对昆虫叮咬行为进行定量且受控的研究，对于制定有效策略以应对虫媒传播疾病至关重要。在此背景下，本文介绍了一种用于制备生物杂化原子力显微镜（AFM）探针的方法。
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摘要
摘要
蚊子因其传播疾病的能力而被认为是人类最致命的动物，对公共卫生构成长期挑战。目前主要的预防策略依赖于化学驱蚊剂，但由于蚊子会迅速产生抗性，这些驱蚊剂往往效果有限。因此，开发新的预防方法至关重要。此类方法的研发依赖于对蚊子叮咬行为的深入理解，需要建立一种能够准确模拟真实叮咬场景、具备可控测试参数并可进行定量测量的实验体系。为填补这一空白，研究人员设计了一种生物混合型原子力显微镜（AFM）探针，其探针尖端采用生物结构—— specifically，蚊子的上唇（labrum）作为感应元件。这种生物混合探针可与标准AFM系统兼容，能够近乎真实地模拟蚊子的刺入行为。该方法标志着在叮咬机制定量研究方面迈出了重要一步，有望推动有效阻断媒介传播疾病（VBDs）策略的开发，并为防治蚊媒传染病开辟新途径。
引言
世界卫生组织（WHO）报告称，媒介传播疾病（VBDs）占所有传染病的17%以上，每年在全球造成超过70万例死亡。例如，蚊子作为世界上最致命的动物，通过吸血节肢动物传播多种病原体，如登革热、疟疾和寨卡病毒，每年导致约7亿人感染1。探索开发有效措施以预防媒介传播疾病至关重要，其中包括模拟蚊子的穿刺行为以研究其叮咬机制，以及对潜在屏障材料进行研究以验证其阻止穿刺的有效性。其中一项关键挑战在于建立适当的方法来开展此类研究。已有研究尝试开发出在几何结构上类似蚊子刺吸式口器的微尺度针头；然而，许多用于制造这些微针的材料（如粘弹性材料2、硅（Si）、玻璃、陶瓷3等）在机械性能上与蚊子口器的生物材料存在差异。工程材料可能较脆，易发生断裂或屈曲3,4，而蚊子的口器则更能抵抗断裂或屈曲4。使用蚊子的上唇（labrum）而非工程材料构建生物杂合探针的优势在于，其能更真实地再现蚊子的穿刺机制。此外，为了进行定量研究（如精确测量作用力5），必须将微针与专用工具集成，而使用定制的工程化微针装置难以实现这一目标。
基于原子力显微镜（AFM）的方法具有广阔....
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方案
本方案所使用的蚊虫种类为未感染的成年雌性蚊子 埃及伊蚊 (A. aegypti），冷冻保存于-20 °C冰箱中。该物种由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）丝虫病研究试剂资源中心提供，并通过BEI Resources（NIAID，NIH）进行分发：未感染 埃及伊蚊，菌株 Black Eye Liverpool（冻存），NR-48920。本研究中使用的所有试剂和设备均列于下文 材料表.
1. 从喙中解剖下唇
- 使用镊子将一只死蚊子放置在显微镜下的载玻片上，并确保喙的末端具有一个逐渐变细的尖端（图 2A）。
- 保持蚊子位于载玻片上，将手术刀片轻轻置于蚊子头部附近的唇须上方（图 2B）。
- 沿唇须上半部分全长进行切开（切口长约80 µm），切口深度应较浅，仅穿透唇须厚度。操作时需施加轻微压力，确保仅切割唇须，而不损伤其下方的口针束。
- 用一对镊子牢固夹住蚊子头部，同时用另一对精密镊子在逐渐变细的尖端与切口位置之间的任意位置轻轻夹住唇须（图 2B）。
- 将夹....
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结果
所制备的生物杂化原子力显微镜（AFM）探针的扫描电子显微镜（SEM）图像见图7。唇瓣末端已成功粘接到无针尖的悬臂梁上。由于蚊子口针具有天然曲率，且本方案依赖手动操作，因此很难获得口针针尖与悬臂完全垂直的探针。口针与垂直于悬臂的假想中心线之间的偏心角通常约为10度。尽管在将探针安装到AFM悬臂时这一问题较为常见15，但在进行力/应力分析时必须考虑这种非预期的倾斜。未来的研究可着重优化制备工艺，并利用该生物杂化探针开展相关实验。这是首次尝试利用昆虫口针制备生物杂化AFM探针。
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讨论
本实验方案的第1步旨在清除生物样本中不需要的唇瓣。为此，需在唇瓣上进行切口，但不得切到位于唇瓣正下方的细束（图1）。由于唇瓣与细束在其交界处并未连接（即唇瓣可沿细束滑动，仅通过其与蚊子头部的附着而固定位置），因此所进行的切口旨在将部分唇瓣从蚊子头部分离，从而便于去除外部覆盖物。当从样本中牵拉唇瓣时，操作人员会感受到轻微阻力，这是由于唇瓣下半部分仍附着在蚊子身上所致。这种阻力应能相对容易地被释放，因为切口会促进生物材料的裂纹扩展，导致未切割部分的唇瓣撕裂，从而使整个唇瓣在牵拉过程中从细束上滑脱。如果切口不足，操作人员在牵拉时可能会遇到过大阻力，建议在继续后续步骤前重新进行切口。
在操作第1步和第4步时，处理盂唇需手法轻柔并保持耐心 通过 用镊子夹取时需小心。尽管唇基相对坚韧，但如果镊子施加的压力过大，仍可能造成损伤。操作人员应轻轻夹住唇叶/唇基，即仅施加足以固定唇叶/唇基的最小力度。可在第1步和第4步结束时，在显微镜下检查样本，评估是否存在损伤。建议沿喙的全长检查有无异常（如凹陷、撕裂、节段分离）。若怀疑唇.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢加拿大新前沿研究基金（NFRF）和自然科学 加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）发现计划以及魁北克研究基金会自然科学与技术（FRQNT）硕士培训奖学金。作者还感谢麦吉尔大学Prof. Yaoyao Zhao课题组在部分组件3D打印方面的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-SA-SE 直锥超细尖镊子 | Excelta | N/A | 用于操作或解剖喙。 |
| C-4D 探针台 | Everbeing Int’l Corp | N/A | 用于原子力显微镜（AFM）组装。 |
| 无针尖轻敲模式悬臂梁 | NanoAndMore USA | TL-NCH | 用于安装唇基的原子力显微镜（AFM）悬臂梁。 规格如下： 形状：梁 力常数：42 N/m（10 - 130 N/m） 共振频率：330 kHz（204 - 497 kHz） 长度：125 µm（115 - 135 µm） 宽度：30 µm（22.5 - 37.5 µm） 厚度：4 µm（3 - 5 µm） |
| 紫外固化环氧树脂 | Let's resin | ALR00146 | 用于螫针固定。 |
参考文献
- World Health Organization. Global vector control response 2017–2030. World Health Organization. , (2017).
- Gurera, D., Bhushan, B., Kumar, N. Lessons from mosquitoes’ painless piercing. J Mech Behav Biomed Mater. 84, 178-187 (2018).
- Ma, G., Wu, C.
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