基底膜基质封装细胞聚集用于研究小鼠脾脏组织形成

Summary

本文描述了一种在半固体基底膜基质中聚集和封装脾细胞的方案。基底膜基质构建体可用于三维培养，用于研究类器官发育，或用于 体内 移植和组织再生研究。

Abstract

脾脏是一种免疫器官，在血液传播的免疫反应中起着关键作用。这种组织的解剖学或功能丧失增加了对严重血液感染和败血症的易感性。脾脏切片的自体移植在临床上已被用于补充丢失的组织并恢复免疫功能。然而，驱动强大且具有免疫功能的脾组织再生的机制尚未完全阐明。在这里，我们旨在开发一种在半固体基质中聚集和封装脾细胞的方法，以研究脾组织形成的细胞需求。基底膜基质封装的细胞构建体既适用于三维类器官的 体外 组织培养，也适用于肾囊下的移植，以直接评估 体内 组织的形成。通过操纵输入细胞进行聚集和封装，我们证明了在动物移植模型下，移植来源的PDGFRβ ⁺ MAdCAM-1^- 新生儿基质细胞是脾组织再生所必需的。

Introduction

脾脏的创伤性破裂和体内多个脾结节的出现是脾组织具有再生能力的最初迹象之一^1,2。脾脏自体移植后来被引入临床，以保留需要紧急脾切除术的患者的脾脏组织³.然而，尽管几十年来一直是临床实践的一部分，但人们对脾脏如何再生知之甚少。动物移植模型提供了对脾脏再生和免疫功能的多个参数^{的见解 4,5}。特别是，对移植物制备方法的实验修改允许在细胞和分子水平上更详细地研究组织再生。

涉及整个脾脏切片的移植在重建新的脾脏结构之前会经历一个集体坏死阶段⁶.移植物坏死的初始阶段表明，移植组织的大部分主要由红细胞和白细胞组成，对于脾脏再生是不必要的。这是通过在小鼠肾囊下移植之前从脾移植物中排除造血细胞来研究的。在这里，脾脏的非白细胞/非红细胞部分（包括基质细胞和内皮细胞）被证明足以诱导从头组织形成⁷。脾基质组织可以进一步加工成单细胞悬浮液，从而能够使用细胞分选技术来操纵细胞移植物组成。通过选择性地去除候选细胞类型，鉴定出两种对移植物发育不可或缺的 CD45-TER-119^- 基质细胞群:内皮样 CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ 细胞群和更广泛定义的 PDGFRβ⁺ 间充质细胞群⁸。

脾细胞移植物的构建在支持材料和细胞加载过程方面各不相同。组织工程脾脏先前是通过将脾脏单位加载到聚乙醇酸/聚L乳酸聚合物支架^上来制备的^5,9。有趣的是，吸收到胶原海绵中的脾脏基质细胞未能移植，而基质细胞聚集并加载在胶原片上促进了脾脏再生⁸。在三维培养条件下，脾脏基质细胞在基质基质内的重悬也被证明可以诱导细胞聚集¹⁰。然而，这种方法尚未在移植模型中使用。当前方案的总体目标是将脾脏基质细胞直接聚集在基底膜基质内，随后可以将其转移到三维体外组织培养系统中或用作动物模型移植的载体（补充图1）。

