在此，我们描述了一种基于聚合人血红蛋白（PolyhHb）的氧载体作为灌注液的应用，以及该灌注溶液在大鼠模型中进行测试的实验方案 离体 肺灌注
方法文章
利用新一代聚合血红蛋白氧载体在大鼠离体肺灌注模型中探索替代性灌注液
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
肺移植受限于合适供体的缺乏。过去，那些被认为边缘或不合格的供体通常被弃用。然而，一些新兴且令人振奋的技术，例如离体肺灌注（ex vivo lung perfusion, EVLP），为肺移植机构提供了对边缘供体异体移植物进行更全面评估的机会。这一动态评估平台已促进肺移植数量的增加，并使医疗机构得以利用过去被弃用的供体，从而扩大了供体库。目前的灌注技术采用含细胞或无细胞的灌注液，二者各有优缺点。灌注液的成分对于维持稳态环境、提供充分的代谢支持、减轻炎症反应和细胞死亡，以及最终改善器官功能至关重要。灌注液必须含有足够的蛋白质浓度以维持适当的胶体渗透压。然而，现有的灌注液常导致液体通过肺血管内皮渗出，引发非预期的肺水肿和组织损伤。因此，亟需开发新型灌注液，在维持正常细胞稳态的同时防止过度损伤。本文介绍了以聚合人血红蛋白（PolyhHb）为基础的氧载体作为灌注液的应用，以及在大鼠EVLP模型中测试该灌注液的实验方案。本研究旨在为肺移植领域提供关键信息，以指导新型灌注液的设计与开发，并建立适用于临床转化移植模型的标准化测试流程。
引言
与实体器官移植领域的其他方向一样，肺移植也面临着供体器官短缺的问题。为了扩大供体来源，大量研究致力于探索过去被认为不适合移植的移植物的潜在应用价值，即扩展标准供体（extended criteria donors, ECD）。这些移植物可能由于多种原因被归类为ECD，包括质量存疑、功能较差、存在感染、创伤、热缺血或冷缺血时间过长以及供体高龄等。1,2在某些情况下，若这些肺脏适合立即移植3对供体和受体而言，通常有必要对这些肺脏再次进行评估，以确定其是否适合移植。 离体 肺灌注（EVLP）是一种可在体外封闭回路中对潜在肺移植物进行延长评估的技术2,4,5,6,7，使移植提供方能够确定器官是否适合移植。EVLP 已显示出充分评估供体器官的能力8,9,10,11，减轻缺血再灌注损伤（IRI）的影响12,13 并扩大供体库14,15 从而使得肺移植对所有患者而言成为一种更易获得的治疗选择。
通常，离体肺灌注（EVLP）系统是一个封闭系统，包含一个通气回路（通过将呼吸机连接至气管以向系统内引入空气）和一个血管回路（通过管路将左心房（LA）与肺动脉（PA）相连）7。血管回路中循环流动的灌注液可为肺组织提供必需的营养物质和氧气，同时限制冷缺血时间（CIT）5,8,16,17。该灌注液可以是基于血液的（即添加浓缩红细胞（PRBCs））16,17，也可以是非细胞型的（即不含PRBCs）4,5。然而，使用PRBCs存在若干显著缺点。若采用来自创伤死亡或脑死亡供体（BDD）的PRBCs，这些液体通常含有大量炎性细胞因子，可能在EVLP过程中加剧细胞损伤，并增加游离血红蛋白（Hb）、血红素、铁及细胞碎片的水平，从而对细胞造成进一步损害18,19。此外，由于这些供体通常为多器官捐献者，在器官获取前采集PRBCs可能导致供体血容量减少，进而加重所有器官的缺血程度。若采用其他来源的PRBCs，临床机构可能面临血液供应短缺的问题，因为该材料本身即十分稀缺20,21。最后，无论来源如何，PRBCs在EVLP回路中均易发生机械性溶血，释放Hb及其他成分，进而导致细胞损伤。
