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肝细胞癌微环境中肥大细胞预示良好预后：一项基于QuPath图像分析软件的回顾性研究

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DOI：

10.3791/66743

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2024年4月12日

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1Laboratory of Translational Cancer Genomics, Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen, Charles University, 2Laboratory of Cancer Treatment and Tissue Regeneration, Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen, Charles University, 3Department of Pathology, Third Faculty of Medicine, Charles University, 4Department of Surgery and Biomedical Center, Faculty of Medicine in Pilsen, Charles University, 5Sikl's Institute of Pathology, Faculty of Medicine and Teaching Hospital in Pilsen, Charles University, 6Bioptická Laboratoř s.r.o., 7Department of Cancer Epidemiology, German Cancer Research Center

本文内容

摘要

肝细胞癌切除术后，瘤内边缘及瘤周区域肥大细胞的存在提示预后良好。本研究推荐使用QuPath图像分析软件，作为一种有前景的平台，可满足数字病理学中对可重复性、一致性和准确性的需求。

摘要

所提供的见解 原位 肝细胞癌（HCC）内免疫细胞的检测可能提供有关患者预后的重要信息。针对肿瘤组织内免疫细胞表达与定位的研究面临多项挑战，包括肿瘤区域缺乏精确的标注以及显微视野的随机选择。QuPath 是一款开源且易于使用的软件，可满足数字病理学在全切片图像（WSI）分析中日益增长的需求。

采用免疫组织化学方法，对67例接受根治性切除术的肝细胞癌（HCC）患者代表性标本中CD1a+未成熟树突状细胞（iDCs）、CD117+肥大细胞以及NKp46+自然杀伤细胞（NK细胞）在HCC肿瘤组织及邻近组织中的浸润情况进行评估。通过QuPath软件在全切片图像（WSI）中自动测定肿瘤中心（TC）、内缘（IM）、外缘（OM）及瘤周（PT）区域中阳性染色细胞的面积分数（AF）。进一步评估免疫细胞对复发时间（TTR）、无病生存期（DFS）和总生存期（OS）的预后意义。

在每个感兴趣区域中，肥大细胞的AF显著高于NK细胞，而iDC细胞的AF显著低于NK细胞。在IM和PT区域，肥大细胞较高的AF与更长的无病生存期（DFS）相关。此外，IM区域肥大细胞较高的AF还与更长的总生存期（OS）相关。

使用该软件进行计算机辅助分析，是获取肝细胞癌（HCC）切除术后不同区域肿瘤浸润免疫细胞（iDCs、肥大细胞和NK细胞）预后信息的合适工具。在所有感兴趣区域（ROIs）中，肥大细胞表现出最高的AF值。位于癌旁区域和肿瘤边缘（IM）的肥大细胞具有积极的预后意义。

引言

肿瘤浸润免疫细胞的空间分布和丰度已被证实会影响多种癌症（包括肝细胞癌（HCC））患者的生存率1,2,3,4。肿瘤浸润淋巴细胞的预后意义最初是在苏木精和伊红（H&E）染色切片上发现的5,6。随后，Galon 等人通过免疫组织化学（IHC）开展的一项开创性研究，证明了结肠癌组织中 CD3+ 和 CD8+ T 细胞密度与预后之间的关联4。

免疫组织化学（IHC）是可视化、定量和定位肿瘤组织内免疫细胞的金标准，可用于进一步关联临床结局7。IHC 具有多种优势，例如成本低、普及性高，并且适用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织8。然而，对 IHC 染色的免疫细胞进行准确评估仍是一项重大挑战。在选定的显微镜视野中进行传统评分耗时较长，已不足以确保候选生物标志物筛选和可靠临床相关性分析所必需的高质量、可重复且客观的分析结果9。全切片扫描图像可作为整体图像进行评估，也可在子采样后进行分析10。

对组织样本中免疫细胞丰度进行计算机化定量评估，可确保获得实用、准确、可靠且具有临床相关性的数据11。QuPath 是一款免费的开源软件，可实现对免疫组化染色切片的数字图像分析，并最大限度地提取单个样本中的信息12。

由于未成熟树突状细胞（iDCs）、自然杀伤（NK）细胞和肥大细胞参与抗肿瘤免疫反应，并已被证明与患者的预后相关13,14,15我们在此提供一种逐步操作方案，用于评估CD1a在福尔马林固定石蜡包埋的肝细胞癌组织中的空间分布，并探讨其预后意义。CD1a主要表达于未成熟树突状细胞的细胞膜，其密度与多种人类肿瘤的临床结局相关。16,17肥大细胞在肿瘤微环境（TME）中可能发挥促肿瘤或抗肿瘤作用18它们可支持血管生成并促进转移19相反，有报道称肥大细胞可通过产生IL-4介导肿瘤细胞凋亡。20抗CD117染色常用于在肿瘤组织中可视化和定量肥大细胞21自然杀伤细胞被认为在肝细胞癌的监视和控制中发挥重要作用22 通过杀死癌细胞23NK细胞上NKp46的表达是其抗肿瘤活性的关键参数24然而，NKp46+ NK细胞与肝细胞癌患者肿瘤直径呈正相关25尽管如此，关于它们与患者生存率的相关性仍知之甚少。