Protocol

所有动物程序均根据昆士兰大学动物伦理委员会（UQBR/079/19）批准的实验方案进行。

1.组织采集和基质细胞制备

1. 通过将动物包裹在薄纸内并将它们置于碎冰下>10分钟，诱导体温过低，对0.5-1.5日龄的雄性和/或雌性BALB / c新生供体小鼠实施安乐死。
   注意:该协议可以适应不同的小鼠品系，年龄和动物数量。
2. 准备无菌手术器械。
3. 将鼠标放在右侧位置。用80%乙醇擦拭皮肤，并用Iris手术剪刀切开1厘米，露出腹膜壁。
4. 在脾脏上方做第二个 0.5 厘米的切口，然后用一把细镊子轻轻地将组织抬起。用一把手术剪刀剪断血管并切除组织。将组织转移到含有冰冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）的培养皿中。去除附着在脾脏上的任何残留结缔组织。
   注意:体视显微镜可以帮助操作手术器械所需的精细运动。
5. 为了解离整个组织，将新生儿脾脏（10 个或更少的池）转移到倒置的 14 mL 锥形管盖的内缘。使用 1 mL 注射器柱塞的塑料后端通过按压运动机械破坏组织。
6. 将盖子紧紧固定在含有 10 mL 冷 PBS 的 14 mL 锥形管上。将试管倒置 5 次，将所有被破坏的组织从盖子洗入试管中。
7. 对任何剩余组织重复步骤 1.6。
8. 将试管放在冰上 1 分钟，让组织沉降到试管底部。
9. 通过将溶液通过可逆的70μm细胞过滤器，小心地弃去上清液（含有造血细胞）。
10. 使用新鲜制备的 2 mL 补充的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （sDMEM） 回收不溶性基质部分，该培养基质部分含有 1 mg/mL 胶原酶 IV、40 μg/mL DNase I 和 2% 胎牛血清 （FBS）。
    注意:胶原酶 IV 和胶原酶 D 是有害物质，必须在生物安全柜内使用适当的个人防护设备进行处理。
11. 为了制备单细胞悬浮液，在37°C下以恒定旋转酶消化合并组织（最多20）10分钟。
12. 将 4 mL 含有 1 mg/mL 胶原酶 D、40 μg/mL DNase I 和 2% FBS 的新鲜制备的 sDMEM 直接加入含有基质组织的试管中。在37°C下再孵育10分钟，并不断旋转。
13. 通过加入 8 mL 冰冷的 PBS 停止消化。通过在4°C下以200× g 离心5分钟来收集细胞。
14. 弃去上清液，并通过重悬于1mL冷PBS中并在4°C下以200× g 离心5分钟来洗涤细胞两次。 将细胞保持在冰上。
    注意:可以对细胞进行计数并调整到所需的浓度。这可能需要针对不同的细胞群进行优化。使用该方案，通常恢复0.5 x 10^6-1 x 10⁶ 基质细胞/脾脏，具体取决于供体小鼠的年龄。在此阶段可以选择对细胞进行染色和 FACS 分选，以确定细胞组成。

2. 细胞聚集体的基质封装

1. 在-20°C冰箱内预冷无菌P200移液器吸头。
2. 将柔性实验室薄膜（例如，封口膜）切成 1 cm x 2 cm 的小块，并通过浸入 80% 乙醇中 10 分钟进行灭菌，然后用 PBS 灭菌 10 分钟。实验室胶片可以提前制备并无菌储存。
3. 通过在4°C下以200×g离心5分钟来制备0.5×106-2.5×106^细胞。 小心地吸出上清液，留下约20μL剩余的PBS体积。将细胞沉淀放在冰上。
   注意:可以在不干扰细胞沉淀的情况下轻轻吸出剩余的PBS以确认体积。
4. 使用 P20 移液器将 2 μL 冰冷基底膜基质吸入预冷的 P200 移液器吸头中。
   注:高浓度基底膜基质（例如，康宁基质胶基质高浓度基质）有助于形成坚固的固化塞。
5. 轻轻扭转以弹出移液器吸头。拉伸预先灭菌的实验室薄膜条，并将其放在移液器吸头的末端，注意不要刺穿薄膜。继续将吸头包裹在薄膜中以密封移液器吸头。小心地将密封的尖端直接放在冰上，注意不要使薄膜破裂。
6. 将细胞沉淀重悬于剩余的PBS中，并将溶液轻轻地分层在基底膜基质上。将结构保持在冰上。
7. 通过将 1.2 mL 簇状管放入 14 mL 锥形管中来制备离心管。
8. 将移液器吸头置于嵌套管配置中，并在400× g 和4°C下离心5分钟。
9. 将14mL锥形管垂直放置，并在37°C下孵育15分钟，以使基底膜基质在移液器吸头内固化。
   注意:14 mL 锥形管可以放在冰上，直到下游应用需要为止。