因此，出于多种原因，使用人工红细胞替代物，即基于血红蛋白的携氧载体（HBOC），作为灌注液的补充成分可能具有优势。其中一种尤为有前景的HBOC是聚合人血红蛋白（PolyhHb）。PolyhHb由从已过期且被认为不适合直接输注的PRBCs中纯化的血红蛋白制备而成。22它们已被证明可在出血性休克中作为有效的血液替代品23 和移植24 并且可以大量生产22然而，由于出现了一些意想不到的并发症，如血管收缩、血压升高和心脏骤停，聚血红蛋白的大规模应用未能成功23,25. 这些发现背后的原因可能在于存在游离血红蛋白或低分子量血红蛋白聚合物（< 500 kDa）的多聚Hb分子，因为它们容易渗出血管进入组织间隙，导致一氧化氮可用性降低，继而引起血管收缩、全身性高血压，最终造成氧化性组织损伤26,27为改进上述问题，Palmer 实验室致力于开发新一代多聚血红蛋白（PolyhHb），其低分子量组分和无细胞血红蛋白含量极低，已显示出更优的生物物理特性 体内 反应22,28,29,30多项动物输血研究表明，如果从血红蛋白氧载体（HBOC）中去除低分子量血红蛋白聚合物，则可减轻血管收缩、系统性高血压及氧化损伤28,29,31,32,33,34,35因此，这使得下一代多聚血红蛋白成为一种有前景的灌注液候选物。
本文介绍了将新一代多聚血红蛋白（PolyhHb）应用于灌注液的方法，以及在大鼠离体肺灌注（EVLP）模型中测试该灌注液的实验方案。本研究的目标是为肺移植领域提供设计和开发新型灌注液的关键信息，并提供可在临床相关的转化移植模型中进行测试的标准化操作流程。
方案
Sprague-Dawley大鼠（体重300 g）购自商业供应商，并饲养于俄亥俄州立大学韦克斯纳医学中心动物设施的无病原体环境中。所有操作均依照美国国立卫生研究院（NIH）和国家研究委员会《实验动物人道照护与使用指南》的规定进行，并经俄亥俄州立大学机构动物照护与使用委员会（IACUC方案编号2023A00000071）批准，以确保操作的人道性。
1. 多聚血红蛋白的合成与纯化
注意：本研究中用于后续 EVLP 实验的 PolyhHb 材料的制备与合成方法最初由 Cuddington 等人于 2020 年发表22。有关 PolyhHb 合成的详细示意图与分析，请参考该文献。以下是对 PolyhHb 在中试规模下的合成与纯化过程，以及其后续作为灌注液配制方法的简要概述。
- 红细胞洗涤、裂解与血红蛋白纯化
- 获取18单位过期的人类浓缩红细胞（PRBCs），将其倒入20 L过滤容器中，用0.9 wt%生理盐水稀释至终末红细胞压积为22%（图1B，C）。
- 在0.65 µm改性聚醚砜（mPES）切向流过滤（TFF）模块上，使用0.9 wt%生理盐水对红细胞溶液进行六次系统体积置换（透析循环）。注：此洗涤步骤的目的是在溶血前去除受损的红细胞、膜碎片及其他细胞外物质（图1B，C）。
- 用10 L磷酸盐缓冲液（PB，3.75 mM，pH 7.4）在4 °C下持续搅拌裂解红细胞溶液1小时。
- 通过500 kDa TFF模块过滤溶液，去除裂解后的膜碎片及其他聚集体，并将滤过液收集至30 L批次反应器容器中（图1A-C）。
- 当反应器中血红蛋白含量达到480 g时，加入盐类试剂，将PB转化为磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）。
- 将血红蛋白溶液通过通入氮气的气体接触器循环，并在反应器中维持氮气顶空，过夜脱氧。冷却至14 °C以限制高铁血红蛋白（metHb）的形成。
- 血红蛋白聚合
- 在气体接触器循环过程中，将血红蛋白溶液加热至生理温度（37 °C）。
注：目标是将蛋白质脱氧至pO2在0–10 mmHg之间，以确保大部分血红蛋白处于紧张型四聚体状态（图1A）。 - 根据需要加入1 g连二亚硫酸钠，以确保有效脱氧。
- 在维持循环回路并对血红蛋白溶液进行脱气的同时，加入用3 L脱氧PBS（pH 7.4）稀释的戊二醛（GA）与血红蛋白摩尔比为30:1的溶液。
- 在3小时内将溶液加入反应器，并额外反应1小时。
