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方法文章

通过雨蛙素与脂多糖腹腔注射联合制备小鼠重症急性胰腺炎模型

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DOI：

10.3791/66780

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2024年5月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology, 2Medical College of Anhui University of Science & Technology, 3Endocrinology Department, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology, 4Department of Hepatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

腹腔内给药是一种安全有效的非侵入性方法，可用于诱导胰腺损伤。本研究比较了五种不同的小鼠腹腔注射方案，以诱导不同程度的胰腺损伤，并建立重度胰腺损伤模型，用于探讨重症急性胰腺炎（SAP）的病理变化及治疗策略。

摘要

重症急性胰腺炎（SAP）死亡率较高，其治疗面临重大临床挑战。利用动物模型研究SAP相关的病理变化，有助于发现潜在的治疗靶点并探索新的治疗方法。以往的研究主要通过逆行胆管注射牛磺胆酸钠诱导胰腺损伤，但手术操作本身对动物模型质量的影响尚不明确。本研究采用不同频率的腹腔注射雨蛙素（Caerulein）联合不同剂量的脂多糖（LPS）在C57BL/6J小鼠中诱导胰腺损伤，并比较了五种腹腔注射方案下损伤程度的差异。针对小鼠急性胰腺炎的建模，本文提出一种可在5天内导致高达80%死亡率的腹腔注射方案：小鼠每日接受10次腹腔注射雨蛙素（50 µg/kg），末次注射雨蛙素后1小时再给予LPS（15 mg/kg）注射。通过调节药物注射的频率和剂量，可有效调控胰腺损伤的严重程度。该模型具有良好的可控性，复制周期短，可由单名研究人员独立完成，无需昂贵设备。该方法能够便捷、准确地模拟人类SAP的关键疾病特征，且具有高度可重复性。

引言

重症急性胰腺炎具有起病急骤、进展迅速和在消化系统疾病中病死率高的特点1。其高死亡率一直是临床研究的重点。由于临床病情变化难以预测、疾病表现异质性强以及人体标本获取有限，建立动物模型在疾病研究中变得愈发重要。

将牛磺胆酸钠逆行注入胆总管是建立大鼠重症急性胰腺炎（SAP）模型的常用方法2。该建模技术通过模拟胰胆管梗阻并诱导胆汁与胰液反流，能够高效复制SAP动物模型。然而需注意，侵入性手术本身会对动物模型产生一定影响。此外，该方法仅适用于大鼠和犬等体型较大的实验动物。其他常用的建模技术还包括十二指肠插管法3、直接十二指肠穿刺法4以及胆总管-胰管直接穿刺法5。

腹腔注射和饮食诱导建模方法具有非侵入性优势，可适用于任何体型的动物。通过喂食胆碱缺乏-乙硫氨酸（CDE）诱导的重症急性胰腺炎小鼠模型6 会引发一些并发症，例如难以控制的高血糖和低钙血症，因此不适合用于评估新的诊断和治疗方法。另一方面，腹腔注射Caerulein联合L-arginine7 是目前在小鼠中诱导急性胰腺炎最常用的方法。具体而言，重复腹腔注射铃蟾肽（Caerulein）——一种胆囊收缩素类似物——为研究该破坏性疾病的多个方面（包括发病机制、炎症反应及再生过程）提供了极为合适的手段。由于铃蟾肽在结构上与胆囊收缩素（CCK）高度相似，可有效刺激胆囊收缩和胰酶分泌，导致酶分泌失衡，进而引发自身消化性损伤8脂多糖（LPS）作为一种广泛存在且被深入研究的病原体相关分子模式分子，可与雨蛙素（Caerulein）联合使用 通过 腹腔注射以建立有效的SAP小鼠模型。该组合可迅速触发并释放大量炎性细胞因子，导致显著的局部和全身炎症反应。已有多个研究报道通过腹腔注射雨蛙素（Caerulein）联合脂多糖（LPS）诱导小鼠SAP模型。这可能是因为腹腔注射雨蛙素可引起小鼠胰腺水肿和出血，而添加LPS可立即诱导胰腺坏死，并加剧全身炎症反应、脓毒症甚至器官衰竭。目前，腹腔注射雨蛙素的剂量与频率尚不统一，附加LPS的剂量也存在差异，因此在小鼠SAP模型中实现一致性仍具挑战性9,10,11,12因此，建立标准化的操作流程以获得理想模型十分必要。本文介绍了一种小鼠腹腔注射的操作方案，并探讨了脂多糖（LPS）的最佳注射频率及附加剂量。