3.三维类器官培养

1. 小心地从移液器吸头上取下实验室薄膜。
2. 将细不锈钢丝柱塞插入移液器吸头的较大开口。
3. 将基质塞排出，直到通过尖端释放到未经处理的 6 孔组织培养板的一个孔中，该培养板含有 2 mL sDMEM，补充有 10% FBS、1x Glutamax、1x 非必需氨基酸 （NEAA）、10 μM Rock 抑制剂、10 U/mL 青霉素/链霉素和 50 μM β-巯基乙醇。
   注意:组织培养容器和相应的培养基体积可以根据需要进行调整。
   注意:NEAA、青霉素/链霉素和 β-巯基乙醇是有害物质，必须在生物安全柜内使用适当的个人防护设备进行处理。
4. 在37°C，5%CO₂和95%湿度下培养类器官4-12周。
5. 每 5 天更换一半的培养基。
   注意:如果类器官开始附着在组织培养板上，请转移到新鲜孔中。

4.肾包膜移植

1. 准备无菌手术器械。
2. 对基底膜基质塞进行包膜下肾移植:
   1. 按照机构动物伦理指南用异氟醚麻醉 8 周龄 BALB/c 雌性受体小鼠。
      注意: 异氟烷是一种有害物质。必须清除废气，以防止进入工作空间环境。
   2. 将鼠标放在右侧位置。
   3. 剃掉手术部位的毛发，并按照机构指南对皮肤进行消毒。
      注意: 建议使用碘基或氯己定基和酒精基交替擦洗以圆周运动对手术部位进行三次消毒。
   4. 在垂直于脊柱的皮肤上做一个 2 厘米的切口，露出腹膜壁。
      注意:可以使用细手术剪刀或手术刀刀片进行皮肤切口。用户应遵守机构动物伦理准则或标准操作程序。
   5. 在肾脏上方的腹膜壁上做一个 0.5 cm 的小切口。
      注意:切口应近似于肾脏宽度，以确保肾脏在移植过程中保持外部化。
   6. 用拇指和食指向下按压，通过腹膜开口使肾脏外部化。可以使用一对环形镊子来辅助外部化。通过定期使用棉签涂抹无菌 PBS，确保肾脏在整个过程中保持湿润。
   7. 在立体显微镜下，用一对弯曲的超细镊子在肾脏的一极捏住肾包膜的肾周脂肪。使用第二对弯曲的超细镊子以相反的方向轻轻地向上撕裂肾囊膜，形成一个小开口。
   8. 小心地将一个镊子的插脚插入胶囊膜下方。使用缓慢的扫掠运动将包膜与肾实质分离。
   9. 通过从移液器吸头去除实验室薄膜来准备用于移植的基底膜基质塞。
   10. 使用镊子的一个插脚提起肾囊，然后将移液器尖端插入开口，将其推向肾脏的另一极。
   11. 将一根丝柱塞插入移液器吸头并排出基质塞，同时将移液器吸头从肾脏中取出。
   12. 用PBS润湿肾脏并重新内化。
   13. 用一个 5-0 Vicryl 缝合线闭合腹膜壁，并用两个自动夹闭合皮肤。
   14. 给予镇痛药（丁丙诺啡 0.05-0.1 mg/kg 皮下注射或遵循机构动物伦理指南）。
       注意: 丁丙诺啡是一种有害物质，必须使用适当的个人防护设备进行处理。
3. 关闭异氟醚的流动，但保持氧气流动，让小鼠呼吸纯氧，直到它开始获得意识。
4. 将鼠标放回笼子。在恢复期间，通过将笼子部分放置在加热垫顶部或加热灯下来保持动物温暖，并监测直到小鼠从麻醉中完全恢复。
5. 在前两周或按照机构指南的要求监测术后恢复情况。