- 用氰基硼氢化钠与GA摩尔比为7:1的溶液（用3 L PBS，pH 7.4稀释）淬灭交联反应，加入反应器时间超过10分钟。
- 将反应器在14 °C下冷却过夜。
- 在气体接触器循环过程中，将血红蛋白溶液加热至生理温度（37 °C）。
- 聚合血红蛋白（polyhHb）纯化
- 将反应器内容物泵入10 L过滤容器，并开始通过0.2 µm聚醚砜（PES）TFF模块循环（第一阶段）。此步骤用于去除大分子聚集体及不需要的污染物。
- 将第一阶段的滤过液导入第二个10 L过滤容器，待其充满后，通过500 kDa聚砜（PS）TFF模块循环（第二阶段）。持续操作直至反应器排空（图1B，D）。
- 当反应器内容物完全进入纯化回路后，使用改良乳酸林格液（pH 7.4）对第一阶段开始辅料置换。每次完成全体积置换后，使用紫外-可见光谱法测定第一阶段滤过液中的蛋白浓度。
- 当第一阶段滤过液中血红蛋白浓度低于1 mg/mL时，将改良林格液转移至第二阶段。第一阶段中任何滞留液体均视为废液，应妥善处理。总共确保两个阶段共完成12次全体积的改良林格液置换。
- 完成透析循环后，通过500 kDa TFF模块将第二阶段内容物浓缩至至少10 g/dL。
- 将浓缩液分装至50 mL锥形管中，储存于-80 °C直至使用。
2. 灌注液配方
- 将灌注液配制至终体积165 mL。用William's E培养基将PolyhHb稀释至终浓度为3.7 g/dL。
- 加入人血清白蛋白（HSA），使其终浓度为按重量计3% HSA。向终溶液中加入1 mL肝素。
3. 离体 肺灌注回路设置
- 将 PolyhHb 灌注液加入 EVLP 电路储液器中，并将恒温水浴开启至 37 °C。通过启动滚轴泵，确保灌注液在电路中循环。
- 将脱氧气体（即 6% O2、8% CO2、84% N2）连接至中空纤维氧合器，以对灌注液进行脱氧处理。此步骤用于评估肺脏对灌注液的氧合能力。
- 在附近计算机上打开数据采集软件。确保肺动脉压力、气管压差、呼吸流速压差、肺重量及泵速传感器均已连接至电路和数据转换盒。
- 仔细检查所有管路连接处，确认系统无泄漏，并确保恒温水在系统中循环（图 2）。在数据采集软件中点击运行，以确认所有压力传感器正常工作。待系统正常运行后，关闭滚轴泵。
4. 获取供体大鼠肺组织块
- 设置手术台并摆放器械（图3）。将所有器械在121 °C条件下高压灭菌30分钟。
- 准备1200 U/kg的肝素、用于麻醉的氯胺酮/赛拉嗪混合液（60 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪），以及5–10 cm长的丝线缝合线（3-0或4-0）。
- 将氯胺酮/赛拉嗪溶液经腹腔注射入大鼠体内。等待5–10分钟以使麻醉深度达到合适水平。为确认麻醉效果，可轻夹大鼠脚趾以观察其是否出现反应。若无反应，则表明已达到适当的麻醉深度。
- 剃除大鼠腹部毛发，并将其仰卧位固定于手术板上。使用聚维酮碘和70%乙醇清洁腹部区域。在大鼠眼睛下方涂抹眼用软膏，以防角膜干燥。
- 将大鼠移至手术板并妥善固定（图4A）。启动数据采集软件并开始记录。开启呼吸机，设置潮气量为4 mL/kg，并确保呼气末正压（PEEP）约为2 cm/H2O。
注意：这些初始参数设置因实验而异。研究人员应根据具体实验需求确定最佳通气策略。 - 当达到合适麻醉深度后，使用剪刀从剑突至耻骨联合处行正中腹切口。随后进行内侧-外侧内脏旋转，用钝性器械暴露肝下腔静脉（IVC）36,37,38（图4B）。使用20G针头向腔静脉内注射肝素（图4C）。
- 转向颈部区域，使用剪刀从胸骨切迹至下颌角下方切开皮肤。随后开始向气管方向进行解剖（图5A）。
- 在颈部区域，采用钝性分离方法分离必要的带状肌，以暴露气管（图5B）。使用剪刀在气管前壁的软骨环之间做一横向切口，切口大小应足以插入气管插管（数毫米），但不得切穿气管后壁。在气管周围放置一根5-0丝线缝合线（图5C）。
