自闭症谱系障碍（ASD）与社交和沟通行为受损以及重复性行为的出现相关。本文描述了在黑腹果蝇（Drosophila）模型中研究ASD相关基因与行为缺陷之间相互关系的五种行为范式，用于检测社会间距、攻击性、求偶、理毛以及习惯化行为。
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方法文章
自闭症谱系障碍的Drosophila模型中的行为评估范式
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摘要
摘要
自闭症谱系障碍（ASD）是一组异质性的神经发育障碍，具有共同的行为症状，包括社交互动和沟通能力缺陷、刻板或重复性行为增强，部分病例还伴有学习障碍和运动功能缺陷。Drosophila（果蝇）作为建模人类疾病的无与伦比的模式生物，已被广泛应用于多种人类疾病的研究。由于已有大量基因被发现与ASD相关，果蝇已成为检验这些疑似致病基因功能的强有力且高效的工具。鉴于参与ASD的数百个基因具有多样化的功能，建立单一的遗传性果蝇ASD模型并不可行；取而代之的是，通常通过构建个体基因突变体、基因敲低或过表达模型，研究ASD相关基因在果蝇中的同源基因，以揭示这些基因产物所涉及的分子通路。在Drosophila中已有多种行为学检测技术，可简便地反映特定行为组分的缺陷。果蝇的社会间距实验、攻击行为和求偶行为检测已被证明可用于评估社交互动或沟通能力的异常。果蝇的理毛行为是评估重复性行为的优良指标。习惯化实验则用于检测果蝇的习惯化学习能力，而这一能力在部分ASD患者中已被发现受损。结合使用这些行为学范式，可对果蝇中模拟的人类ASD样疾病状态进行全面评估。我们利用模拟人类脆性X综合征的Fmr1突变果蝇，以及在果蝇神经元中对POGZ同源基因row进行敲低的模型，已观察到社会间距、攻击行为、求偶行为、理毛行为及习惯化能力的可量化缺陷。本文以最简明直接的形式展示这些行为学范式，旨在促进其在果蝇模型中用于ASD及其他神经发育障碍研究的广泛应用。
引言
自闭症谱系障碍（ASD）涵盖一组异质性的神经系统疾病，包括一系列复杂的神经发育障碍，其特征为在多种情境下持续存在社会交流与社会互动方面的缺陷，以及存在局限、重复的行为模式、活动方式和兴趣1。根据世界卫生组织（WHO）的数据，全球每100名儿童中就有1人被诊断为ASD，男女比例为4.2:12。该疾病通常在出生后的第二或第三年即显现。ASD儿童在社会情感互动、非语言交流以及建立和维持人际关系方面表现出明显兴趣缺乏。他们表现出重复性行为，如刻板的运动动作、僵化且仪式化的日常习惯，以及对特定兴趣的极度专注。ASD儿童对触觉、嗅觉、声音和味觉的反应程度较高，而对疼痛和温度的反应则相对较低1。不同ASD患者之间的疾病外显率也存在差异，因此临床表现的变异性较大。
目前，自闭症谱系障碍（ASD）的临床诊断主要基于个体的行为评估，尚无基于生物标志物的确认性检测方法，也缺乏能够涵盖所有类型ASD的通用基因检测手段3阐明遗传和神经生理学基础将有助于靶向治疗策略的制定。在过去十年中，大量研究已鉴定出数百个在自闭症谱系障碍（ASD）患者中发生缺失、突变或表达水平改变的基因。当前研究重点在于利用小鼠或果蝇等模式生物验证这些候选基因的功能贡献，通过敲除或敲低这些基因，检测类似ASD的行为缺陷，并揭示导致异常表型的遗传....
