基底膜基质包埋细胞聚集体用于研究小鼠脾脏组织形成

摘要

本文介绍了一种将脾脏细胞在半固体基底膜基质中进行聚集和包封的实验方案。基底膜基质构建物可用于三维培养，以研究类器官的发育，或用于 体内 移植与组织再生研究。

摘要

脾脏是一种免疫器官，在血液介导的免疫反应中发挥关键作用。该组织的解剖性或功能性缺失会增加机体对严重血源性感染和败血症的易感性。临床上已采用自体脾组织片移植来替代丧失的脾组织并恢复免疫功能。然而，驱动脾组织 robust 再生并实现免疫学功能的机制尚未完全阐明。本研究旨在建立一种将脾细胞聚集并包封于半固态基质中的方法，以探究脾组织形成所需的细胞条件。基于基底膜基质包封的细胞构建物适用于 体外 三维类器官的组织培养以及肾包膜下移植以直接评估 体内 组织形成。通过调控用于聚集和包封的输入细胞，我们证明了移植物来源的 PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- 在动物移植模型中，新生基质细胞是脾脏组织再生所必需的。

引言

脾脏的创伤性破裂以及体内出现多个脾脏结节，是最早提示脾组织具有再生能力的现象之一^1,2。随后，脾脏自体移植被引入临床，用于在需要急诊脾切除的患者中保留脾组织³。然而，尽管该技术已在临床实践中应用数十年，人们对脾脏如何再生仍知之甚少。动物移植模型为研究脾脏再生及免疫功能的多个参数提供了重要见解^4,5。特别是，对移植物制备方法的实验性改进，使得在细胞和分子水平上更深入地研究组织再生成为可能。

涉及整片脾脏的移植在重建新的脾脏结构之前会经历一个大规模坏死的阶段⁶移植物坏死的初始阶段表明，移植组织的大部分主要由红细胞和白细胞构成，而这些成分对于脾脏再生并非必需。这一假设通过在小鼠肾包膜下移植前去除脾移植物中的造血细胞进行了实验验证。结果显示，脾脏中非白细胞/非红细胞组分（包括基质细胞和内皮细胞）足以诱导脾脏再生 从头合成 组织形成⁷脾脏基质组织可进一步处理为单细胞悬液，从而可利用细胞分选技术调控细胞移植物的组成。通过选择性去除特定细胞类型，两种CD45^-TER-119

方案

所有动物实验均按照昆士兰大学动物伦理委员会批准的实验方案（UQBR/079/19）进行。

1. 组织采集与基质细胞制备

1. 通过诱导低温法处死0.5至1.5日龄的雄性或雌性BALB/c新生供体小鼠：将动物用纸巾包裹后置于碎冰中超过>10分钟。
   注意：本方案可适用于不同品系、年龄及数量的小鼠。
2. 准备无菌外科器械。
3. 将小鼠置于右侧卧位，用80%乙醇擦拭皮肤，并使用虹膜手术剪做1 cm切口以暴露腹膜壁。
4. 在脾脏上方再做第二个0.5 cm切口，用精细镊子轻轻提起组织，使用手术剪剪断血管并切除脾脏组织。将组织转移至含有冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。去除附着在脾脏上的任何残留结缔组织。
   注意：体视显微镜可辅助完成操作器械所需的精细动作。
5. 为解离完整组织，将新生小鼠脾脏（每批不超过10个）转移至倒置的14 mL锥形管盖内缘。使用1 mL注射器推杆的塑料末端通过按压动作机械性地破坏组织。
6. 将管盖紧密固定在装有10 mL冷PBS的14 mL锥形管上。倒置管子5次，使所有破碎组织从管盖冲洗至管内。
7. 对任何剩余组织重复步骤1.6。
8. 将管子置于冰上静置1分钟，使组织沉降至管底。
9. 小心倾去上清液（含造血细胞），将溶液通过可逆的70 µm细胞筛....