- 插入气管插管，并用前述5-0丝线将其固定（图5D）。将气管插管连接至呼吸机，并确认胸部有规律起伏。
- 使用剪刀行胸骨正中切开术，再次进入胸腔。放置胸壁牵开器以暴露心脏和肺脏（图6A）。操作过程中应避免对肺组织造成意外损伤，因其极为脆弱。
- 结合锐性（剪刀）与钝性分离法，从前纵隔去除胸腺。操作时需小心，避免损伤大血管或肺组织。
- 识别肺动脉（PA；图6B），并在其周围放置一根5-0丝线，为插管做准备（图6C）。由于大鼠大血管的显微解剖结构特点，通常同时在肺动脉和主动脉周围放置缝线更为方便。
- 使用剪刀在右心室流出道（RVOT）处做一2–3 mm切口（图6D-E），将动脉插管置入肺动脉，并用前一步所述的5-0缝线固定（图6F）。
- 使用剪刀在左心室（LV）及肝下腔静脉（IVC）处各做一5 mm切口，以实施安乐死。迅速将肺保存液连接至动脉插管，利用重力灌注约20 mL液体以冲洗肺脏（图7A-B）。连接前应确保肺保存液已排除空气，因气栓对肺组织具有严重损害。
- 将动脉插管连接至体外肺灌注（EVLP）回路。启动蠕动泵，使少量灌注液流经肺组织并从左心室流入胸腔。当灌注液开始从左心房流出时，关闭蠕动泵（图7C）。在灌注过程中，需确保肺动脉压力未出现骤升，否则提示可能存在阻塞或插管位置不当。
- 将小型镊子插入左心室，轻柔牵拉二尖瓣环，以便引入左心房（LA）插管（图8A）。在心脏周围放置一根5-0丝线并松散结扎（图8B）。
- 将左心房插管经左心室插入，并推进插管直至其进入心房内可见。使用预先结扎的5-0缝线完成左心房插管的固定（图8C）。
- 识别食管，并尽可能靠近膈肌处用止血钳夹闭。在止血钳下方剪断食管，以防止内容物溢入胸腔（图9A）。
- 以脊柱为解剖标志，使用剪刀切断所有连接心肺组织块与周围结构的韧带组织（图9B）。当心肺组织块完全游离后，从颈部分离气管，最后在气管插管上方用剪刀切断气管，从而完整取出心肺组织块（图9C）。
- 将心肺组织块转移至EVLP回路中的胸腔套管内，并将左心房插管连接至EVLP回路（图9D）。启动蠕动泵，并连接呼吸机监测设备。
- 检查气泡捕获装置，确保无气栓进入系统。
- 在最初15分钟内逐步调整通气和灌注参数至实验所需水平36,37,38。此外，在此初始上升阶段，逐步增加灌注流速至目标流速和/或压力。
- 在实验设计规定的时间点，检测灌注液气体水平及肺功能指标。
结果
我们基于PolyhHb的灌注液的验证，以及该灌注液在数小时内的稳定性，已在下文得到证实 图10在最初的1小时内，所有测试的灌注液（PolyhHb、对照组（Williams培养基+5% HSA）、基于红细胞的灌注液）均显示出LA pO₂轻微下降2 （术后 pO）2）。然而，与PolyhHb相比，基于红细胞的灌注液在1小时时显示出显著下降（p < 0.05）。在接下来的数小时内进行测试时，PolyhHb 和对照灌注液的 LA pO₂ 均保持稳定2, 而PolyhHb呈现非显著性趋势（p > 0.05）的较高 pO2 (图10A). ΔpO2，即左心房 pO₂ 的变化2 来自PA pO2，红细胞灌注组在1小时时再次显著降低（p < 0.05），而在PolyhHb组和对照组灌注液中则保持稳定，呈无显著性趋势（p > 0.05）的较高 pO2 在PolyhHb组中（图10B). 左心房 pCO₂2 在第一小时后，红细胞灌注液和对照灌注液中的指标显著低于聚合血红蛋白灌注液（p < 0.05）。 < 0.05），在接下来的数小时内，比较PolyhHb与对照灌注液时，这一结果仍然成立（图10C）。最后，ΔpCO₂2 （即左心房 pCO2 与肺动脉 pCO2 之差）在红细胞灌注液中灌注 1 小时后显著升高（p < 0.05）。 < 0.05），并且在PolyhHb和对照灌注液中数小时后仍保持稳定（图10D).