Results

细胞聚集对于促进细胞间接触和信号传导很重要。将细胞聚集体包裹在基底膜基质内支持体 外 组织类器官形成的三维培养物，并促进细胞机械递送至肾囊进行移植。为了建立这些结构，首先在冰冷条件下将基底膜基质保持在流体状态。随后通过在上方分层浓缩细胞悬浮液并使用离心力推动细胞通过高密度基质来实现细胞聚集。需要优化离心速度（200-2000 x g）以实现中间层细胞定位（图1A），这也取决于细胞数量。较高的离心力（>500× g）将细胞推进到移液器的最尖端（图1B），并且需要注意较小的细胞数量（即<5×10⁵），这些细胞在去除柔性实验室薄膜覆盖物时可能会丢失。相反，如果G力太低（≤200× g），细胞可能无法充分穿过基底膜基质（图1C）。细胞数 <1 x 10⁵ 或 >2.5 x 10⁶ 的离心速度可能需要进一步优化。离心后，通过在37°C下加热构建体15分钟，将细胞置于基底膜基质内。这种凝固过程使基质"塞子"能够使用细丝柱塞完全弹出（图1D）。

体外 脾脏类器官形成
将基底膜基质塞喷射到适当的组织培养容器中，可重复地形成三维类器官样结构，其可以按照标准组织培养技术和条件（37°C，5%CO_2,95%湿度）¹¹保持。在培养中，支持基底膜基质底物在第 0 天和第 14 天之间逐渐消散（图 2A，i-iii），并且在第 21 天无法再观察到，留下完整的类器官样球形细胞团（图 2A，vi），直径约为 545 μm（标准差 = 120 μm，n = 6）¹¹。这些类器官结构在培养物中支持超过30天，但随着时间的推移没有增加（图2B）。脾脏类器官由CD45-TER-119^-基质细胞、CD45-TER-119⁺红细胞和CD45⁺TER-119^-淋巴样细胞组成（图2C），然而，每个群体的频率在单个类器官中是可变的（n = 4;表1）。为了评估脾脏类器官的一般结构，制备了 50 μm 厚的组织冷冻切片并进行了可视化。类器官由非空心结构组成，细胞存在于组织的整个直径上（图2D）。对7μm单细胞层厚度的类器官切片的评估显示，细胞排列在索状结构中，没有明确的空间方向（图2D），细胞串之间没有细胞核的区域。CD45抗体染色证实了有核造血细胞的存在，这些细胞密集地包围着类器官的外周区域（图2E）。此外，在更中央的类器官区域观察到具有不同纺锤形形态的CD45⁺细胞。CD90.2（T细胞）和CD19（B细胞）抗体染色普遍缺失，但CD11b染色阳性，表明髓系细胞的特异性存在（图2F）。在多个类器官中也检测到非造血 CD105⁺ 和 CD31⁺ 内皮细胞¹¹。

体内 脾脏移植
将聚集的脾基质细胞封装在半固体基质中有助于动物移植研究。该技术用于将普通或CD45-TER-119-FACS分选的新生儿脾基质细胞制剂包埋在基底膜基质塞内，作为小鼠肾囊下移植的载体。根据类似的细胞聚集方案⁸，基底膜基质封装细胞构建体 （MECC） 在 4/5 的独立动物移植中成功再生脾组织，从而证实了这种移植构建技术的可行性。为了测试 MECC 在定义脾脏再生所需细胞类型方面的效用，MECC 移植物由新生儿脾脏细胞构建，这些细胞特异性地耗尽了 PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ 或 PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- 基质 （CD45^-） 细胞¹¹。缺乏PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺细胞的移植物保留了大体组织再生的能力（4/4移植物;图3A）¹¹.四分之三的再生组织表现出正常的脾细胞组成和结构，显示中央小动脉，白色牙髓滤泡，分离的T细胞和B细胞区室，滤泡树突状细胞，边缘区网状细胞和边缘嗜金属巨噬细胞，红色牙髓正弦，髓样细胞和巨噬细胞（图3B）¹¹。相比之下，缺乏PDGFRβ ⁺ MAdCAM-1^-细胞的移植物在很大程度上无法再生脾脏组织（1/4移植物）¹¹。这些数据支持移植物来源的 PDGFRβ⁺ 细胞在脾脏组织再生中的重要性⁸，并确定了对 PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- 基质细胞的特定需求。

