我们介绍了一种将高分辨率质谱分析与分子对接相结合的通用方案，用于中药研究。
方法文章
高分辨率串联质谱法用于研究菊三七（Gynura bicolor DC）的化学成分
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
所需化学成分的分离与分析是中药基础研究中的重要课题。超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱法（UPLC-Q-TOF-MS/MS）已逐渐成为鉴定中药成分的主流技术。Gynura bicolor DC.（BFH）是中国一种药食两用的多年生无茎草本植物，具有清热、润肺、止咳、散瘀、消肿等药用功效。多酚类和黄酮类化合物含有大量异构体，阻碍了对BFH中复杂化合物的鉴定。本文提出了一种基于溶剂提取及UPLC-Q-TOF-MS整合数据研究BFH化学成分的系统性方案。
本文所述方法包括样品预处理、质谱校准、质谱采集、数据处理及结果分析的系统性操作流程。样品预处理涵盖样品采集、清洗、干燥、粉碎和提取等步骤。质谱校准包括多点校正和单点校正。数据处理包括数据导入、方法建立、分析处理和结果呈现。本文展示了菊三七（Gynura bicolor DC.，BFH）中酚酸类、酯类和糖苷类化合物典型裂解模式的代表性结果。此外，还详细讨论了有机溶剂选择、提取方法、数据整合、碰撞能量选择及方法优化等内容。该通用型实验方案可广泛应用于中药中复杂化合物的鉴定。
引言
中药在中国已有数千年的临床应用历史，在维护中国人民健康方面发挥着重要作用1。中药的组成多样且复杂，许多关于化学成分的定性研究已广泛报道了中药的化学构成2。中药中的化学成分大致可分为以下几类：生物碱、有机酸、苯丙素类、香豆素类、木脂素类、醌类、黄酮类、萜类、三萜皂苷、甾体皂苷、强心苷以及鞣质3。由于中药中含有大量未知成分及难以区分的异构体，目标化学成分的分离与分析成为中药基础研究中的重要课题4。
超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF-MS）已应用于分析中药（TCM）中的化学成分，这些成分可通过超高效液相色谱进行分离5,6。质谱的高分辨率可提供丰富的离子信息，用于数据库比对分析，质量误差可控制在5 ppm以内7。开启碰撞能量后，二级质谱模式可获得二级碎片离子，其强度和数量受碰撞能量大小的影响8。
Gynura bicolor DC.（BFH）是一种多年生无茎草本植物，在中国为特有珍稀濒危植物，广泛用于药用和食用（图1A）9。BFH富含花青素、多酚、黄酮类化合物，具有较强的抗氧化能力10。其药用功效包括清热、凉血、润肺、止咳、散瘀、消肿、解暑、退热等。目前针对BFH化学成分的研究较少11。多酚类和黄酮类化合物含有大量异构体，使得BFH中复杂化合物的鉴定较为困难。因此，亟需建立一种通用的化学成分鉴定方法，可适用于各类中药研究。本研究旨在报道一种基于溶剂萃取及超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）整合数据的系统性研究BFH化学成分的实验方案。
方案
1. 样品预处理
- 用纯水清洗BFH全草，直至无可见残留物和杂质。将清洗干净的BFH放入培养皿中，然后置于烘箱内（图1B）。设置烘箱温度为50 °C，干燥24小时。
注意：BFH全株采自中国四川省。 - 使用高速多功能粉碎机将干燥的BFH粉碎。将粗粉过50目筛（图1C）。收集细粉于密封袋中，并储存于干燥塔内。
- 准确称取6份BFH样品，每份0.25 g，分别放入6个锥形瓶中。向每个锥形瓶中加入30 mL有机溶剂（分别为50%乙醇-水、70%乙醇-水、氯仿、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇）（图1D）。
- 将混合物转移至超声波清洗仪中，在25 °C条件下超声提取30分钟。在14,000 × g 条件下离心5分钟。准备注射器和0.22 μm有机系微孔滤膜。将所有上清液过滤至2 mL样品瓶中。
2. 质谱校准
- 使用1,000 µL量程移液器，将500 µL的0.1 M氢氧化钠溶液转移至100 mL容量瓶中，然后将450 µL去离子水或超纯水转移至该100 mL容量瓶中（图2).