通过采集软件获得的实时肺生理数据为灌注液气体水平提供了补充信息（图11）。肺血管阻力（PVR）再次显示，红细胞（RBC）灌注液在第一个小时内显著升高（p < 0.05）。在随后的数小时内，PolyhHb组和对照组的灌注液均保持稳定且较低的PVR水平（图11A）。肺重量的变化在RBC灌注液组于第一个小时内也显著增加（p < 0.05），而在剩余时间内，PolyhHb组和对照组的肺重量均有所上升，其中PolyhHb组的肺重量略高（图11B）。最后，RBC灌注液组的顺应性在第一个小时内显著下降（p < 0.05），而PolyhHb组和对照组则表现为无显著性下降（p > 0.05），在4小时后，PolyhHb组的肺顺应性最高（图11C）。
关于技术上的成功与失败（图12），有几个要点需要特别关注。在图12A中，可见由于肺血管内可能存在血栓导致右上肺叶坏死，进而引起同种移植失败。在图12B中，我们同样观察到右肺叶严重组织水肿，导致实验失败。图12C–E显示了在相应实验条件下组织保存良好且形态正常。最后，在图12F中，可见使用肺保存液灌注后，组织保存效果理想。
图1：PolyhHb的中试规模合成与纯化。（A）用于聚合反应的生物反应器。（B）切向流过滤（TFF）过程在4 °C冰箱中设置。（C）用于红细胞（RBC）洗涤和血红蛋白（Hb）纯化的并行TFF装置特写。（D）用于PolyhHb纯化的两阶段串联TFF系统特写。第一阶段和第二阶段的容器分别位于滤器的左侧和右侧。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：离体肺灌注（EVLP）回路示意图。（A）EVLP 回路的示意图。（B）肺动脉插管和左心房插管的在体位置。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：手术操作中使用的器械 离体 肺灌注 (A丝线缝合。B细尖镊子（中等长度）。C长柄细尖镊子。D）弯曲细尖镊子。E）梅奥剪刀。F气管插管G肺动脉（PA）导管。H左心房（LA）插管。I肋骨牵开器。J弹簧剪。K）DeBakey 镊子。L止血钳。M小剪刀。N小号弯头精细镊子。OAdson镊子 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4：手术体位及暴露下腔静脉（IVC）。（A）用于肺组织获取的大鼠体位。（B）暴露肝下段下腔静脉。（C）插管下腔静脉，并使用27G针头注射肝素。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：使用气管导管（ET 管）进行气管插管。（A）首先切开颈部区域的皮肤。（B）分离带状肌和结缔组织，暴露气管。（C）在气管软骨环之间的前部气管上做一个横向切口，切口大小应足以容纳 ET 管。（D）将 ET 管插入气管，并用丝线缝合固定。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：肺动脉插管放置。（A）暴露胸腔以观察心脏和肺部。（B）识别肺动脉（PA）并将其分离。（C）在肺动脉周围放置缝线。（D）在右心室流出道（RVOT）上切开一个小孔，用于插入肺动脉插管。（E）将肺动脉插管正确置入肺动脉内。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：用保存液灌注肺脏。 (A) 将灌注套管连接至肺动脉（PA）套管。B应有清亮的液体从左心房（LA）流出。C) 将肺动脉插管连接到 离体 肺灌注回路，以确保肺动脉插管的位置正确且血流顺畅。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图8：放置左心房（LA）插管。（A）使用一对镊子轻柔扩张二尖瓣环。（B）在左心室（LV）周围松松地放置一根丝线缝线。将LA插管置入左心房内。请点击此处查看该图的放大版本。