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方案

本方案经安徽科技大学第一附属医院（中国淮南）伦理委员会审核批准（伦理编号：2023-KY-905-001）。研究遵循公共卫生服务政策或《实验动物照护与使用指南》中关于实验动物操作的规定。本研究采用6至8周龄、体重20–30 g的雄性C57BL/6J成年小鼠。小鼠在受控条件下（温度约21 °C，12小时昼夜循环）的动物实验室中饲养一周。实验期间小鼠可自由摄食和饮水。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于 材料表.

1. 动物准备

  1. 将84只健康的C57BL/6J小鼠分为六组，包括对照组、胰腺损伤（PI）I、PI II、PI III、PI IV和PI V组。
  2. 在开始建模程序之前，用耳缘缺口标记每组小鼠，并使其禁食12小时。

2. 诱导药物稀释液的制备

  1. 将胆囊收缩素（Caerulein，1 mg）溶解于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并于 -20 °C 冷冻保存。
  2. 在对实验小鼠进行腹腔注射药物前 1 小时，测量并记录其体重。
  3. 根据所有小鼠的总重量，按 50 µg/kg 的比例计算并提取所需胆囊收缩素（Caerulein）的总质量。
  4. 再次用 PBS 稀释所获得的胆囊收缩素（Caerulein）药物。
    注意：PBS 稀释后的总体积应等于所有小鼠总重量数值的 5 倍。确保所使用的 LPS 和 PBS 均为无菌状态。所有配制步骤均应在生物安全柜中进行，以维持无菌条件。注射前将溶液储存于无菌、密封的容器中，防止污染。

3. 腹腔注射

注意：根据补充表1中所述方案，对每组小鼠进行腹腔注射以建立模型。另设10只小鼠分组处理，用于观察7天存活率。整个实验过程中，密切监测 humane endpoints（人道终点），以确保符合动物福利法规。当达到特定标准时，将实施安乐死，包括体重减轻30%-50%、严重嗜睡或运动能力显著受损。这些指标将作为人道干预的依据，以最大程度减少动物痛苦。

  1. 抓握小鼠，使其腹部朝上，头部位置低于尾部，以防止注射时损伤内脏器官。
  2. 使用75%酒精棉球对小鼠腹部进行消毒。
  3. 右手持注射器（使用长度≤0.5/≥0.3的针头），将针头插入腹白线左侧的皮下组织。
    注意：下次注射时更换至右侧。
  4. 当针头到达皮下层后，向前推进约3-5 mm，然后以45°角将注射器针头插入腹腔。此时应能感觉到一定阻力。
  5. 保持针头静止，缓慢注入药液。
    注意：最大注射体积不得超过0.15 mL。
  6. 注射完成后，拔出针头，并用无菌棉签轻轻按摩并按压注射部位，使药物充分扩散至小鼠腹腔内。
  7. 使用新的注射器对下一只实验小鼠重复操作。