图 1.聚集的脾基质细胞的基底膜基质封装。 200 μL移液器吸头用于促进基底膜基质内的细胞聚集。首先通过将 2 μL 冰冷的基底膜基质吸入预冷的移液器吸头来建立流体基质层。细胞悬浮液沉积在基质层上方，并施加离心力以动员和聚集基底膜基质内的细胞。（A） 对离心机速度的设置进行了优化，以将细胞聚集体定位在基质层的中间。（B） 过快的离心速度导致细胞在移液器末端聚集。（C） 速度不足会阻止细胞在基质中移动。（D）在37°C下孵育15分钟后，将半固体基质塞从移液器吸头中弹出。箭头指示细胞聚集体在基质中的位置。比例尺，100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

图2.基底膜基质包封的脾脏聚集体的体外培养和三维类器官结构的形成。（A） 35 天疗程内的脾脏类器官发育。面板 （i-vi） 对应于培养中的第 0、7、14、21、28 和 35 天。图像是在尼康TS2倒置相差显微镜上拍摄的。比例尺，500μm。 （B）延长培养期的脾脏类器官直径。每条线代表一个单独的类器官。（C） 培养 53 天后基质 （CD45-TER-119^-）、淋巴样 （CD45⁺TER-119^-） 和红系 （CD45-TER-119⁺） 细胞群的流式细胞术表征。上图:由新生儿脾脏基质制备的对照组织。下图:脾脏类器官，第 52 天。（D） 培养 22 天后 50 μm（上面板）和 7 μm（下面板）切片厚度的类器官组织大体形态。（E） 培养 34 天后 CD45⁺ 造血细胞的定位和形态。放大区域显示在右侧面板中。切片为7μm。 （F）培养34天后髓系（CD11b），T（CD90.2）和B（CD19）细胞的评估。放大区域如插图所示。切片为 7 μm。使用尼康Eclipse Ti2-E活细胞显微镜拍摄图像。比例尺（D、E、F），100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

图3.基底膜基质移植组织分析。 移植物由缺乏 PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ 细胞的新生儿脾脏基质构建 （n = 4）。在线获取的其他数据¹¹.（A） 移植后 4 周肾包膜下再生脾移植物的宏观外观。方框黄色区域表示再生的脾脏组织。该图像是使用配备 Snap 变焦适配器的徕卡 M60 体视显微镜和 Apple iPhone 6S 拍摄的。比例尺，1000 μm。 （B）在冠状平面上冷冻切片的30μm厚度移植组织的复合多色免疫荧光图像。使用指示的标志物进行抗体染色，以可视化脾脏组织微结构。使用尼康Eclipse Ti2-E活细胞显微镜拍摄图像。方框区域显示放大倍率较高的区域。比例尺，1000μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

类器官编号	基质细胞	红细胞	淋巴细胞
1	62	7.7	31
2	22	24	55
3	3.6	0.1	96
4	10	76	12

表 1.单个脾脏类器官中基质、红系和淋巴样细胞群的百分比。

补充图1。该方案的示意图概述了为体外和体内研究生成基质包埋细胞构建体的主要步骤。请点击此处下载此文件。

Discussion

新生儿脾细胞在半固体培养基内的聚集代表了产生脾脏结构的可行方法。类似的基于基底膜基质的方案已被用于启动三维脾培养^物10。在这里，我们证明了脾脏结构同样适用于 体外 类器官培养系统以及 体内 移植模型。值得注意的是， 体外 培养的脾脏类器官的移植尚未经过测试，但确定全部或部分脾组织再生的能力将是有意义的。该协议还继承了先前脾移植研究中描述的细胞聚集技术⁸。这些研究涉及将细胞聚集体加载到胶原蛋白片上，然后在肾囊下移植。将细胞聚集体包裹在基底膜基质内在移植物取向方面具有明显的优势，其中消除了与胶原片朝下与细胞聚集体朝下移植相关的变异。

