容量瓶中，然后将450 µL去离子水或超纯水转移至该100 mL容量瓶中（

结果

以BFH的化学成分鉴定为模型展示代表性结果。溶剂提取物的基峰色谱图 Gynura bicolor DC. 如下所示 补充文件1—补充图S1-S6，观察到的保留时间（RT）、组分名称、分子式、质荷比（m/z）及质量误差列于表S1-S6中。在ZBTK中，所有35种化合物均通过UPLC-TOF-MS分离峰鉴定得出。如图所示 补充文件 1-补充表 S1，主要化学成分包括有机酸（奎尼酸、DL-苹果酸、柠檬酸、邻香豆酸和3-O-反式香豆酰奎宁酸）、苷类（龙胆苦苷、苦杏苷II、苦地苷J、柯普林和龙脑-2-O-β-D-吡喃阿普糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷）以及酯类（银杏内酯B、柠檬酸三甲酯和反式-O-葡萄糖基-甲基-反式-肉桂酸酯）。在ZBTK-CT中，还检测到25种额外化合物（补充文件 1-补充表 S2，并观察到45种总化合物。

使用氯仿作为萃取剂时，共检测到50种化合物。其中，28种额外化合物包括冠状酸、三棱酸、绵毛桤木素A和甲基芸香.......

讨论

除了水煎煮法¹²，有机溶剂提取是中药前处理的另一种常用方法¹³。根据相似相溶原理，已采用多种有机溶剂组合提取出大量成分¹⁴。超声辅助提取是获取中药成分的主要方法之一¹⁵。超临界二氧化碳提取适用于提取木脂素等特定类型的物质¹⁶。此外，离子液体（ILs）中的微波辅助提取已被研究作为传统有机溶剂提取的替代方法¹⁷。然而，微波能量的精确控制难以实现，可能导致醚化脱水和酯化脱水等副反应。

优化碰撞能量设置可获得额外的二级质谱碎片信息。串联质谱（即 MS^E 模式）通过两个并行交替扫描提供信息：使用低能量扫描获取分子离子信息，或使用高能量扫描获取全扫描范围内的准确质量碎片离子信息¹⁸。在设置高能量参数时，通常采用 10–35 V 的斜坡式碰撞能.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯仿	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	CAS 67-66-3
乙醇	Chuandong Chemical	CAS 64-17-5
乙酸乙酯	Chuandong Chemical	CAS 141-78-6
液相色谱仪	Waters	ACQUITY Class 1 plus
MassLynx	Waters	V4.2	质谱控制软件
正丁醇	Chuandong Chemical	CAS 71-36-3
石油醚	Chuandong Chemical	CAS 8032-32-4
四极杆飞行时间质谱	Waters	SYNAPT XS
UNIFI	Waters		数据分析软件