本研究旨在定量评估CD1a+未成熟树突状细胞（iDCs）、CD117+肥大细胞和NKp46+自然杀伤细胞（NK细胞）在肝细胞癌（HCC）不同区域的分布丰度，并阐明其预后意义。本研究纳入了70例经病理确诊为I-IV期HCC的连续患者，这些患者均符合巴塞罗那临床肝癌（BCLC）指南中可切除的标准，并于1997年至2019年间在比尔森大学医院接受了根治性肝切除术。研究人员回顾性审查了患者的病理报告。本研究纳入的所有患者均无远处转移，且术前未接受过化疗或放疗等新辅助治疗。其中3例因组织学标本质量不佳被排除，最终共67例患者纳入本研究（表1）。

方案

本方案是根据《赫尔辛基宣言》（2013年版）规定的伦理标准开展的研究的一部分；已获得比尔森医学院和大学医院伦理委员会的批准（批准号：118/2021，2021年3月11日）。图1展示了所采用方法的概要。

1. 选择FFPE组织块

  1. 在治疗医师或病理学家的帮助下，从患者病历中获取石蜡包埋组织块的标识信息。
  2. 向本地病理档案库申请调取石蜡包埋组织块。
  3. 针对每位患者，选择包含可评估肿瘤组织的2-3个石蜡包埋组织块，优先选择含有周围癌旁组织及非肿瘤肝组织的样本。
    注：建议由经验丰富的病理学家参与组织块的筛选。非肿瘤肝组织的组织学评估，结合病史、临床及实验室数据，用于确定肝细胞癌的潜在病因。

2. FFPE 组织的脱蜡和水化

  1. 切取一至两片厚度为4的组织切片 µm 厚度的切片，每个 FFPE 组织块均使用切片机进行切片。
    注意：切片的厚度可在3 µ米和5 µm，无明显染色影响；然而，4 µm 是标准。
  2. 将切片置于水浴（42˚C）以去除皱褶。
  3. 将切片拾取并放置在带正电荷的玻璃载玻片上进行贴附。随后，在常温（AT）下干燥24小时。
  4. 将切片置于恒温箱（56 ˚C）孵育1小时。
  5. 使用自动染色机在脱蜡液-1中对切片进行脱蜡（72℃下30秒） °C），脱蜡液-2（72℃下10秒） °C），脱蜡液-3（室温，10 秒）、96% 乙醇-1（10 秒）、96% 乙醇-2（10 秒）和 96% 乙醇-3（10 秒）。
  6. 使用自动染色机在洗涤液-1（10秒，室温）、洗涤液-2（10秒，室温）和洗涤液-3（5分钟，室温）中对切片进行复水处理。

3. 在全自动染色机中进行免疫组化

注意：免疫组化（IHC）按照制造商提供的说明书进行操作，步骤简要说明如下。

  1. 抗原修复方法
    1. 使用高pH值的抗原修复液（例如Tris-EDTA）通过热诱导表位修复（ER）程序进行抗原修复：修复液-1（10秒，室温），修复液-2（10秒，室温），修复液-3（100 ˚C下20分钟），修复液-4（12分钟，室温）。
    2. 用洗涤液冲洗切片，每次30秒，共3次；再冲洗一次，持续3分钟。
    3. 使用过氧化物酶阻断液在室温下阻断内源性过氧化物酶，时间为5分钟。
    4. 用洗涤液冲洗3次，每次30秒。
    5. 仅针对NKp46，使用蛋白阻断剂在室温下封闭抗体的非特异性结合，时间为30分钟。
  2. 与一抗结合：在室温下与一抗孵育15分钟，然后用洗涤液冲洗3次，每次30秒。
  3. 二抗结合步骤如下。
    1. 在室温下与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育8分钟。
    2. 用洗涤液冲洗2次，每次2分钟，再用去离子水冲洗1次。
    3. 用二氨基联苯胺（DAB）溶液冲洗切片以显色，随后在DAB溶液中室温孵育10分钟。
    4. 用去离子水冲洗3次，每次30秒。
    5. 使用Mayer苏木精对组织切片进行复染。
    6. 用去离子水冲洗1次（30秒），洗涤液冲洗1次（30秒），再用去离子水冲洗1次（30秒）。
    7. 使用全自动切片染色机依次在70%乙醇（2分钟）、80%乙醇（2分钟）、96%-1乙醇（3分钟）、96%-2乙醇（3分钟）、100%乙醇（3分钟）、二甲苯-1（4分钟）、二甲苯-2（4分钟）和二甲苯-3（4分钟）中脱水。
    8. 使用全自动封片机将切片用封片介质封固于载玻片上。
      注：实验全程使用阴性对照和阳性对照（扁桃体）组织样本。