4. 开放旷场行为能力测试

注意：末次腹腔注射后 12 小时，进行旷场行为能力测试，以评估小鼠的总活动距离和静止时间。

  1. 将四个相同的白色箱子直接放置在摄像头下方。
  2. 使用视频线缆将摄像头连接到计算机。
  3. 实验开始前，确保实验箱清洁且无任何气味残留。
  4. 将动物置于网格中央，使其背对实验操作者，并让其适应环境 10 分钟。
  5. 启动视频追踪软件，点击 文件 菜单以创建新实验。
  6. 设置对四个同步视野区域的监测。
  7. 在实时监控画面中标记实验对象在箱内活动范围的长度和宽度（30 cm × 30 cm）。
  8. 完成设置后，开始视频监控与录制。
  9. 记录小鼠的活动持续 15 分钟。
  10. 测试结束后，将动物从网格中移出并放回笼中。使用含二氧化氯的消毒剂彻底清洁网格。

5. 收集和检测小鼠外周血

  1. 处死小鼠（按照机构批准的方案进行）。
    1. 在腹腔注射后36小时对实验小鼠实施安乐死。安乐死前测量并记录小鼠的体重。
    2. 用左手固定小鼠，右手持剪刀剪除小鼠一侧的胡须。
    3. 轻压眼球周围皮肤，使眼球充血并突出。
    4. 使用弯头镊夹住眼球并迅速摘除，同时将外周血收集至微量离心管中。
      注意：使用两种不同的微量离心管，一种含有抗凝剂，另一种不含抗凝剂。
    5. 同时，用左手的中指轻轻按压小鼠心脏区域，以加快心脏泵血速度。
  2. 将不含抗凝剂的外周血在室温下静置30分钟。
  3. 采用全自动生化分析仪，通过酶速率法和酶循环法测定血清淀粉酶（Amy）和脂肪酶（Lip）的浓度（按照试剂盒说明书操作）。
  4. 使用商用化学发光成像仪，通过化学发光法检测血浆中降钙素原（PCT）等炎症指标水平（按照试剂盒说明书操作）。
  5. 使用ELISA试剂盒检测小鼠血清中HMGB-1、IL-6和TNF-α的水平（按照试剂盒说明书操作）。
  6. 使用全自动血细胞分析仪分析经抗凝处理的外周血，评估相关参数。

6. 收集胰腺组织并制备石蜡切片

  1. 将小鼠置于仰卧位，并固定在泡沫板上。
  2. 剃毛并消毒手术区域，沿腹部正中线做切口，将小肠管翻向右侧，充分暴露胰腺。
  3. 分离十二指肠和幽门管，找到胰腺下方的小肠，沿肠管完全游离胰腺组织。
  4. 使用无齿镊夹住脾脏，轻轻向上牵拉。
    注意：切勿直接接触胰腺组织，整个解离过程中应避免施加过大力量。
  5. 锐性解剖至胰头处的胰腺后方韧带组织，并切断胆管和血管。
  6. 取出胰腺组织，用吸水纸轻轻吸干表面水分，称重并记录。
  7. 将一半胰腺组织用4%多聚甲醛固定，另一半保存于-80 °C冰箱中。
  8. 按以下步骤制备胰腺石蜡切片。
    1. 用75%酒精清洗固定后的胰腺组织，并修剪至约0.5 cm × 0.5 cm大小。
    2. 将组织依次浸入70%乙醇20分钟、80%乙醇20分钟、90%乙醇15分钟。
    3. 用95%乙醇处理两次，每次15分钟；再用100%乙醇处理两次，每次5分钟。
    4. 用二甲苯溶液透明处理两次，时间分别为12分钟和5分钟。
    5. 将透明后的组织在65 °C的蜡缸中浸泡1小时。
    6. 将组织包埋于熔化的石蜡中，冷却后使用切片机获取胰腺石蜡切片（厚度：5 µm）。
    7. 将所得石蜡切片置于45 °C水中展平，贴片后干燥（烘烤条件：40 °C，14–16小时）。