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方案
有关本实验方案中使用的所有材料和试剂的详细信息，请参见材料表。
1. 攻击行为实验
- 准备攻击行为实验场地
- 取一个标准的24孔板（图1A），将每个孔用作果蝇攻击行为的单个“场地”（图1B）。在每个孔中填充一半的常规果蝇食物，并过夜晾干。
注意：可选择在场地中加入攻击行为的焦点，例如一小点酵母糊或一只去头雌蝇，以确保雄蝇表现出攻击行为。 - 取一块透明塑料或丙烯酸板，大小足以覆盖三到四个孔的表面。在板上打一个直径约2.5 mm的小孔，用于通过该孔将单个果蝇插入孔中。
- 取一个标准的24孔板（图1A），将每个孔用作果蝇攻击行为的单个“场地”（图1B）。在每个孔中填充一半的常规果蝇食物，并过夜晾干。
- 准备果蝇吸移器
- 取一段30-50 cm长的橡胶或硅胶管（图1C1）。
- 取一个200 µL（或1,000 µL）的移液枪头，从细端切下约1 cm。将切下的末端插入橡胶管的一端；此端为“口端”，用于口吸式吸取。
- 取另一个移液枪头，将其细端剪开，形成一个足够让果蝇进入的开口。将该枪头的基部插入管子的尾端；此端为吸移器的“果蝇端”，果蝇将从此处被吸入（
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结果
攻击行为实验
果蝇 Fmr1 突变体已被用作自闭症谱系障碍（ASD）的果蝇模型63,64。w1118 雄性果蝇作为对照组，Fmr1 反式杂合突变体 Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 雄性果蝇作为实验组；成年雄性果蝇在隔离管中单独饲养5天。将基因型相同、饲养条件相同的同型雄性果蝇配对放入攻击行为检测 arena 中，记录其20分钟内的行为表现。统计每种基因型果蝇在20分钟内的攻击行为发作总次数。结果显示，与对照组雄性果蝇相比，突变体雄性果蝇在20分钟内的攻击行为发作次数显著减少（图1E）。Fmr1 突变果蝇攻击性降低可能是由于其对与其他果蝇进行社会互动的兴趣减弱所致。相比之下，在群体或社会性饲养条件下，Fmr1 突变雄性果蝇的攻击行为发作次.......
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讨论
Drosophila 因其基因序列在果蝇与人类疾病基因之间具有高度保守性，被广泛用作研究人类神经系统疾病的理想模式生物9。大量可靠的动物行为学范式使其成为研究模拟人类疾病表型突变体的有力模型。由于已有数百个基因被发现与自闭症谱系障碍（ASD）相关，目前在任何模式生物中均不存在通用的ASD模型。因此，研究人员在研究每一个突变体时，必须首先在果蝇中建立其是否具有类似ASD的表型。本文尝试通过提出联合使用五种果蝇行为学范式来简化这一评估流程。这些范式用于检测人类ASD患者中普遍存在且主要的行为缺陷：社交与沟通障碍、重复性行为增强以及习惯化缺陷。若某一果蝇基因突变在全部或大部分这五项行为范式中均表现出异常，则可能强烈提示其具有类似ASD的表型特征。
本文所述的大多数行为学实验范式在以往文献中已被多次用于解决不同的研究问题。不同研究之间在技术细节上存在差异是常见现象。这些技术上的调整旨在满足特定研究需求，并适应所要解决的具体科学问题。例如，在求偶行为实验中，可对测试果蝇（tester fly）的先天性及后天习得的求偶行为进行量.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们非常感谢 Mani Ramaswami（NCBS，班加罗尔）和 Baskar Bakthavachalu（IIT Mandi）在适应性与气味选择实验装置方面的帮助，感谢 Pavan Agrawal（MAHE）对攻击行为实验提出的宝贵建议，感谢 Amitava Majumdar（NCCS，浦那）分享其求偶行为实验装置的原型， Fmr1 突变果蝇品系，以及感谢浦那国家细胞科学中心（NCCS）的 Gaurav Das 分享 MB247-GAL4 品系。我们感谢布卢明顿果蝇杂交中心（Bloomington） 果蝇 美国印第安纳大学布卢明顿分校果蝇资源中心（BDSC，美国印第安纳州）、日本京都大学遗传学研究所（NIG，日本京都）、印度瓦拉纳西贝拿勒斯印度教大学（BHU，印度瓦拉纳西）和印度班加罗尔国家生物科学中心（NCBS，印度班加罗尔）提供 果蝇 线条。实验室工作由AD获得的SERB-DST资助（ECR/2017/002963）、授予AD的DBT拉马林加斯瓦米研究员项目（BT/RLF/Re-entry/11/2016）以及印度理工学院克勒格布尔分校的机构支持提供经费。SD和SM获得CSIR高级研究奖学金资助的博士生奖学金；PM获得印度MHRD提供的博士生奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 攻击行为实验 arena： | |||
| 标准24孔透明聚苯乙烯板 | 12 cm × 8 cm × 2 cm。单个孔的直径 = 18 cm。Sigma-Aldrich #Z707791；深度 = 1 cm | ||
| 透明塑料/亚克力板 | 替代方案：细胞培养板的带孔盖子 | ||
