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方法文章

通过磁激活细胞分选法从新鲜灌注的成年小鼠脑组织中分离下丘脑小胶质细胞

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DOI：

10.3791/66769

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2024年9月6日

 ,  ,  , 
1University of Bordeaux, INSERM, Neurocentre Magendie

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了一种利用磁珠激活细胞分选（MACS）技术从小鼠下丘脑（或类似的较小脑区结构）中快速分离小胶质细胞的实验方案。经MACS分选获得的下丘脑小胶质细胞可用于 离体 分析并可接种培养以进行 体外 检测方法

摘要

小胶质细胞作为脑内的常驻巨噬细胞，在维持脑内稳态中起着至关重要的作用。它们在发育过程中塑造神经元回路，持续监测周围环境中的碎片或死亡细胞，并对脑内的感染和损伤作出反应，还具有多种其他功能。然而，小胶质细胞在神经发育、突触可塑性以及病理生理过程中的重要作用尚未完全阐明，这凸显了进一步研究的必要性。为了更全面地理解小胶质细胞在这些过程中的作用，我们需要分离小胶质细胞，并从遗传学、代谢和功能层面对其进行表征。然而，从小鼠成年脑组织（尤其是从小型脑区）中分离小胶质细胞具有挑战性，因为它们仅占脑细胞总数的一小部分，且分离所得的小胶质细胞产量通常过低。本文介绍的方法利用CD11b+磁珠进行磁性分离，可从小鼠成年脑（经新鲜灌注后）的下丘脑中分离小胶质细胞。该方法可在短时间内获得相对较高的纯度和产量，同时保持细胞活性。

引言

小胶质细胞占全部神经细胞的5-20%，是唯一起源于卵黄囊中红髓样前体细胞的胶质细胞，约在胚胎第9.5天开始定植于发育中的大脑。1,2它们是寿命较长的细胞，能够缓慢地进行自我更新，且独立于骨髓来源的细胞3作为动态性极高的细胞类型之一，它们能够根据所处环境和外界信号的提示获得多种不同的表型2,4在能够调节小胶质细胞活性的信号中，中枢神经系统（CNS）损伤、神经元活动以及营养物质的作用最为显著。越来越多的研究表明，小胶质细胞在损伤、神经退行性疾病和肥胖中发挥着关键作用2,5,6然而，小胶质细胞在生理过程和病理生理学中的确切作用仍需进一步研究。因此，明确其在不同条件下的转录、代谢及功能特征具有重要意义，而这需要首先分离小胶质细胞，因为 原位 适用于DNA、RNA和蛋白质的定位及定性比较，以及小胶质细胞的形态学表征。

已有多种方法用于小胶质细胞的分离，其中包括Percoll梯度法7、流式细胞术分选（FACS）8以及磁珠激活细胞分选（MACS）。具体方法的选择取决于研究目的以及下游应用对纯度的要求。从成年小鼠脑组织中分离高纯度的小胶质细胞尤其具有挑战性，特别是当目标脑区为下丘脑等较小结构时，其小胶质细胞数量十分有限。利用Miltenyi技术对下丘脑进行自动化温和解离，可在较短时间内获得相对较高的小胶质细胞得率，并可使用gentleMACS Octo解离仪同时处理多达八个样本。

组织匀浆后，采用基于MACS柱技术和超顺磁性纳米级CD11b+磁珠进行小胶质细胞纯化。因此，所有样本均以完全相同的方式处理，从而获得完整的CD11b+细胞。值得注意的是，CD11b并非小胶质细胞所特有，其他髓系细胞（包括巨噬细胞和单核细胞）也表达该标记物9。为减少这一干扰，在下丘脑提取前用冰冻生理盐水灌注脑组织（见实验方案步骤2.6），可有效清除大多数髓系细胞，仅残留少量定居型巨噬细胞或黏附于血管壁的巨噬细胞。在健康稳态中枢神经系统中，定居型巨噬细胞和单核细胞仅占脑内免疫细胞总数的很小比例（分别约为10%和<2%）10,11。因此，当使用CD11b+磁珠分选脑细胞时，虽可同时分离出小胶质细胞和巨噬细胞，但绝大多数为小胶质细胞。