7. 苏木精和伊红（H&E）染色

  1. 将胰腺石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ中各30分钟，然后依次放入无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇和75%乙醇中各5分钟，再放入超纯水中5分钟。
  2. 用苏木精染细胞核160秒，然后用流水缓慢冲洗。
  3. 加入盐酸乙醇分化液处理5–10秒，然后迅速用流水冲洗。
  4. 用无水乙醇处理切片5分钟。
  5. 用伊红染色胞质30秒，然后用流水冲洗。
  6. 将切片依次浸入75%、85%、95%和100%乙醇中各10秒，然后用二甲苯处理5分钟以脱水透明。
  7. 最后用中性树胶封片，并在显微镜下观察。
  8. 进行病理学评分并参照相关标准13。
    注意：根据水肿、腺泡坏死、出血、出血灶和脂肪坏死以及炎症和血管周围炎症等指标判断胰腺炎的严重程度。评分时请参考已发表的实施指南13。

8. 免疫组织化学染色

  1. 将胰腺组织的石蜡包埋切片置于二甲苯中脱蜡，随后用梯度乙醇溶液进行水化。
  2. 经30分钟膜破裂处理后，使用3% H2O2阻断内源性酶活性，作用20分钟。
  3. 用5%牛血清在室温下封闭抗体30分钟，然后在4 °C条件下与1:1500稀释的兔抗HMGB1抗体孵育过夜。
  4. 用PBS缓冲液冲洗切片，随后在37 °C下与相应二抗孵育30分钟。之后进行DAB显色、苏木精复染，并用中性树胶封片。

9. 胰腺切片中检测细胞凋亡的TUNEL法

  1. 将胰腺石蜡切片置于二甲苯中脱蜡 5 分钟，重复两次，然后用梯度乙醇洗涤（100% 乙醇 5 分钟，90% 乙醇 2 分钟，70% 乙醇 2 分钟，蒸馏水 2 分钟）。
  2. 用 PBS 洗去石蜡切片周围的多余液体。每个样本加入 100 µL 蛋白酶 K，确保组织完全覆盖。在 37 °C 下孵育 20 分钟。随后将样本浸入 PBS 中 3 次，每次 5 分钟。
    注意：蛋白酶 K 溶液通过将原始蛋白酶 K（200 µg/mL）溶液按体积比 1:9 用 PBS 稀释制得，最终浓度为 20 µg/mL，不含 DNase。必须彻底清洗蛋白酶 K，以避免干扰后续标记反应。
  3. 在组织上加入适量 3% H2O2（用 PBS 稀释），使其充分渗透组织，并孵育 20 分钟。用 PBS 冲洗组织 3 次，每次 5 分钟。
    注意：石蜡切片应保持湿润。为灭活组织内源性过氧化物酶，孵育时间不宜过长，以防 3% H2O2 引起 DNA 断裂而导致假阳性。
  4. 在待检测样本的整个区域覆盖 50 µL 平衡缓冲液，并孵育 10 分钟。
  5. 尽可能去除平衡缓冲液。然后向每个组织样本加入 56 µL TdT 孵育缓冲液，在室温下孵育 1 小时。
    注意：切片不得干燥，且应避免光照。TdT 孵育缓冲液按制造商说明配制（重组 TdT 酶 : 生物素-dUTP 标记混合物 : 平衡缓冲液 = 1 µL : 5 µL : 50 µL）。
  6. 立即用 PBS 洗涤组织样本，每次 5 分钟，共洗涤 4 次。用滤纸轻轻吸去样本周围多余的 PBS 溶液。
  7. 向每个组织样本加入 100 µL 预先稀释的链霉亲和素-HRP 反应液（链霉亲和素-HRP : TBST = 1 : 300），进行链霉亲和素-HRP 反应。孵育 30 分钟。然后用 PBS 洗涤样本，每次 5 分钟，共 3 次。
  8. 通过向每张石蜡切片加入 50 µL DAB 进行 DAB 染色。在显微镜下实时观察染色情况。出现阳性染色后，立即将切片放入湿盒中，并用纯水冲洗终止反应。
  9. 将切片浸入苏木精染色液中 3–5 分钟，然后用纯水冲洗。
  10. 在苏木精分化液中分化约 2 秒，随即用纯水立即冲洗。
  11. 用苏木精返蓝液处理数秒以实现蓝化，并用纯水将切片彻底冲洗干净。
    注意：核染色后进行显微镜检查。若染色过深，将切片返回分化液中处理；若染色过浅，则从核染色步骤重新开始染色过程。
  12. 用新鲜无水乙醇脱水 4 次，每次 5 分钟。然后依次浸入丁醇 5 分钟、二甲苯 5 分钟。最后用新鲜二甲苯再处理 5 分钟。
  13. 用中性树胶封片。自然晾干或在 60 °C 烤箱中干燥。
  14. 使用白光显微镜进行组织学检查。凋亡细胞核呈棕色。
  15. 计算相应的凋亡指数（AI）。
    注意：以双盲法观察切片。在 TUNEL 阳性切片中，于高倍镜（400×）下随机选取 5 个阳性区域，每个区域至少计数 100 个腺泡细胞，以确定阳性细胞百分比。AI =（凋亡细胞总数 / 细胞总数）× 100%。