图9：取出心肺组织块。 (A) 在止血钳下方结扎食管。B解剖以分离心肺组织块与脊柱。C游离气管。D正确的连接与放置 离体 肺灌注（EVLP）导管 请点击此处以查看此图的放大版本。
图10．灌注液气体水平随时间的变化。 （A）灌注后pO2，即左心房（LA）pO2，在4小时灌注期间的变化。（B）ΔpO2，即左心房pO2相对于肺动脉（PA）pO2的变化值，在4小时灌注期间的变化。（C）灌注后pCO2，即左心房pCO2，在4小时灌注期间的变化。（D）ΔpCO2，即左心房pCO2相对于肺动脉pCO2的变化值，在4小时灌注期间的变化。蓝色代表PolyhHb灌注液，黑色代表对照组灌注液（标准William's培养基），红色代表基于红细胞的灌注液。每组n=6。误差线表示标准差。显著性检验采用Student t检验，*表示p < 0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。
图11．实时肺生理数据。（A）再灌注4小时期间的肺血管阻力（PVR）。（B）肺重量随时间的变化（以Δ表示）。（C）再灌注4小时期间的肺顺应性。蓝色代表PolyhHb灌注液，黑色代表对照灌注液（标准William's培养基），红色代表基于红细胞的灌注液。每组n=6。误差线表示标准差。显著性采用Student's T检验进行分析，以*表示，p < 0.05。请点击此处查看该图的放大版本。
图12：代表性技术结果。（A）由于右上肺叶梗死导致的移植物失败。（B）由于严重右肺叶水肿导致的移植物失败。（C）使用红细胞灌注液成功插管并灌注肺同种移植物。（D）使用PolyhHb灌注液成功插管并灌注肺同种移植物。（E）使用标准灌注液成功插管并灌注肺同种移植物。（F）用肺保存液冲洗后理想的组织保存效果。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
灌注液的开发与测试是一项新兴的探索，全球许多研究者正在投身其中。传统上，标准灌注液能够暂停缺血时间，并减轻缺血及再灌注相关损伤18。然而，离体肺灌注（EVLP）技术的下一步发展在于改进现有的灌注液技术，同时整合修复与再调节治疗手段39,40,41,42,43。
本研究中描述的多聚Hb分子大小介于500 kDa与0.2 µm之间，以防止材料从循环系统渗入肺组织，从而避免血管收缩和肺动脉压力升高30在整个合成的聚合步骤中，氧分压（pO₂）必须严格控制。2) 维持在所需氧亲和力的多聚血红蛋白（PolyhHb）产物对应的适当值。这包括反应过程中添加的所有溶液（即交联剂、终止液等），其氧分压（pO2）需与生物反应器中的条件相匹配（即用氮气脱气、氧合等处理）。该合成工艺的一个主要优势在于最终产物的氧解离平衡可调节，从而适用于不同氧需求的应用场景（例如，低氧亲和力的PolyhHb用于输血医学，中等氧亲和力的用于肺灌注，高氧亲和力的用于靶向氧输送）。此外，必须确保生物反应器具备加热装置，且不会在接触点产生过度局部加热，以免导致蛋白质损伤。我们发现，相较于安装在容器外部的绝缘加热套，贯穿整个容器的铜管能够提供更均匀且对蛋白更温和的加热/冷却效果。图1A).