小胶质细胞的终末产量及其活力的维持使我们能够进行 离体 以及 体外 检测方法，其优势在于能够分析特定的感兴趣脑区。最新研究表明，小胶质细胞群体具有高度异质性，表现出与脑区特异性相关的基因表达、形态特征及功能差异2,12,13因此，本实验方案旨在以区域特异性的方式分离和分析成年小胶质细胞。事实上，我们可以利用RT-qPCR和RNA测序等方法对成年下丘脑小胶质细胞的遗传、转录和翻译谱进行表征，并开展 体外 功能分析

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方案

所描述的所有动物实验均严格遵守欧盟建议（2013/63/EU），并经波尔多大学当地伦理委员会（CEEA50）以及法国高等教育、研究与创新部批准（批准项目的非技术性摘要NTS-FR-619193 v.1，2022年12月23日）。

以下实验方案适用于平均年龄为2-4个月的成年C57BL/6小鼠。然而，该方案也可用于所有年龄段和不同状态的小鼠，但需注意中枢神经系统（CNS）的免疫细胞组成可能发生变化，常驻巨噬细胞和单核细胞的比例可能增加（例如在衰老和神经退行性疾病中）。

1. 溶液的配制

注意：以下体积和溶液严格适用于Cd11b+细胞的分离。

  1. 根据样本数量确定所需 D-PBS/0.5% 牛血清白蛋白（BSA）的总体积。使用市售的含钙和镁的 D-PBS 以及 BSA 粉末配制溶液（参见材料表）。
  2. 准备标记好的解离管（C-Tubes），每管加入 1,900 µL 成人脑组织解离试剂盒中提供的缓冲液 Z（参见材料表）。将酶溶液解冻并置于冰上，同时将后续步骤所需的所有缓冲液也置于冰上。
  3. 为灌注步骤（步骤 2.6）准备适量的 1x 磷酸盐缓冲盐水（PBS）并置于冰上（参见材料表）。每只动物按 10 mL 计算，并额外增加 10%。
  4. 对于 RT-qPCR 分析，按每个样本准备 qPCR 缓冲液：使用市售 RNA 纯化试剂盒（参见材料表），将 2.5 µL 巯基甘油与 250 µL 裂解缓冲液混合。
  5. 对于蛋白质定量，将磷酸酶抑制剂混合液和蛋白酶抑制剂混合液按 1:100 的比例稀释于哺乳动物提取缓冲液中，配制裂解缓冲液（参见材料表）。
  6. 对于活性氧（ROS）检测和吞噬作用分析，使用市售的 10x HBSS 配制 1x HBSS（参见材料表），然后向 1x HBSS 中添加 0.2% BSA 以制备 FACS 缓冲液。

2. 脑组织的取出

  1. 使用剂量为 20 mg/kg 的赛拉嗪对动物进行镇静；然后，使用 400 mg/kg 的戊巴比妥钠过量注射处死小鼠，并将其仰卧置于解剖托盘中。
    注意：其他麻醉组合也可用于处死动物。
  2. 用 10 mL 冰冷的 1× PBS 填充 10 mL 注射器，并连接至 21 G 蝶形针头。
  3. 当小鼠完全麻醉（通过捏压足爪确认无反应）、呼吸停止且心脏处于纤维性颤动时，用镊子提起皮肤，用剪刀在最后肋骨与胸骨交界处打开胸腔。
  4. 用剪刀沿肋骨两侧向上作深部切口，暴露心脏。
  5. 将 21 G 针头插入左心室远端（确保约 1/3 的针头进入心室），并立即用剪刀剪开右心房。
  6. 注入 10 mL 冰冷的 1× PBS，以清除脑内循环的免疫细胞。
    注意：需肉眼检查脑组织，确保其清洁且灌注良好。
  7. 切断小鼠头部，小心取出脑组织，置于装有冰块并覆盖铝箔的培养皿中。
    注意：培养皿和铝箔有助于观察脑组织切片。在切割脑组织过程中保持低温环境有利于限制代谢活动。
  8. 使用镊子分离下丘脑，并用刀片将其切成小块。
    1. 为识别和分离下丘脑，将脑组织倒置，使皮层朝下，下丘脑在背侧表面可见。使用弯头镊子分离位于脑底部第三脑室两侧的下丘脑。成年 C57BL/6 小鼠下丘脑的平均重量为 15 mg。
      注意：脑组织切片应尽可能小（<0.5 mm）。切成小块是关键步骤，因其有助于更好的组织解离并提高细胞得率。
  9. 将下丘脑组织块收集至预先加入 1,900 µL 解离缓冲液 Z（步骤 1.2）的解离管（C-Tubes）中。
    注意：为获得足够用于检测的较高得率的小胶质细胞，每管至少合并两个（用于蛋白质定量）或三个（用于 qPCR 和 RNA-seq）下丘脑组织。