4. 获取全片扫描图像

  1. 使用20倍物镜，以中高密度对焦，在全片扫描仪上扫描染色切片。

5. 使用软件进行免疫组化分析

  1. 在软件中为免疫组化图像创建一个项目。
    1. 下载并打开 QuPath-0.4.3（或更高版本）.exe
    2. 创建一个具有合适名称的新文件夹。
    3. 单击 创建项目 单击软件左上角的按钮，然后选择新创建的文件夹。
    4. 将扫描图像拖入软件窗口。当新窗口自动弹出时，选择 设置图像类型 > H-DAB 并点击 导入 (图2).
    5. 在菜单左侧窗口中查看图像列表，双击以打开图像。
    6. 从顶部的主菜单中选择 文件 至 保存 将图像作为一个项目。
      ​注意：该软件可处理多种图像格式，包括多种全切片图像格式。但建议使用 tiff 格式，以避免原始数据及相关元数据的丢失。
  2. 标注感兴趣区域
    1. 选择 刷子 工具或该 Wand 从顶部主菜单中选择工具以标注肿瘤区域。对于不连续的肿瘤区域，遵循步骤 5.2.1.1–5.2.1.3。
      1. 分别进行标注。
      2. 按住 Ctrl 选择所有肿瘤区域时按住 key
      3. 右键单击并选择 编辑多个 > 合并选定项.
    2. 确保已选择肿瘤标注（边界呈黄色）。
    3. 点击 自动化 在主菜单中并选择 显示脚本编辑器.
    4. 复制可用的脚本 补充文件 1 或访问 https://petebankhead.github.io/qupath/scripts/2018/08/08/three-regions.html 并将其粘贴到 脚本编辑器，然后点击 运行. 感兴趣区域（ROI）：肿瘤中心（TC）、内缘（IM）、外缘（OM）和瘤周区域（PT）将被自动创建并标记。
    5. 如需创建感兴趣区域的替代方法，请遵循步骤 5.2.5.1–5.2.5.5。
      1. 选择 多段线 从顶部主菜单中选择工具，绘制边界以区分恶性细胞巢和相邻的非肿瘤组织。
      2. 选择生成的边界。从顶部的主菜单中选择 对象 > 注释 > 扩展注释 > 500 µm 对于 扩展半径 > 扁平 用于 线端激活 移除内部区域 并激活 约束 返回上级
      3. 右键单击生成的注释， 编辑 单个 > 分割. 两个独立的注释将自动扩展为500 µ边界两侧各 m 宽的区域。
      4. 通过右键单击左侧列表中的标注，选择并适当命名内侧边缘区（IM）和外侧边缘区（OM）的标注区域 设置属性，并输入名称。
      5. TC 代表剩余的肿瘤区域。将 500 µ采用相同方法对紧邻OM的m宽PT区域进行分析。
        注：由专家组织病理学家对标注的切片及QuPath面积分数检测结果进行复核。
  3. 像素分类的优化
    1. 选择 矩形 从主菜单中选择工具。然后标注一个包含所有待区分像素类型（例如苏木精、DAB和背景）的区域。
    2. 从主菜单中选择 分析 > 预处理 > 估计染色向量.
    3. 当窗口 视觉染色编辑器 自动弹出，选择 自动 > 好的，并设置 H- DAB 将估计的名称作为染色向量的名称。
    4. 如需采用替代方法，请执行步骤 5.3.4.1–5.3.4.3。
      1. 选择 矩形 从主菜单中选择工具，并对苏木精染色的典型细胞核的小区域进行标注。
      2. 选择 图像 从左侧菜单中选择并双击 染色1 > 是.
      3. 选择 矩形 从主菜单中选择工具，并用DAB对阳性染色的小区域进行标注。选择 图像 从左侧菜单中选择并双击 染色 2 > 是.
  4. 使用 QuPath 软件评估阳性免疫细胞的面积分数 像素分类 选项
    1. 从主菜单中，单击 分类 > 像素分类 > 创建阈值器.
    2. 选择 高 对于 分辨率 > 通道：DAB > 预滤波：高斯 > Sigma：0.5 > (图3阈值: (0.2-0.3) > 高于阈值：阳性 > 低于阈值：阴性.
    3. 对于该区域，选择 任意注释，输入该 分类器 > 保存 > 测量 > 好的。 DAB阳性细胞将变为红色（图4).
    4. 从左侧菜单复制结果到电子表格中。
    5. 或打开 测量 在上方主菜单中，选择 显示注释测量结果 > 复制到剪贴板，并将结果粘贴到电子表格中。
    6. 要关闭图像，请右键单击 > 多视图 > 关闭查看器
      注意：在定量之前，需去除所有伪影。对于特异性阳性染色较弱的病例，需针对每例调整阈值。标注和像素分类的准确性首先进行交叉核对，随后由资深组织病理学家审核。所有分析均以盲法方式进行。有关使用该软件进行免疫组化分析的更多详情，可参见 https://forum.image.sc/tag/QP.