- 使用200 µL量程移液器，向100 mL容量瓶中加入50 µL甲酸。用90:10异丙醇:水定容至100 mL，并将溶液超声处理5 min。将容量瓶标记为 90:10 的异丙醇:水溶液中含 0.5 mM 甲酸钠 并将其储存在冰箱中。
注意：甲酸钠溶液在室温下有效期为1周。 - 启动UPLC-Q-TOF-MS控制软件，然后打开 质谱调谐 窗。在 样本流控制 面板，设定为 25 μL/min 输注流速 选项并选择 C 储液池 选项。等待约1分钟，直至自动清洗结束。
- 点击 流 按钮以开始输送甲酸钠溶液。单击 阳性 按钮以切换至正离子模式，然后单击 灵敏度 按钮以切换至灵敏度模式。
注意：继续进行下一步操作，直至甲酸钠的特征峰出现在实时谱图窗口中。 - 在UPLC-Q-TOF-MS控制软件中，打开 MS 控制台 窗口。在左侧位置，选择 SYNAPT XS 和 Intellistart 序列中的选项
- 勾选 创建校准，然后点击 开始 按钮。单击 下一步 按钮，然后选择 校准配置文件 在下拉菜单中。点击 下一步 按钮，并选择 灵敏度 模式 阳性 极性。点击 下一步，调整页面，下一步，以及 开始 依次按下按钮。
- 切换到 MS调谐 窗口，单击“Negative”按钮以切换至负离子模式。返回至 MS 控制台 窗
- 勾选 创建校准，然后点击 开始 按钮。单击 下一步 按钮，然后选择 校准配置文件 下拉菜单中。单击 下一步 按钮，然后选择 灵敏度 模式 阴性 极性。点击 下一步，调整页面，下一步，以及 开始 依次按下按钮。
- 在 LockSpray 流速控制 面板，设定50 μL/min的流速，然后点击 流 按钮，使LE溶液进入质谱仪。切换至 质谱调谐 窗口，勾选 LockSpray 源设置，然后点击 开始 开始校准的按钮。
3. 质谱采集
- 切换到主界面，右键单击进样文件列以打开液相色谱方法。
- 点击进样按钮，然后设置运行时间、梯度等参数。点击自动进样器按钮，然后设置运行时间、色谱柱和样品等参数。点击保存按钮。
- 右键单击质谱方法列以打开质谱方法。
- 点击信息按钮，然后设置结束时间、极性、分析器模式、低质量数、高质量数以及碰撞能量梯度等参数。点击确定按钮，然后点击保存按钮。
- 填写序列表格中的文件名、进样瓶和进样体积。点击保存按钮。
- 在序列表格中选择要运行的样品所在行。点击运行按钮，然后在弹出的窗口中点击确定按钮。
4. 数据处理
- 启动数据分析软件。在 我的工作 列中，点击 导入 MassLynx 数据 按钮以打开一个新窗口。
- 点击 加号 按钮，选中正离子模式下的全部五个原始文件。输入组名称，然后点击 创建 UNIFI 样品集 按钮以开始数据导入（图 3A）。
- 双击正离子模式下的分析方法文件。点击 处理 标签，然后点击 按质量目标 按钮。在“目标匹配容差”和“碎片匹配容差”后的输入框中输入 5 ppm。
- 点击 主页 按钮，然后点击 加合物 按钮。选中 +H 和 +Na 对应的行，点击 右箭头形状 按钮。点击 保存 按钮（图 3B）。
- 双击负离子模式下的分析方法文件。点击 处理 标签，然后点击 按质量目标 按钮。在“目标匹配容差”和“碎片匹配容差”后的输入框中输入 5 ppm。
- 点击主页按钮，然后点击 加合物 按钮。选中 -H 和 +HCOO 对应的行，点击 右箭头形状 按钮。点击 保存 按钮。
- 在 我的工作 列中，点击 分析 按钮以打开一个新窗口。选择刚刚导入的数据和刚刚创建的方法，然后点击 下一步 按钮。输入文件名，选择存储分析数据的文件夹，然后点击 完成 按钮。
- 点击 处理 按钮，并等待几分钟，直到结果显示（图 3C）。
- 将结果表格复制到空白表格中（图 3D）。
5. 结果分析
- 在结果表格中选择一个化合物，相应的二级质谱图将显示在右下角（图4A）。
- 点击表格形状按钮，并选择高能碎片选项，以显示二级碎片离子表格（图4B）。
- 在表格中选择一个二级碎片离子。将鼠标悬停于该离子在二级质谱图中对应的峰上，屏幕上将显示相应的结构断裂方式（图4C）。
注意：需手动评估软件给出的裂解方式的合理性，并依据二级碎片离子区分同分异构体。 - 在绘图软件中手动绘制裂解图谱。