制备基底膜基质结构的方法相对简单。使用高浓度基底膜基质可确保细胞最初以聚集状态支持，然后基质在几天内消散。根据我们的经验，在仔细分层（步骤2.6）和离心（步骤2.8）PBS悬浮细胞溶液后，基底膜基质的混合和稀释最少。大多数优化都围绕着将细胞沉淀定位在基质塞内（图 1）。这可以通过测试几个变量来解决，例如离心速度、时间、基底膜基质体积组成、PBS 悬浮细胞溶液体积和移液器吸头尺寸。细胞数量和特性（大小、密度）也可能影响设置，每种细胞制备应单独优化。

有几个限制是很重要的。基底膜基质可能是一种对温度敏感的产品，应注意快速工作以保持试剂低温。这可以防止基质过早凝固，并确保细胞的正确封装。当所有相关材料在寒冷环境中储存、制备或维护时，手动处理步骤（例如，弹出移液器吸头、用柔性实验室薄膜密封 [步骤 2.5]）可能会从用户那里引入外部热量，从而改变基质粘度并影响离心过程中的细胞迁移特性。因此，实验内部和实验之间的可重复性可能难以始终如一地实现。

第二个限制是对用户体验和熟练程度的要求。某些手动技术可能需要扩展培训才能高效和成功地执行。例如，用实验室薄膜密封移液器吸头（步骤2.5）最初可能导致成功率低，但随着实践的进行，这种情况将不可避免地得到改善。动物显微外科技术的能力也是通过重复获得的。对于移植，必须小心，特别是将移液器吸头插入肾囊下方（步骤4.2.10），插入金属丝柱塞以弹出塞子（步骤4.2.11）以及从肾脏中取出尖端时。重要的是，在同时拔出移液器吸头的同时，轻柔而稳定地弹出塞子。过度运动可能导致肾包膜穿孔或实质受损，导致出血过多。

总之，这里描述了将细胞封装在半固体基质中的过程，重点是了解脾组织的形成。该系统同样可以应用于多种细胞类型，并有可能在 体外 或 体内 下游应用。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 孔聚丙烯 1.2 mL 簇状管	康宁	CLS4401	用于置于 14 mL 锥形管中
B-巯基乙醇	Gibco	21985023	储备液 55 mM，在 50 μM
胶原酶 D	罗氏	11088858001
胶原酶 IV	来自溶组织梭菌	Sigma-Aldrich	C5138
	Sigma-Aldrich	D4513	脱氧核糖核酸酶 I，II-S 型，冻干粉，蛋白质和ge;80 %， ≥2,000 单位/mg 蛋白质
Dulbecco's 改良鹰's 培养基 （DMEM）	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，不含丙酮酸钠，液体。无菌过滤。
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Sigma-Aldrich	D8537	不含氯化钙和氯化镁，无菌过滤
Eclipse 200 μl 移液器吸头	Labcon	1030-260-000	斜面点
胎牛血清 （FBS）	Gibco	26140-079	批次# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	原液 100X，在 1X
基质胶	中使用 康宁	354263	基质胶基质基底膜 高浓度，批次# 7330186
MEM 非必需氨基酸	Gibco	11140076	原液 100X，用于 1X
青霉素/链霉素	Gibco	15140122	原液 10,000 单位/ml 青霉素，10,000 ug/ml 链霉素
可逆细胞过滤器	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
环形镊子	NAPOX	A-26	环尺寸：3 毫米
岩石抑制剂 （Y-27632）	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R 离心机	Thermofisher		加速和减速速度设置为 8
超细镊子	EMS	78340-51S	款式 51S。防磁/抗酸 SA 低碳奥氏体钢镊子具有耐腐蚀性。防眩光缎面处理。
Vicryl 5/0 缝合线 Ligapak 卷盘	Ethicon	J283G
Wiretrol II 长线柱塞	Drummond	5-000-2002-L	不锈钢柱塞，25 & 50 & mu;L/WRTL II， 长
缠绕夹 贴标器	MikRon	427630
缠绕夹	MikRon	427631	9 毫米