3. 组织解离

注意：所有步骤均须在冰上进行。任何步骤中均不得涡旋细胞悬液，仅需使用 1,000 µL 移液器小心混匀。

  1. 根据表1配制酶混合液2（计算所有管所需的总体积，并额外增加10% ）。 在每个C管中加入50 µL含于混合液1中的酶（见表1）以及30 µL酶混合液2。所有酶均来自成年动物脑组织解离试剂盒（见材料表）。
  2. 盖紧C管，按照制造商说明将其倒置放入解离仪中并安装加热支架，运行程序37C_ABDK_02。
  3. 准备15 mL snap管（见材料表），并在其上方放置70 µm滤器。用2 mL D-PBS润湿滤器。
  4. 当解离/消化程序完成后，将C管内容物倒入滤器中，并用200 µL枪头轻轻刮擦，以促进细胞过滤、减少组织匀浆在滤器上的黏附，从而降低细胞损失。
  5. 用2次各5 mL的D-PBS洗涤C管，每次洗涤液均倒入滤器中，并在两次洗涤之间用200 µL枪头轻轻刮擦滤器。
  6. 在4 °C条件下以300 × g离心10分钟，彻底吸除上清液。根据表1，用适量的冷D-PBS轻柔重悬细胞沉淀。
  7. 立即轻柔混匀450 µL密度梯度试剂（去碎片溶液，见材料表），然后非常轻柔地叠加2 mL冷D-PBS（见表1）。
    注意：为形成不同的密度梯度层，必须使用1 mL移液器逐滴缓慢叠加D-PBS，每次叠加1 mL，尽可能减少"扰动"。
  8. 在4 °C条件下以3,000 × g离心10分钟，离心过程中使用慢加速和慢减速（若最大值为9，则设定为5）。
  9. 离心后形成三层相。彻底吸除最上两层并弃去，注意不要吸到最底层的第三相。
  10. 加入1800 µL冷D-PBS，轻柔地上下颠倒混匀3次。
  11. 在4 °C条件下以1,000 × g离心10分钟，使用全速加速和全速刹车，彻底吸除上清液。用2 mL D-PBS/BSA缓慢吹打，轻柔重悬细胞沉淀。