结果

细胞聚集对于促进细胞间的接触和信号传导具有重要意义。将细胞聚集体包埋于基底膜基质中，可同时支持三维培养 体外 组织类器官的形成，并促进了将细胞机械递送至肾包膜以进行移植物移植。为构建这些结构，首先在冰冻条件下使基底膜基质保持液态。随后通过在上方铺加浓缩的细胞悬液，并利用离心力推动细胞穿过高密度基质，从而实现细胞聚集。离心速度的优化（200–2000 × g)才能实现中层细胞的定位（图1A），这也取决于细胞数量。较高的离心力（>500 x g)推动细胞至移液管的最尖端（图1B），对于细胞数量较少的情况需格外谨慎（即 <5 × 10⁵）在移除柔性实验室膜覆盖物时可能会丢失。相反，若离心力过低（≤200 x g) (图1C）。细胞数量的离心速度 <1 × 10⁵ 或 >2.5 x 10⁶ 可能需要进一步优化.......

讨论

新生小鼠脾细胞在半固体培养基中的聚集是生成脾脏结构的一种可行方法。类似的基于基底膜基质的实验方案已被用于启动三维脾脏培养。¹⁰在此，我们证明脾脏构建物同样适用于 体外 类器官培养系统以及 体内 移植模型。值得注意的是，移植 体外 尚未测试培养脾类器官的能力，但确定其是否具备完全或部分脾组织再生能力将具有重要意义。本方案还继承了先前脾移植研究中描述的细胞聚集技术。⁸这些研究涉及将细胞聚集体加载到胶原膜上，随后移植至肾包膜下。将细胞聚集体包裹于基底膜基质内，在移植物方向性方面具有明显优势，可消除胶原膜侧朝下与细胞聚集体侧朝下移植所带来的差异。

制备基底膜基质结构的方法相对简单。使用高浓度的基底膜基质可确保细胞在基质弥散前的数天内以聚集状态得到初始支持。根据我们的经验，在将PBS悬浮的细胞溶液小心分层（步骤 2.6）并离心（步骤 2.8）后，基底膜基质的混合与稀释程度极小。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔聚丙烯1.2 mL簇状管	康宁	CLS4401	用于放入14 ml锥形管内
β-巯基乙醇	Gibco	21985023	储备液 55 mM，使用浓度为 50 μM
胶原酶D	罗氏	11088858001
胶原酶IV	Sigma-Aldrich	C5138	来自溶组织梭菌
脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	牛胰脱氧核糖核酸酶 I，II-S 型，冻干粉，蛋白质 ≥80 %, ≥2,000 单位/毫克蛋白
杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基（DMEM）	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，不含丙酮酸钠，液体。经无菌过滤。
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	D8537	不含氯化钙和氯化镁，经无菌过滤
Eclipse 200 μ移液器吸头	Labcon	1030-260-000	斜面针尖
胎牛血清（FBS）	Gibco	26140-079	批号# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	储存液为100倍浓度，使用时稀释至1倍浓度
Matrigel	康宁	354263	Matrigel基质膜（高浓度），批号# 7330186
MEM非必需氨基酸	Gibco	11140076	储存液为100倍浓度，使用时稀释至1倍浓度
青霉素/链霉素	Gibco	15140122	10,000 单位/毫升青霉素储备液，10,000 微克/毫升链霉素储备液
可逆细胞过滤器	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
环形镊子	NAPOX	A-26	环尺寸：3 mm
ROCK 抑制剂（Y-27632）	MedChemExpress	HY-10071
赛默飞世卡 Heraeus Megafuge 40R 离心机	赛默飞世尔科技		加速度和减速度均设置为 8
超细镊子	EMS	78340-51S	Style 51S。无磁性/耐酸型SA低碳奥氏体不锈钢镊子，具有耐腐蚀性。表面为防眩光缎面处理。
Vicryl 5/0 缝合线 Ligapak 卷轴	Ethicon	J283G
Wiretrol II 长导线活塞	德拉蒙德	5-000-2002-L	不锈钢柱塞，25 &和 50 μL/WRTL II，长型
伤口缝合夹施加器	MikRon	427630
伤口夹	MikRon	427631	9 mm