6. 统计方法与数据分析

  1. 研究终点为复发时间（TTR）、无病生存期（DFS）和总生存期（OS）。未出现复发或死亡的患者在其最后一次随访时进行删失处理。
    注：连续性非正态分布数据以中位数（最小值-最大值）表示。比例以原始数据（百分比）表示。不同感兴趣区域（ROIs）中免疫细胞的面积分数通过Friedman ANOVA进行比较，随后采用带Bonferroni校正的Wilcoxon配对样本检验。由于大多数变量呈非参数分布，采用Spearman相关分析评估有序变量或定量变量之间的关联性。为确定各预测因子对终点事件的预后价值，依次进行单变量和多变量Cox回归分析，并计算风险比（HR）。HR表示中高危组合组相对于低危组（HR=1）的相对风险。所有生存率估计均采用Kaplan-Meier法计算，并通过log-rank检验进行组间比较。统计分析使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software LLC）完成。双侧p值<0.05被认为具有统计学显著性。

结果

患者的基线人口学特征和临床特征见表1。患者中位年龄为69岁，男性占多数（77.6%）。在肝细胞癌（HCC）的病因方面，慢性非病毒性肝炎是最常见的基础疾病，其中以非酒精性脂肪性肝炎（NASH）最为常见，占比为23.9%。仅有15例患者（22.4%）以肝硬化为基础疾病。大多数患者（68.7%）处于TNM I期。更详细的临床和病理学发现已在我们先前发表的研究中进行描述2,26。

结局
在最后一次随访时，29例（41.8%）患者出现肿瘤复发，其中89.7%为局部复发，38例（56.7%）患者已死亡。术后5年，无病生存率（DFS）为33.2%，总生存率（OS）为49.4%，无复发生存率（RFP）为48.7%（表2）。

不同感兴趣区域中免疫细胞的分布
CD117蛋白主要定位于圆形细胞的胞质膜（图5A）。在TC和IM区域，这些细胞主要分布于间质及血管周围间隙。在OM和PT区域，CD117+细胞则见于肿瘤包膜及血管周围间隙。

NKp46蛋白主要存在于TC和IM中类窦状隙内的圆形细胞的胞质膜上，同时也与间质相关。图5B在门管区（OM）和门静脉周围区（PT）区域，NKp46+ 细胞被观察到位于肿瘤巢周围的被膜以及门管区的间质中。

CD1a蛋白在TC和IM区域均有发现，主要位于间质中圆形细胞（散在或成簇分布）的胞质膜上，以及类窦状隙的内部及其边界处（图5C）。在门管区（PT）区域，观察到CD1a阳性树突状细胞位于窦状隙的内部及其边界处，以及门管区胆管上皮内。

肥大细胞的聚集系数（AF）显著高于NKp46+细胞（p < 0.001）（图6）。在每个ROI中，CD1a+ iDCs的AF值较肥大细胞和NK细胞最低（p < 0.001）（图6）。CD117+细胞和NKp46+细胞在TC或IM区域的AF值显著小于PT区域和OM区域（p < 0.001）（图6）。对于CD1a+细胞，不同区域之间的AF值差异无统计学意义。

所有感兴趣区域（ROI）之间单个免疫细胞的显著相关性见表3。图7展示了不同区域中不同免疫细胞之间显著相关性的热图。肿瘤区域（TC）中CD117+肥大细胞的面积分数（AF）与TC及间质区（IM）中CD1a的面积分数（AF）均呈显著相关。

临床和病理学变量的预后价值
在各项临床和病理学变量中，仅较年轻的年龄与较高的复发风险相关（HR = 0.96，CI：0.93–0.99，p = 0.007），而无任何变量与无病生存期（DFS）和总生存期（OS）相关（表4）。

浸润性免疫细胞的预后价值
IM 区域 CD117+ 肥大细胞的 AF 值较高与更长的无病生存期（DFS）相关（HR = 0.48，CI：0.241 - 0.935，p = 0.031）和总生存期（OS）相关（HR = 0.34，CI：0.167 - 0.703，p = 0.004）（图 8，表 5）。此外，PT 区域 CD117+ 肥大细胞的 AF 值较高也与更长的 DFS 相关（HR = 0.48，CI：0.247 - 0.945，p = 0.034）（图 8，表 5）。相比之下，iDC 和 NK 细胞的 AF 值与任何预后均无显著关联。在调整 TNM 分期后，内侧切缘区域的 CD117+ 肥大细胞仍与 DFS（HR = 0.46，CI：0.23-0.91，p = 0.027）和 OS（HR = 0.33，CI：0.16-0.68，p = 0.003）存在显著关联（表 6）。对于 PT 区域的肥大细胞，其与 DFS 的关联在调整后仍保持显著（HR = 0.47，CI：0.24-0.93，p = 0.029）（表 6）。

免疫组化染色工作流程图：石蜡包埋组织制备、切片、载玻片贴附。
图1：方法的代表性示意图。 肝细胞癌（HCC）中肥大细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞预后作用鉴定的工作流程示意图。缩写：FFPE，甲醛固定石蜡包埋；H&E，苏木精和伊红；ROIs，感兴趣区域。请点击此处查看此图的放大版本。

导入 H-DAB 明场显微镜图像的 QuPath 界面，显示文件路径。
图 2：软件窗口截图。 该示意图展示了在软件中将图像导入项目的步骤。请点击此处查看此图的放大版本。