10. 流式细胞术

  1. 获取新鲜的胰腺组织，用 PBS 灌注后彻底清洗。
  2. 配制 0.5% IV 型胶原酶消化液，使用无菌组织剪充分消化胰腺组织。
  3. 根据胰腺组织碎片的状态和液体浑浊程度，加入 5% BSA 消化终止液，并在低温下离心 5 分钟（约 300 × g，4 °C）。
  4. 弃去上清液以终止消化。
  5. 配制含有苯甲基磺酰氟（PMSF）和 2.5% 胎牛血清的细胞培养基，用于重悬胰腺细胞。
  6. 将胰腺腺泡细胞悬液通过 200 目尼龙筛网过滤，以获得过滤后的细胞悬液。
  7. 在低温下离心胰腺腺泡细胞悬液（离心条件同步骤 3 所述）。
  8. 弃去上清液。
  9. 用预冷的 PBS 洗涤细胞。
  10. 通过离心重悬，将细胞轻轻重悬于预冷的 1× 结合缓冲液中。
  11. 调整细胞浓度后，按照试剂盒说明书用 Annexin V-FITC/PI 对胰腺腺泡细胞进行标记。
  12. 在 1 小时内使用流式细胞术检测胰腺腺泡细胞的凋亡情况。

11. Caspase-3 和 HMGB-1 的 Western 印迹检测

  1. 提取胰腺蛋白。
    1. 取50 mg胰腺组织，剪成小碎片。
    2. 加入1 mL RIPA裂解缓冲液（含PMSF和磷酸化蛋白酶抑制剂）。
    3. 使用电动研磨器在冰上匀浆胰腺组织5分钟。
    4. 将匀浆后的组织在冰上轻轻振荡孵育2小时。
    5. 在4 °C、4,500 × g 条件下离心10分钟。
    6. 收集上清液，并于-80 °C保存。
  2. 进行蛋白定量。
    1. 将一定体积的BSA标准品（25 mg/mL）稀释至0.5 mg/mL浓度。
    2. 通过将50体积的BCA溶液A与1体积的BCA溶液B混合，配制适量的BCA工作液，确保充分且均匀混合。
    3. 按0、1、2、4、8、12、16和20 µL的顺序，将BSA标准品加入96孔板的标准品孔中，用蒸馏水补足各孔体积至20 µL。
    4. 在样品孔中加入2 µL样品，随后依次加入18 µL蒸馏水进行稀释（1:9）。
    5. 每孔加入200 µL BCA工作液，于37 °C静置约20–30分钟。
    6. 在562 nm波长下测定吸光度，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。
    7. 加入适量RIPA裂解液和稀释缓冲液，将样品稀释至蛋白浓度达到5–10 µg/µL，视为合适。
    8. 蛋白变性（100 °C；10分钟）后，将样品于-20 °C保存。
  3. 进行Western blot实验。
    1. 准备SDS-PAGE。
      1. 安装制胶模具，并检查其密封性。
      2. 向10%分离胶中加入TEMED，混匀。
      3. 将混合液注入模具，约占总体积的三分之二，避免产生气泡。
      4. 向模具中加入异丙醇，压胶约40分钟。
      5. 采用相同程序配制5%浓缩胶。