4. CD11b+ 细胞的磁分离

  1. 在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 10 分钟，彻底吸弃上清液。用 90 µL D-PBS/BSA 缓冲液小心重悬细胞沉淀。
  2. 加入 10 µL CD11b-磁珠混合液，并用移液器充分混匀。
  3. 在冰箱中 2–8 °C 条件下孵育 15 分钟，切勿使用冰浴；加入 1 mL D-PBS/BSA 洗涤细胞，并在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 10 分钟；彻底吸弃上清液。用 500 µL D-PBS/BSA 小心重悬细胞。
  4. 根据屏幕提示启动分离器上的 POSSEL2 程序。将小型柱（见材料表）置于磁场中。
    注：可根据预期的平均细胞数量选择小型或大型柱用于磁性细胞分选。小型柱最多可处理 1 × 107 个标记细胞，大型柱最多可处理 1 × 108 个。在从小型组织（如下丘脑）中分离细胞时，建议使用小型柱。使用大型柱时，试剂体积有所不同（参见制造商说明书）。
  5. 用 500 µL D-PBS/BSA 湿润柱子（见材料表）。若需进一步分析细胞的阴性组分（CD11b-），则在柱子下方放置收集板，然后将细胞悬液加入柱中。
  6. 每次向柱中加入 500 µL D-PBS/BSA，重复洗涤三次，每次均需等待缓冲液完全通过柱体。
    注：必须防止柱子上部干燥，因此不建议等到所有缓冲液完全流尽后再进行下一步操作。
  7. 将收集板各孔中流出的全部 CD11b- 组分转移至 15 mL 离心管中。
  8. 从分离器上取下柱子，将其置于 5 mL 管上，用移液器向柱中加入 1 mL D-PBS/BSA。
  9. 立即用力推动随柱附带的活塞，快速冲洗出磁性标记的细胞组分。
  10. 最后，使用血细胞计数板或其他方法计数 CD11b+ 细胞；预期每下丘脑可获得约 15,000 个细胞。
  11. 在 4 °C 条件下以 300 ×g 离心细胞悬液 10 分钟，弃去上清液。

5. 分析

  1. 进行RT-qPCR分析时，用qPCR缓冲液（配制方法见步骤1.3）重悬细胞沉淀，并将离心管储存于-80 °C，直至进行mRNA提取。提取总RNA后，按照MIQE指南14进行后续处理与分析。最后，合成cDNA并使用RT-PCR仪进行qPCR。所有商用试剂盒详见材料表。
  2. 进行蛋白质定量时，用D-PBS（不含BSA）至少洗涤细胞沉淀2次，以去除BSA。然后，用20 µL裂解缓冲液重悬两个下丘脑来源的细胞沉淀。使用蛋白定量试剂盒进行蛋白质浓度测定（见材料表）。
    注：我们依据生产商说明书15进行蛋白质定量，以开展丝氨酸/苏氨酸激酶活性检测。
  3. 检测小胶质细胞中活性氧（ROS）时，将细胞沉淀重悬于1x HBSS中。按照流式细胞术检测试剂盒的生产商操作说明处理细胞（见材料表）。然后，将处理后的细胞重悬于200 µL FACS缓冲液（配制方法见步骤1.5），并通过流式细胞术（FACS）检测氧化应激细胞。
  4. 进行吞噬作用检测时，将分选后的细胞与荧光乳胶微珠（见材料表）在D-PBS/BSA中孵育30分钟。调整微珠数量，使平均每细胞结合4个微珠。随后在4 °C下以300 × g离心7分钟，重悬于200 µL FACS缓冲液中，并通过流式细胞术（FACS）检测荧光发射信号（λex 575 nm；λem 610 nm）。

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结果

终末产量的评估依赖于分离细胞的纯度和数量，可通过RT-qPCR、细胞计数和蛋白质定量来确定。下丘脑分离磁性细胞的纯度通过RT-qPCR检测CD11b、C1qa、Gad1和GFAP的基因表达水平予以确认图1）。CD11b 和 C1qa 在稳态中枢神经系统中主要由小胶质细胞表达16 Gad1 和 GFAP 分别作为神经元和星形胶质细胞的标记物。一个下丘脑组织提取的总 cDNA 量在 55 至 98 ng 之间。值得注意的是，只有阳性组分表达 CD11b 和 C1qa，表明阴性组分中不存在小胶质细胞的潜在丢失。引物序列见于 表2.

此外，神经元和星形胶质细胞标志物的极低表达水平表明，所分离的细胞绝大多数为小胶质细胞，因为常驻巨噬细胞和单核细胞仅占健康脑组织中全部免疫细胞的10%10,11这些结果证实了磁性分选的有效性，并为应用RT-...