用于图像分析的QuPath软件界面；组织学DAB通道中的阈值设置。
图3：面积分数选项的截图。 软件界面截图，显示用于量化阳性染色面积分数的选定参数。 请点击此处查看此图的放大版本。

显微镜图像对比，显示处理前后组织切片分析结果。
图4：像素分类选项的截图。 软件界面截图，显示DAB阳性细胞在像素分类前后的变化。经过像素分类后，棕褐色的DAB染色被转换为红色。请点击此处查看该图的放大版本。

人组织标志物 CD117、NKp46、CD1a 的组织学分析示意图；显微镜图像。
图 5：肝细胞癌患者固有免疫细胞的代表性免疫染色。 肝细胞癌（HCC）中肿瘤中心（TC，400×）和肿瘤侵袭边缘（TIM，200×）区域（A）CD117+、（B）NKp46+ 和（C）CD1a+ 细胞的代表性免疫染色图像。缩写：HCC，肝细胞癌；TC，肿瘤中心；TIM，肿瘤侵袭边缘，包含内侧边缘（IM）和外侧边缘（OM）。虚线表示肿瘤组织与非肿瘤组织之间的边界。请点击此处查看该图的放大版本。

显示 CD117、NK 和 CD1a 标记物免疫阳性细胞区域分数的点图；统计分析。
图 6：描述肝细胞癌（HCC）患者固有免疫细胞区域分数的统计结果。显示 HCC 组织中肿瘤中心（TC）、内缘（IM）、外缘（OM）和癌旁组织（PT）区域 CD1a+ 树突状细胞、CD117+ 肥大细胞和 NKp46+ 自然杀伤（NK）细胞区域分数的统计结果。黑色线条表示中位数。组间比较采用 Wilcoxon 配对样本检验并进行 Bonferroni 校正。缩写：HCC，肝细胞癌；TC，肿瘤中心；IM，内缘；OM，外缘；PT，癌旁组织。***：p <0.001 请点击此处查看该图的放大版本。

显示TC、IM、OM、PT中CD1a、CD117、NKp46在统计分析中的相关性矩阵。
图7：不同感兴趣区域中肥大细胞、树突状细胞和NK细胞面积分数之间显著相关性的热图。 TC、IM、OM和PT区域中CD117+肥大细胞、CD1a+树突状细胞和NKp46+NK细胞的面积分数之间显著相关性的热图（Spearman ρ，p < 0.05）。缩写：TC，肿瘤中心；IM，内缘；OM，外缘；PT，瘤周区域；DC，树突状细胞；NK，自然杀伤细胞。 请点击此处查看此图的放大版本。

癌症生存分析，Kaplan-Meier 曲线，DFS，OS，CD117 表达，p 值，临床结果。
图 8：肝细胞癌患者肿瘤浸润肥大细胞的 Kaplan-Meier 无病生存期（DFS）与总生存期（OS）曲线。 根据肝细胞癌（HCC）内侧边缘（A，C）和瘤周区域（PT）（B）中肿瘤浸润肥大细胞的低荧光（AF）与高荧光（AF）水平绘制的 DFS 与 OS 的 Kaplan-Meier 分析结果。缩略语：HCC，肝细胞癌；DFS，无病生存期；IM，内侧侵袭边缘；PT，瘤周区域。本图经 Ali 等人许可改编。26 请点击此处查看本图的高清版本。

表1：入组肝细胞癌患者的临床背景。 入组肝细胞癌病例的临床背景。缩写：NAFLD，非酒精性脂肪性肝病。 请点击此处下载该表格。

表2：Kaplan-Meier分析中各结局事件的估计概率。 Kaplan-Meier分析中无复发生存率（RFP）、无病生存率（DFS）和总生存率（OS）的估计概率。缩写：RFP，无复发生存率；DFS，无病生存；OS，总生存。 请点击此处下载该表格。

表3：不同感兴趣区域中肿瘤浸润肥大细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞面积分数之间的相关性。 不同感兴趣区域（ROIs）中肿瘤浸润肥大细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞面积分数之间的Spearman相关性（ρ），p < 0.038。缩写：TC，肿瘤中心；IM，内缘；OM，外缘；PT，瘤周区域；ROIs，感兴趣区域。 请点击此处下载该表格。

表4：与复发时间（TTR）、无病生存期（DFS）和总生存期（OS）相关的临床和病理变量的单变量分析。“否”、女性性别或“A”为二分类变量的参照类别。加粗数值表示在 p < 0.05 水平上具有统计学意义。缩写：HR，风险比；CI，置信区间；TTR，复发时间；DFS，无病生存期。请点击此处下载该表格。

表5：使用Cox回归分析CD117+肥大细胞、CD1a+树突状细胞和NKp46+自然杀伤细胞的面积分数与67例肝细胞癌患者每个感兴趣区域的TTR、DFS和OS之间的关联（单变量分析）。 每个组织区域中免疫细胞的面积分数（mm²）被转换为百分位数，并分为低（0–25百分位数）和高（25–100百分位数）两组。风险比（HR）表示相对于低面积分数组（AF）的风险倍数。加粗数值表示在p < 0.05水平具有统计学显著性。缩写：AF，面积分数；DFS，无病生存期；OS，总生存期；HR，风险比。 请点击此处下载该表格。