| 社会空间实验： | |||
| 回形夹 | 19 mm | ||
| 定制尺寸的玻璃片和丙烯酸片 | 厚度 = 5 mm | ||
| 求偶行为实验： | |||
| 带螺纹的螺母和螺栓 | |||
| 定制形状的有机玻璃板 | i) 盖子：一个定制的圆形透明有机玻璃圆盘（厚度2-3 mm，直径70 mm），在边缘区域有一个加样孔，中心有一个螺孔（直径均约为3 mm）； ii) 第二个透明较厚的有机玻璃圆盘（厚度3-4 mm，直径70 mm），具有6-8个直径为15 mm的穿孔，均匀分布在距中心等距的位置； iii) 底座：与盖子相同，但无加样孔 | ||
| 梳理行为检测： | |||
| 漫射玻璃覆盖的LED面板 | 10–15瓦天花板安装式LED面板 | ||
| 习惯化与Y迷宫实验 | |||
| 攀爬室 | x2，硼硅酸盐玻璃 | ||
| 连接Y迷宫与入口小瓶的适配器 | 有机玻璃，定制，尺寸为 图 5A | ||
| 透明试剂瓶 | Borosil #1500017 | ||
| 气体洗涤塞 | Borosil #1761021 | ||
| 玻璃小瓶 | OD = 25 mm × 高度 = 85 mm；硼硅酸盐玻璃 | ||
| 气味剂（丁酸乙酯） | 默克 #E15701 | ||
| 石蜡（液体），轻质 | SRL #18211 | ||
| 滚轴夹 | Polymed #14098 | ||
| 硅胶管 | 外径 = 0.6 cm，内径 = 0.3 cm；用于流量控制的滚轴夹 | ||
| 真空泵 | Hana #HN-648（任何可通过手动反转流向的水族泵） | ||
| Y迷宫 | 硼硅酸盐玻璃 | ||
| Y形玻璃管（硼硅酸盐玻璃） | 定制制作，尺寸测量 图 5A | ||
| 常用物品： | |||
| 任何可用于视频播放的软件（例如：VLC 媒体播放器） | https://www.videolan.org/vlc/ | ||
| 用于视频数据分析的计算机 | |||
| 果蝇培养瓶 | 直径 = 60 毫米 × 高度 = 140 毫米；玻璃/聚丙烯 | ||
| 果蝇培养管 | OD = 25 mm × 高度 = 85 mm；硼硅酸盐玻璃 | ||
| Graph-pad Prism 软件 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | ||
| ImageJ 软件 | https://imagej.net/downloads | ||
| 计时器 | |||
| 配备视频录制设置的摄像机 | 摄像机或手机摄像头均可使用 | ||
| 用于果蝇吸虫器： | |||
| 棉花 | 吸水性材料，经高压灭菌 | ||
| Parafilm | Sigma-aldrich #P7793 | ||
| 移液器吸头 | 200 µL 或 1000 µL，根据硅胶管的外径选择 | ||
| 硅胶/橡胶管 | 长度= 30–50 cm。该管应无气味 | ||
| 果蝇食物的配制： | |||
| 成分（配制1升食物所需用量） | |||
| 琼脂（8 g） | SRL # 19661（CAS：9002-18-0） | ||
| 玉米淀粉（80 g） | 有机，本地采购 | ||
| D-葡萄糖（20 g） | SRL # 51758（CAS：50-99-7） | ||
| 丙酸（4 g） | SRL # 43883（CAS：79-09-4） | ||
| 蔗糖（40 g） | SRL # 90701（CAS：57-50-1） | ||
| 对羟基苯甲酸甲酯（Tego）（1.25 g） | SRL # 60905（CAS：5026-62-0） | ||
| 酵母粉（10 g） | HIMEDIA # RM027 | ||
| 本研究中使用的果蝇品系： | |||
| 野生型（Canton S 或 CS） | BDSC # 64349 | ||
| w1118 | BDSC # 3605 | ||
| w[1118]; Fmr1[Δ50M]/TM6B, Tb[+] | BDSC # 6930 | ||
| w[*]; Fmr1[Δ113M]/TM6B, Tb[1] | BDSC # 67403 | ||
| MB247-GAL4 （Gaurav Das，印度浦那国家细胞科学中心） | BDSC # 50742 | ||
| LN1-GAL4 | NP1227，NP联盟，日本 | ||
| row-shRNA | BDSC # 25971 |
参考文献
- American Psychiatric Association. American Psychiatric Association DSM-5 Task Force Diagnostic and statistical manual of mental disorders: DSM-5TM, 5th ed. , Am. Psychiatr. Publ. Inc. (2013).
- Zeidan, J., et al. Global prevalence of autism: A systematic review update. Auti....
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