注意：典型的裂解图谱示例在代表性结果部分中有详细描述。
结果
以BFH的化学成分鉴定为模型展示代表性结果。溶剂提取物的基峰色谱图 Gynura bicolor DC. 如下所示 补充文件1—补充图S1-S6，观察到的保留时间（RT）、组分名称、分子式、质荷比（m/z）及质量误差列于表S1-S6中。在ZBTK中，所有35种化合物均通过UPLC-TOF-MS分离峰鉴定得出。如图所示 补充文件 1-补充表 S1，主要化学成分包括有机酸（奎尼酸、DL-苹果酸、柠檬酸、邻香豆酸和3-O-反式香豆酰奎宁酸）、苷类（龙胆苦苷、苦杏苷II、苦地苷J、柯普林和龙脑-2-O-β-D-吡喃阿普糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷）以及酯类（银杏内酯B、柠檬酸三甲酯和反式-O-葡萄糖基-甲基-反式-肉桂酸酯）。在ZBTK-CT中，还检测到25种额外化合物（补充文件 1-补充表 S2，并观察到45种总化合物。
使用氯仿作为萃取剂时，共检测到50种化合物。其中，28种额外化合物包括冠状酸、三棱酸、绵毛桤木素A和甲基芸香酯（补充文件1-补充表S3）。使用石油醚作为萃取剂时，共观察到44种化合物。发现17种额外化合物，包括升麻素、桔梗皂苷元和蛇床素B（补充文件1-补充表S4）。以乙酸乙酯作为萃取剂时，共获得65种化合物。与前四种萃取物相比，新增37种化合物，如伞形酮、乙酰香草酮B和豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷（补充文件1-补充表S5）。在正丁醇萃取物中，共发现67种化合物，包含26种额外化合物，如任逍遥苷C、色酮类、aturametelin F和去乙酰基母菊素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（补充文件1-补充表S6）。综上所述，基于六种萃取剂所得全部化合物结果，共鉴定出168种化合物。
为了深入理解UPLC-TOF-MS中化合物类型的裂解途径，我们选取了三种化合物作为示例。对于酸类化合物，m/z = 337.09222的3-O-反式香豆酰奎宁酸可通过水解反应失去C7H10O5或C9H8O2基团，分别生成m/z = 163.04116或199.05557的中间产物（图4D）。对于酯类化合物，m/z = 385.11308的反式-O-葡萄糖基-甲基-反式肉桂酸酯可通过在不同位点发生C-C键断裂，转化为m/z = 153.07485或135.04679的中间产物（图4E）。对于糖苷类化合物，m/z = 385.11308的柑橘苷C通过脂肪链中的C-C键断裂生成m/z = 272.09174的中间产物，而失去C7H6O2基团则导致生成m/z = 113.02534的中间产物（图4F）。在另一条裂解途径中，苯环上的C-O-C键断裂导致生成m/z = 163.11245的中间产物，同时己糖单元消失。
分子对接的代表性结果分别展示了二维和三维结构，如图4G、H所示。基因本体富集分析显示了基因功能在生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）方面的结果（图4I）。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路注释分析展示了差异表达基因的通路结果，可用于进一步理解基因功能（图4J）。分子对接的详细结果见补充文件1-补充表S7和补充文件1-补充图S7-S9。
图1：中药预处理方法。（A）Gynura bicolor DC.（B）清洗与干燥。（C）粉碎。（D）加入有机溶剂。（E）超声提取。（F）混合物离心。（G）上清液过滤。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：UPLC-Q-TOF-MS/MS 操作流程。 （A）甲酸钠溶液配制。（B）质荷比轴校准。（C）质谱调谐。（D）样品放置。（E）质谱信号采集。（F）质谱图显示。请点击此处查看该图的高清版本。