表6：各ROI中CD117+肥大细胞面积分数与无病生存期和总生存期的关联（多变量分析）。 采用Cox回归模型对67例HCC患者瘤内（IM）和瘤周（PT）区域CD117+肥大细胞面积分数与DFS及OS的关联进行多变量分析。每单位面积（mm2）免疫细胞的面积分数被转换为百分位数，并分为低（0–24百分位）与高（25–100百分位）两组。风险比（HR）表示相对于低面积分数组（AF）的风险倍数。加粗数值表示在p > 0.05水平具有统计学意义。缩写：AF，面积分数；DFS，无病生存期；OS，总生存期；HR，风险比。请点击此处下载该表格。

补充文件 1：创建感兴趣区域（ROI）的脚本。 请点击此处下载该文件。

讨论

通过监测 原位 TME 中的免疫组织结构，肿瘤免疫学领域可以增加新的癌症预后和预测性生物标志物。我们先前发表的关于适应性免疫细胞在肝细胞癌 TME 中作用的论文表明，在选定的 ROI 中，CD3+ 和 CD8+ T 细胞以及 CD20+ B 细胞与复发时间呈正向预后关联2在此，使用图像分析软件 QuPath 评估了 HCC 多个不同区域中 CD1a+ 未成熟树突状细胞（iDCs）、CD117+ 肥大细胞和 NKp46+ 自然杀伤细胞（NK 细胞）的丰度，并分析了其预后意义。由于部分固有免疫细胞形态不规则，其定量结果可能不准确，因此评估免疫阳性细胞的面积分数（AF）成为最优选择。在上述三种细胞类型中，仅有 CD117+ 肥大细胞显示出显著的预后影响：间质（IM）区域和肿瘤周边（PT）区域中肥大细胞的较高面积分数与更长的生存期相关。

在所有感兴趣区域（ROIs）中，肥大细胞数量最为丰富，其在肿瘤周围区域和内侧边缘的绝对丰度（AF）与较好的生存率相关，反映了肥大细胞的抗肿瘤作用。肿瘤细胞释放的趋化因子（如SCF或CCL15）可将肥大细胞招募至肿瘤微环境（TME）中18。肥大细胞可通过直接杀伤肿瘤细胞27，或通过分泌促炎性细胞因子抑制肿瘤生长18，从而影响抗肿瘤免疫应答。肥大细胞密度增加对前列腺癌28、胃癌27以及肝移植后肝细胞癌（HCC）的复发具有保护作用29。一项纳入245例HCC患者的大型队列研究发现，肿瘤组织中肥大细胞浸润程度越高，肿瘤切除术后生存期越长30。Rohr-Udilova等报道了HCC周围组织中肥大细胞密度升高的类似结果；然而，仅肿瘤内肥大细胞密度与较低的复发率相关29。

在本研究中，肥大细胞仅在IM和PT肝脏中表现出抗肿瘤效应。不同肿瘤的肿瘤微环境（TME）在免疫细胞的空间分布方面具有异质性31。免疫细胞在TME中的预后意义也与其空间分布密切相关32,33。针对肿瘤侵袭边缘的标注已提出多种方法，包括不同宽度的完整边缘4,34,35、内侧和外侧边缘（宽度亦各不相同）36,37，以及包含或不包含PT的方法2,7。我们采用了国际肿瘤免疫生物标志物工作组提出的可重复、标准化的方法，将侵袭边缘定义为以恶性细胞巢与宿主组织交界处为中心、宽1 mm的区域，并将中心肿瘤定义为其余的肿瘤区域38。由于先前的研究强调了内侧与外侧侵袭边缘在结果上存在显著差异2，因此这两个区域（每个宽500 µm）被分别分析。肿瘤周围区域的空间免疫谱具有独特的预测价值39,40，因此本研究也纳入了PT区域。

对肿瘤实质（TC）、肿瘤边缘和癌旁肝组织（PT liver）的分析是在全切片图像（WSIs）上进行的，而不是选择性地评估相应区域的若干视野。全切片成像是一种潜在的丰富数据来源41。由于我们未进行亚抽样，因此以高效的方式获得了"真实期望值"10。此外，该系统具有合理性，因为每个组织块仅分析1至2张切片，从而避免了图像区域选择带来的偏倚42。在之前的研究中，当采用体视学方法对免疫细胞进行定量时，其缓慢的工作流程曾给我们带来挑战2。

免疫组织化学（IHC）可直接定位肝组织中CD1a+ 未成熟树突状细胞（iDCs）、NKp46+ 自然杀伤细胞（NK）和CD117+ 肥大细胞的表达，量化其分布情况，从而实现对研究队列的亚组分类。相较于对溶解组织进行的生化检测，IHC分析具有重要优势：当仅有少量生物标志物阳性细胞存在时，生化检测可能产生假阴性结果43，且无法反映免疫细胞对组织病理学特征的区域性反应44。此外，IHC也优于苏木精-伊红（H&E）染色切片的分析。结直肠癌和小细胞肺癌的研究表明，H&E染色切片的评估可提供稳健且定量的肿瘤-免疫生物标志物45,46,47；然而，其在准确反映特定亚型细胞实际存在方面的局限性仍然存在。