      6. 倒出异丙醇，并立即加入浓缩胶。
      7. 垂直插入梳子，直至胶完全聚合。
    2. 进行电泳操作。
      1. 按预期实验对照顺序的逆序，将待测样品加入SDS-PAGE胶的加样孔中。
      2. 同时加入Protein Marker，以确定目标蛋白和内参蛋白的位置。
      3. 加样完成后，将样品放入电泳槽中。
      4. 初始以80 V运行30分钟，随后以100 V运行60分钟，使蛋白充分分离。
        注：应注意溴酚蓝的位置，避免电泳过度。
    3. 进行蛋白转膜。
      1. 在PVDF膜的右上角剪角作为标记。
      2. 将PVDF膜置于甲醇溶液中5–10秒以活化。
      3. 将PVDF膜浸泡于电泳缓冲液中约15分钟。
      4. 电泳结束后小心取出凝胶，修剪多余部分，确保整个过程中凝胶保持湿润。
      5. 按以下顺序组装转膜夹：负极板 → 海绵 → 三层滤纸 → 凝胶 → PVDF膜 → 三层滤纸 → 海绵 → 正极板。
        注：确保凝胶与PVDF膜之间无气泡。
      6. 将组装好的转膜夹放入湿转槽中（黑面对黑面），周围放置冰块。
      7. 接通电源，以400 mA电流转膜100分钟。
    4. 进行PVDF膜封闭及一抗、二抗孵育。
      1. 转膜完成后轻轻取出PVDF膜，用TBST漂洗10分钟，重复3–5次。
      2. 将PVDF膜在5%脱脂奶粉中封闭2小时。
      3. 取出PVDF膜，用TBST漂洗10分钟，重复4次。
      4. 将PVDF膜与稀释后的一抗共同置于4 °C冰箱中，轻轻振荡孵育过夜。
      5. 次日取出PVDF膜，用TBST漂洗10分钟，重复4次。
      6. 将PVDF膜在HRP标记的二抗稀释液中孵育约2小时。
      7. 用TBST漂洗PVDF膜10分钟，重复4次。
    5. 曝光并分析结果。
      1. 将配制好的ECL溶液均匀滴加至膜上。
      2. 在暗室中使用曝光仪曝光约2–3分钟，随后保存图像。
      3. 使用ImageJ软件进行分析。

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结果

实验小鼠模型构建过程如图所示 图1注射完成后12小时，使用旷场视频记录仪监测各实验组小鼠在5个周期内的移动距离和静止持续时间。图2A）。在5个循环期间，PI V组小鼠在3分钟内的运动距离保持在较低水平，而3分钟内的不动比例在后续每个循环中逐渐增加（图2B，C）。此外，对不同实验组小鼠在5个周期内的总移动距离进行了统计学分析。PI V组的总移动距离最小，与其他实验组相比差异具有统计学意义（p < 0.001) (图 2D，E）。除对照组和PI I组外，其他实验组小鼠的D值体重均呈现负增长。其中，PI V组的体重变化最为显著，与其他实验组相比，其体重变化差异具有统计学意义（图2F）。在额外评估了每组10只小鼠的存活率后，结...