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讨论

本方案介绍了通过磁激活细胞分选法从新鲜灌注的成年小鼠脑组织中分离下丘脑小胶质细胞的方法。上述结果证实了所分离细胞的纯度和活性，以及该方法在小胶质细胞功能表征方面的有效性 离体例如通过吞噬活性和ROS产生的定量分析。用于分离特定细胞群体的经典方法也可用于小胶质细胞的分离。密度梯度离心是一种根据细胞及其颗粒的大小和/或密度对其进行分离的常用技术，该技术可用于原代小胶质细胞的分离与培养。然而，成年小胶质细胞的纯化还需要对分离得到的脑细胞进一步采用荧光激活或免疫磁珠细胞分选技术进行分选。

具体而言，FACS 依赖于荧光标记的生化抗体来标记细胞，并根据多种变量（包括细胞大小和代谢状态等，远不止表面标志物）对细胞进行区分。然而，细胞纯化过程可能较慢，且操作不够温和，会增加死细胞数量，同时需要较高的初始得率。因此，下丘脑小胶质细胞数量较少本身已构成限制因素。MACS 则利用与特定细胞表位抗体偶联的磁珠，可在初始得率较低的情况下进行操作，有利于开展区域特异性的微胶质细胞动态研究。由于磁珠具有强磁性，所需标记量极少，因此相比 FACS 更为温和，可有效维持细胞完整性。此外，当需要同...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

AN 获得了法国大学研究院（IUF）、波尔多大学、法国脑科学研究基金会（FRC）、脂质与营养研究组（GLN）以及法国国家科研署（ANR，项目号 PRC 2023-MicroNRJ）的支持。CA 获得了法国医学研究基金会（FRM-ARF201809006962）的支持。本项目获得了欧盟“地平线欧洲”研究与创新计划下 MSCA 博士生网络项目（2021 年）的资助，项目编号为 101072759（FuElThEbRaiNIn：健康衰老与年龄相关疾病中的脑功能与能量代谢，ETERNITY）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
成年动物脑组织解离试剂盒Miltenyi130-107-677该试剂盒包含缓冲液 Z、缓冲液 Y、酶 A 和酶 P、去碎片溶液以及用于溶解酶 A 的缓冲液 A。
牛血清白蛋白 FrV BSAEuroMedex04-100-812-C
CD11b（小胶质细胞）微珠，适用于人和小鼠——小粒径Miltenyi130-093-636
CellROX Green 流式细胞术检测试剂盒InvitrogenC10492
15 mL 带 snap-pop 盖的离心管CellTreat978449
含钙、镁、葡萄糖和丙酮酸的 DPBSGibco14287-072
gentleMACS C 管Miltenyi130-093-237
带加热模块的 gentleMACS Octo 组织解离仪Miltenyi130-096-427
Halt 磷酸酶抑制剂混合液（100 倍浓缩）Thermofisher78420
Halt 蛋白酶抑制剂混合液，无 EDTA（100 倍浓缩）Thermofisher78437
HBSS（10 倍浓缩），含钙、镁，不含酚红Thermofisher14065056
羧基修饰的聚苯乙烯荧光红乳胶微球Sigma-AldrichL3280
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche 4707516001该试剂用于进行 PCR 实验。 
MACS SmartStrainer 过滤筛（70 µm）Miltenyi130-110-916
Micro BCA 蛋白定量检测试剂盒Thermofisher23235
M-PER 哺乳动物蛋白提取缓冲液Thermofisher78503
MS 柱Miltenyi130-042-201在实验方案中称为小柱。 
MultiMACS Cell24 分选器 PlusMiltenyi130-098-637
PBSS，pH 7.4 Thermofisher10010023
qScript XLT cDNA 超级混合液Quanta biosciences733-1177该试剂盒用于合成 cDNA。
ReliaPrep RNA 快速提取系统PromegaZ6011该试剂盒包含 1-巯基甘油和 BL 缓冲液（在实验方案中称为裂解缓冲液），用于提取总 RNA。
Vacutainer 安全锁针头，21 GBecton Dickinson367282

参考文献

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