高质量的组织切片和免疫组化染色是准确评估的前提。高背景染色、边缘伪影以及特异性但不期望的染色（例如，抗CD4抗体对肝窦内皮细胞的染色）可能会干扰所有结果。在本研究中，最初选择CD56抗体来检测自然杀伤细胞，但由于CD56在未成熟胆管中的表达，最终改用NKp46抗体。选择具有最佳特异性、稳定染色模式以及在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块中稳定表达的标记物是另一个需要考虑的问题。例如，选择CD117而非类胰蛋白酶，因为类胰蛋白酶的表达可能显著下调，此外，不表达CD117的细胞不属于肥大细胞48。

QuPath 提供了从外部平滑 ROI 边界并去除不应包含在 ROI 中的伪影、大血管、坏死组织、非特异性染色、背景以及红细胞聚集的选项。操作者需要选中 ROI，并在标注这些伪影时按住 "Alt" 键。在本研究中，非特异性染色在定量分析前已被作为伪影予以消除，以避免影响结果。如果出现系统性的特异性染色偏低或背景过高的情况，应重新审查实验方案，以避免可能的偏差。对于特异性阳性染色较弱的每个样本，需调整阈值。在常规使用前，应先对方案进行优化。所有分析均应以盲法进行，理想情况下，阈值设定的准确性应经过交叉验证。

QuPath 是一种用户友好、直观、可扩展的开源数字病理学和全切片图像分析解决方案9，此前已用于肝细胞癌（HCC）49 及多种癌症的图像分析50,51。该软件在全切片图像（WSI）上的操作简便，且提供对感兴趣区域（如肿瘤区域或瘤周区域）进行标注的多种选项，是其主要优势。

现有、改良或新开发方法的应用 从头合成 创建的脚本可显著加快分析速度。应用了用于为感兴趣区域（ROI）生成注释的脚本，从而实现了快速且准确的区域分割，取代了手动勾画。该脚本并非固定不变，可根据需要轻松定制，适用于组织边界不充分的区域，其边缘范围可设置为小于500 µm。IM、OM或PT区域的宽度可通过脚本自定义 自动化 > 显示脚本编辑器 > 调整第30行 双扩展边缘微米 = 500 µm 至可用宽度 > 运行. 可以添加或删除感兴趣区域（ROI）。通常情况下，软件中的工作流程并非固定不变，操作者可自由开发和修改工作流程。

目前已有大量可用于病理图像分析的软件工具，包括 CellProfiler、ImageJ、Fiji、Microscopy Image Browser 等。然而，QuPath 凭借其开源架构、用户友好的界面、算法自定义能力以及集成先进机器学习工具等优势脱颖而出。这些特性共同使该图像分析软件成为数字病理学领域中对癌症组织进行精细分析的强有力选择。

在检测乳腺癌中Ki67表达时，QuPath的变异性低于商业软件HALO（IndicaLab）和QuantCenter（3DHistech）52。该软件还具备按可重复的批处理方式，对项目中所有图像运行脚本指令的潜力。

QuPath 使我们能够生成定量的连续数据，而非等级（半定量）数据。通过视觉评分获得的等级数据由于解释上的主观性、观察者间的差异以及可重复性差而存在诸多问题53。当前分析的高效性得以提升，原因在于即使不具备深厚组织病理学背景和编程专业知识的人员也可执行自动分析，前提是病理学家对标注的准确性进行了核查。一项关于头颈部肿瘤的研究证明了 QuPath 适用于快速且可重复地评估 CD57+ 肿瘤浸润淋巴细胞的预后价值50。该研究还显示，人工观察者与 QuPath 之间具有高度一致性。在口腔癌54和乳腺癌55中，也已报道了人工观察与 QuPath 评估之间具有高度一致性。前述研究比较了使用 QuPath、两种商业软件（Definiens Tissue Studio 和 inForm）对5种临床乳腺癌生物标志物进行免疫组化定量的结果，并与病理学家的手动评分进行了对比。在整个研究过程中，QuPath 始终表现出最佳性能，且设置和应用所需时间最少，因而显示出作为视觉监测和商业软件的优秀未来替代方案的潜力。即使与最知名的开源生物医学图像分析软件 ImageJ 相比，QuPath 在处理大尺寸全切片图像（WSIs）方面也更具优势56。

QuPath 拥有一个开放的在线论坛，用户可以在其中提出关于数字病理学方法的问题，并积极参与和支持图像分析工具开发的活跃社区（https://forum.image.sc/tag/qupath）。

本研究中使用的队列具有独特性，不能代表总体肝细胞癌（HCC）人群，因为该队列仅包含符合肝切除术指征的患者。通常，仅有少数HCC患者（20%-30%）适合接受肝切除术57。这可能也是确诊肝硬化患者比例较低的原因之一，因为此类病因的HCC患者可能Child-Pugh评分较高，因而被认为不适合手术切除。此外，该队列样本量较小，且大多数患者处于疾病的早期TNM分期。因此，将本研究结果外推至其他人群时应谨慎。