图 3：数据处理与整合。（A）数据转换。（B）方法修改。（C）数据处理。（D）结果的统计分析。请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：深度结果分析。 （A）二级质谱图。 （B）二级碎片离子展示。 （C）断裂位点展示。 （D）裂解模式 1。 （E）裂解模式 2。 （F）裂解模式 3。 （G）活性成分作用靶点展示。 （H）活性成分作用靶点的三维结构。 （I）GO富集分析。 （J）KEGG通路注释分析。 请点击此处查看该图的高清版本。
补充文件1：化合物鉴定、分子对接结果、基峰色谱图及网络分析。 请点击此处下载该文件。
讨论
除了水煎煮法12，有机溶剂提取是中药前处理的另一种常用方法13。根据相似相溶原理，已采用多种有机溶剂组合提取出大量成分14。超声辅助提取是获取中药成分的主要方法之一15。超临界二氧化碳提取适用于提取木脂素等特定类型的物质16。此外，离子液体（ILs）中的微波辅助提取已被研究作为传统有机溶剂提取的替代方法17。然而，微波能量的精确控制难以实现，可能导致醚化脱水和酯化脱水等副反应。
优化碰撞能量设置可获得额外的二级质谱碎片信息。串联质谱（即 MSE 模式）通过两个并行交替扫描提供信息：使用低能量扫描获取分子离子信息，或使用高能量扫描获取全扫描范围内的准确质量碎片离子信息18。在设置高能量参数时，通常采用 10–35 V 的斜坡式碰撞能量范围，以提高前体离子的碎裂效率19。
高分辨率质谱产生了大量的原始质谱数据。原始质谱数据包括质谱图中的分子离子峰和串联质谱图中的碎片离子峰，必须进行充分的处理与整合。质谱数据分析软件旨在全面分析生物样本中的所有代谢物20。硫酸化代谢物的筛选基于全扫描质谱的数据依赖性采集以及多维代谢物数据21。随着技术的发展，人工智能预测将成为质谱数据分析的一个可行发展方向。
大多数化合物可通过该方法进行鉴定。然而，由于二级碎片有限，无法完全鉴定所有异构体，包括黄酮类和单宁类化合物。为实现结构鉴定，研究人员可采用串联质谱法，以获得碎片离子的进一步信息，从而有助于化合物结构的鉴定8。鉴于电喷雾离子化或大气压化学离子化源的局限性，高分辨质谱不适用于大分子分析。基质辅助激光解吸电离可促进大分子化合物（如蛋白质）的离子化22。综上所述，超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术（UPLC-Q-TOF-MS/MS）是中药化合物鉴定中应用最广泛的技术之一，具有应用于其他领域（包括临床医学和能源化学）的潜力。
披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作由国家自然科学基金（82104881）、中医免疫疾病传承与创新团队、重庆市医学科研项目（重庆市卫生健康委员会与科学技术局联合项目）（2022DBXM007）、重庆市科研机构绩效激励引导专项（cstc2022jxjl120005）、重庆市博士后科学基金特别资助项目（2022CQBSHTB3035）、重庆市中青年医学高端人才计划、重庆市科研院所发展计划（自主研究项目编号：2022GDRC015）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯仿 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | CAS 67-66-3 | |
| 乙醇 | Chuandong Chemical | CAS 64-17-5 | |
| 乙酸乙酯 | Chuandong Chemical | CAS 141-78-6 | |
| 液相色谱仪 | Waters | ACQUITY Class 1 plus | |
| MassLynx | Waters | V4.2 | 质谱控制软件 |
| 正丁醇 | Chuandong Chemical | CAS 71-36-3 | |
| 石油醚 | Chuandong Chemical | CAS 8032-32-4 | |
| 四极杆飞行时间质谱 | Waters | SYNAPT XS | |
| UNIFI | Waters | 数据分析软件 |
参考文献
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