尽管EVLP大鼠模型的建立并非新方法37,38，但我们注意到若干可改进结果的关键环节。首先，在处死动物时需对下腔静脉（IVC）做小切口，以确保无额外空气经循环进入肺组织。在用肺保存液冲洗肺移植物时，肺组织呈现均匀的苍白色，提示显微外科医生获取肺组织的技术操作成功。若肺实质内仍存在粉红色区域，有时建议调整肺动脉（PA）插管位置，以确保整个肺组织得到均匀灌注。虽然肺动脉插管通常是该操作中较易完成的部分，但左心房（LA）插管则稍具挑战性。为使左心房插管顺利进入左心房，必须扩张二尖瓣环，但操作时需格外谨慎，以免穿孔心室或心房。一旦插管尖端进入心房，在围绕心室缝合固定时，插管常可能发生移位。此时通常需要调整手术台角度（更趋水平）或在插管底部放置一块纱布，以保持其位置稳定。
局限性
该模型存在一些局限性。尽管它有助于评估灌注液的效果及其改善潜在异体移植物的能力，但它并非移植模型，因此无法告诉我们 体内 不同灌注液和技术的结果。此外，尽管PolyhHb是一种令人期待的新型灌注液技术，但其应用、有效性及潜在局限性尚需通过更多的临床前和临床灌注实验进一步验证，方可考虑广泛采用该技术。
结论
在此，我们展示了新一代聚合血红蛋白（PolyhHb）灌注液的应用，以及该灌注液在大鼠体外肺灌注（EVLP）模型中进行测试的实验方案。随着灌注液技术的进步，探索聚合血红蛋白作为传统灌注液潜在替代物的可能性将具有重要意义30以往几代的多聚血红蛋白（PolyhHb）因其组成成分导致了有害的副作用；然而，合成工艺的改进已制备出一种更不易渗出血管、引发水肿并造成细胞损伤的聚合物30使用PolyhHb，可以在无需红细胞的情况下进行离体肺灌注（EVLP），同时仍能满足肺移植物的代谢需求。这无疑将有助于改善移植物功能。 离体然而，PolyhHb 在临床前和临床环境中的进一步验证仍然必要。我们希望本方案能为肺移植领域提供关键信息，以设计和开发新型灌注溶液，以及在具有临床相关性的转化移植模型中测试这些溶液的适当方案。
披露
针对本研究中所展示的材料，A.F.P.、A.G. 和 C.C. 是美国专利申请 PCT/US2022/041743 的发明人。A.F.P.、C.C.、B.A.W. 和 S.M.B. 是美国专利申请 PCT/US2023/017765 的发明人。
致谢
本研究得到了Jewel和Frank Benson家族捐赠基金以及Jewel和Frank Benson研究教授职位的慷慨支持。B.A.W. 部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01HL143000支持。A.F.P. 由美国国立卫生研究院资助项目R01HL126945、R01EB021926、R01HL131720、R01HL138116以及美国陆军医学研究与物资司令部资助项目W81XWH1810059支持。S.M.B. 由美国国立卫生研究院资助项目R01 DK123475支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 cc 胰岛素注射器 29 G x 1/2" 针头 | B-D | 309301 | |
| 30 L 玻璃批次式生物反应器 | Ace Glass | ||
| 30g 针头 | Med Needles | BD-305106 | |
| 拜耳欣（恩诺沙星）抗菌片剂 | Elanco | NA | |
| 二水合氯化钙（CaCl2·2H2O） | Sigma Aldrich | 10035-04-8 | 用于改良林格乳酸盐溶液 |
| CFBA 载波频率桥式放大器 型号 672 | Harvard Apparatus | 731747 | |
| D150 连接套件 | Cole-Parmer | VK 73-3763 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Dumont 医用 #5/45 镊子 - 45° 弯头 | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Ecoline Star Edition 003, E100 水加热器 | Lauda | LCK 1879 | |
| 过期的人类去白细胞浓缩红细胞单位 | Wexner 医疗中心 加拿大血液服务中心 Zen-Bio 公司 | ||
| D150 纤维膜氧合器 | Hugo Sachs Elektronik | PY2 73-3762 | |
| 镊子 | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| 戊二醛（C5H8O2，70 wt%） | Sigma Aldrich | 111-30-8 (G7776) | |
| Halsted-Mosquito 止血钳 | Roboz Surgical | RS-7112 | |
| 肝素 30,000 单位/30 ml | APP Pharmaceuticals | ||
| 人血清白蛋白（HSA） | OctaPharma Plasma | 灌注液添加剂 | |
| IL2 灌注液管路套件 | Harvard Apparatus | 733842 | |
| IPL-2 基础肺灌注系统 | Harvard Apparatus | ||
| 氯胺酮 500 mg/5 ml | JHP Pharmaceuticals | ||
| 左心房插管 | Harvard Apparatus | 730712 | |