在本研究中，通过评估先天免疫细胞的面积分数（AF）来估算肝细胞癌（HCC）微环境中这些细胞的丰度，因为对树突状细胞等不规则形态的免疫细胞进行精确计数可能较为困难。另一方面，免疫细胞的面积分数通常与其密度高度相关58。免疫过氧化物酶标记可提供抗原定位、表达该抗原的细胞面积分数或密度的信息，但染色强度与抗原含量之间呈非线性关系。因此，免疫组织化学（IHC）不应用于定量评估特定蛋白的表达水平。该方法的准确性还依赖于切片厚度的均一性、图像质量以及用于像素分类的分辨率选择。任何图像分析结果均应经过验证并谨慎对待。由于单一标记物无法全面反映免疫细胞的复杂性，需要更多IHC标记物及多重染色技术，以获得HCC免疫微环境（TME）的可靠图景。仅使用单一IHC标记物对免疫细胞进行表型分析仅为一种近似方法，结果应谨慎解读。

使用QuPath图像分析软件评估免疫组化染色切片，使我们能够分析肝细胞癌患者肿瘤组织及癌旁组织中局部未成熟树突状细胞（iDCs）、肥大细胞和自然杀伤细胞（NKs）的分布情况和面积比例，并进一步研究其与预后的关系。肝细胞癌内边缘区及癌旁肝组织中肥大细胞的丰度与更长的无病生存期（DFS）和总生存期（OS）相关，凸显了这些固有免疫细胞的抗肿瘤作用。QuPath的分析工作流程操作简便、快速高效，具有实用的默认设置和便捷的数据导出功能。该软件已被认可为一种有前景的数字图像分析平台，能够满足数字病理学在可重复性、一致性和准确性方面的需求。

披露

不存在需要披露的经济利益冲突。

致谢

我们感谢查理大学理学院Vinicna显微成像中心的Mgr. Ondřej Šebesta在全片扫描方面所做的贡献，以及项目"e-Infrastruktura CZ"（e-INFRA LM2018140）为我们本研究提供的计算资源。感谢技术人员Jana Dosoudilova和Jan Javurek提供的出色技术协助。 本研究由欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助号N°856620）、捷克共和国卫生部（资助号AZV NU21-03-00506）以及合作计划（外科领域）资助。Vinicna显微成像中心还获得了捷克生物成像大型研究基础设施项目LM2023050的共同资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗CD1aLeica BiosystemsPA0235标志物-未成熟树突状细胞；即用型，方案F，ER2/20分钟
抗CD117Leica Biosystems PA0007标志物-肥大细胞；即用型，方案F，ER2/20分钟
BOND Plus 显微镜载玻片Leica Biosystems，德国S21.2113.A
BOND RXmLeica Biosystems49.1501全自动免疫组化染色仪  
Bond 吸液探针清洗试剂盒Leica BiosystemsCS9100
Bond 脱蜡液 Leica BiosystemsAR9222
Bond 聚合物增强检测试剂盒Leica BiosystemsDS9800
BondTM 抗原修复液2Leica BiosystemsAR9640
BondTM 一抗稀释液Leica BiosystemsAR9352
BondTM 洗涤液 10倍浓缩液Leica BiosystemsAR9590
计算机配置：Intel(R) Core(TM) i5-10500 CPU @ 3.10GHz   3.10 GHz，安装内存：128 GIntel64位操作系统，需安装Windows 7。任何配备基于Java的操作系统并可运行Excel的计算机
盖玻片Leica Biosystems，德国14071135636
CV MountLeica Biosystems，德国14046430011
CV5030 全自动玻璃盖玻片机Leica Biosystems149CVTS5025
干燥烘箱 UN30Memmert GmbH UN30
GraphPad Prism 9.0GraphPad Software LLC 版本 12
人NKp46/NCR1抗体，单克隆小鼠IgG2B克隆# 195314R&D Systems, Inc.，美国MAB1850标志物-自然杀伤细胞；稀释比例1:150，方案F + BLOK，ER2/20分钟
Leica HI1210 - 水浴锅Leica Biosystems14041521466
蛋白封闭剂Agilent Dako，美国X0909
QuPath 0.3.2 或更高版本 版本（QuPath v.0.3.2） 
RM2235 旋转式切片机Leica Biosystems149AUTO00C1
ST5020 多功能载玻片染色机Leica BiosystemsDEV-ST5010-CV5030
StatisticaStatSoft Inc.版本 7
Zeiss Axio Scan.Z1ScienceServices GmbH，德国430038-9000-000 切片扫描仪 

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肿瘤微环境QuPath 软件免疫细胞浸润数字病理学免疫组织化学分析CD117 肥大细胞肿瘤预后全切片成像
肝细胞癌微环境中肥大细胞预示良好预后：一项基于QuPath图像分析软件的回顾性研究
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