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讨论

目前，尚缺乏有效手段来改善重症急性胰腺炎患者的高死亡率问题。研究药物在增强免疫稳定机制方面的有效性至关重要。建立理想的重症急性胰腺炎动物模型迫在眉睫。C57BL/6J遗传背景的小鼠广泛应用于生物医学研究，包括重症急性胰腺炎（SAP）病理生理学的研究。由于B6J小鼠经历了超过70年的遗传分化，导致多个外显子发生自发性缺失15，从而降低了对蓝斑素（Caerulein）诱导的胰腺损伤的敏感性16。此外，现有的急性胰腺炎动物模型存在诸如手术创伤或仅适用于较大动物等局限性，限制了这些模型在科学研究中的应用。因此，利用这一特定基因品系建立稳定、高效且便捷的动物模型具有重要价值。

胆囊收缩素类似物Caerulein通过在小鼠禁食并积聚足够量消化液后短时间内高频注射，导致胰腺消化液和酶分泌发生相对性阻塞，从而诱发胰腺组织损伤17脂多糖（LPS）是细菌细胞壁中的主要成分，可在小鼠中引发多器官功能障碍综合征（MODS）和全身性炎症反应综合征（SIRS）。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由淮南市卫生健康与医学科学研究项目（编号：HNWJ2023005）；淮南市市级引导科技计划项目（编号：2023151）；安徽省大学生创新创业训练计划项目（编号：S202310361254）；第九批 "50·科技之星" 淮南市创新团队及安徽省重点临床专科建设项目。我们谨向安徽理工大学第一附属医院检验科致以诚挚感谢，感谢其提供相关检测数据。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20× 柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）中国武汉赛维尔生物科技有限公司G1202-250 ml
淀粉酶迈瑞，中国
Annexin V-FITC/PI中国武汉服务生物技术有限公司 G1511  1:20 稀释
兔源抗HMGB1多克隆抗体中国武汉赛维尔生物科技有限公司GB11103  1:1800 稀释
BCA蛋白定量检测试剂盒中国武汉服务生物技术有限公司G2026-200T
BD FACSCanto II 流式细胞仪BD生命科学公司，美国加利福尼亚州圣何塞市，邮编95131BD FACSCanto II
BSA中国武汉赛维尔生物科技有限公司GC305010-100g
C57BL/6J中国常州 Cavion 实验动物有限公司许可证编号 SCXY (苏) 2011–0003
Ceruletide 美国新泽西州 MCE17650-98-5 50 µg/kg
化学发光成像仪Cytiva 公司；美国
柠檬酸抗原修复液（干粉，pH 6.0）中国武汉服务生物技术有限公司G1201-5 L
胶原酶IV中国武汉赛维尔生物科技有限公司 GC3050140.5 mg/mL
DAB（SA-HRP）Tunel细胞凋亡检测试剂盒中国武汉服务生物技术有限公司G1507-100 T
Dimension EXL 配备 LM 一体化化学分析系统西门子医疗诊断公司，美国布鲁克菲尔德YZB/USA 8311-2014
ECL 显影液中国武汉，Servicebio 技术有限公司
伊红染料（醇溶性）中国武汉服务生物技术有限公司G1001-100 ml
EthoVision XT Noldus，荷兰
FITC标记的山羊抗兔IgG中国武汉服务生物技术有限公司GB22303  1:50 稀释
全自动血细胞分析仪Zybio公司 中国 Zybio-Z3 CRP
GapDH中国武汉服务生物技术有限公司GB11103  1:1500 稀释
苏木精返蓝液中国武汉，Servicebio 技术有限公司G1040-500 ml
苏木精分化液中国武汉服务生物技术有限公司G1039-500 ml
苏木精染料中国武汉服务生物技术有限公司G1004-100 ml
HMGB-1 ELISA试剂盒中国nj jc生物有限公司
匀浆器中国武汉服务生物技术有限公司KZ-III-F；IC111150 100222
HRP标记的山羊抗兔IgG中国武汉服务生物技术有限公司GB23303  1:1500 稀释
IL-6 ELISA试剂盒中国武汉服务生物技术有限公司GEM0001
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参考文献

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