| Liqui-Cel EXF 系列 G420 膜接触器 | 3M | G420 | 气体接触器 |
| 低钾右旋糖酐葡萄糖溶液（Perfadex） | XVIVO | 用于肺冲洗的溶液 | |
| Masterflex 铂金涂层泵管（尺寸：73,17,16,24） | Cole-Parmer | ||
| N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC，C5H9NO3S） | Sigma Aldrich | 616-91-1 (A7250) | 用于改良林格乳酸盐溶液 |
| Nalgene 容器（10L，20L） | Nalgene | 过滤容器 | |
| 蠕动泵 | Ismatec | ISM 827B | |
| PES，0.65 µm 切向流过滤模块 | Repligen | N02-E65U-07-N | |
| PhysioSuite | Kent Scientific Corporation | PS-MSTAT-RT | |
| 聚醚砜（PES），0.2 µm 切向流过滤模块 | Repligen | N02-S20U-05-N | |
| 聚砜（PS），500 kDa 切向流过滤模块 | Repligen | N02-P500-05-N | |
| 氯化钾（KCl） | Fisher Scientific | 7447-40-7 | 用于 PBS |
| PowerLab 8/35 | ADInstruments | 730045 | |
| 肺动脉插管 | Harvard Apparatus | 730710 | |
| 泵头管路（尺寸：73,17,16,24） | PharMed BPT | ||
| Puralube 眼用软膏 | Dechra | NA | |
| 剪刀 | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SCP 灌注伺服控制器 型号 704 | Harvard Apparatus | 732806 | |
| 小型动物呼吸机 型号 683 | Harvard Apparatus | 55-000 | |
| 氯化钠（NaCl） | Fisher Scientific | 7647-14-5 (S271-10) | 用于 PBS 和生理盐水 |
| 氰基硼氢化钠（NaCNBH3） | Sigma Aldrich | 25895-60-7 | |
| 连二亚硫酸钠（Na2S2O4） | Sigma Aldrich | 7775-14-6 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Fisher Scientific | 1310-73-2 | 用于改良林格乳酸盐溶液 |
| 乳酸钠（NaC3H5O3） | Sigma Aldrich | 867-56-1 | 用于改良林格乳酸盐溶液 |
| 磷酸氢二钠（Na2HPO4） | Fisher Scientific | 7558-79-4 | 用于 PBS |
| 磷酸二氢钠（NaH2PO4） | Fisher Scientific | 7558-80-7 | 用于 PBS |
| SomnoSuite 小型动物麻醉系统 | Kent Scientific Corporation | SS-MVG-Module | |
| Sprague-Dawley 大鼠 | Envigo | ||
| TAM-A 换能器放大模块 型号 705/1 | Harvard Apparatus | 73-0065 | |
| TAM-D 换能器放大器 型号 705/2 | Harvard Apparatus | 73-1793 | |
| TCM 时间控制模块 型号 686 | Harvard Apparatus | 731750 | |
| 气管插管 | Harvard Apparatus | 733557 | |
| 湿室管路套件 | Harvard Apparatus | 73V83157 | |
| 泵管盒 | Cole-Parmer | IS 0649 | |
| #5 Dumostar 镊子 | Kent Scientific Corporation | INS500085-A | |
| #5 不锈钢弯头镊子 | Kent Scientific Corporation | IND500232 | |
| #7 钛镊子 | Kent Scientific Corporation | INS600187 | |
| Tygon E-3603 泵管 内径 2.4 mm | Harvard Apparatus | 721017 | 进入肺的灌注液管路 |
| Tygon E-3603 泵管 内径 3.2 mm | Harvard Apparatus | 721019 | 离开肺的灌注液管路 |
| Vannas-Tubingen 弹簧剪刀 | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| VCM 呼吸机控制模块 型号 681 | Harvard Apparatus | 731741 | |
| William's E 培养基 | Gibco, ThermoFisher Scientific | A12176-01 | 灌注液添加剂 |
| 赛拉嗪 100 mg/1 ml | Akorn |
参考文献
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重印与许可
