方法文章

用于逆向转化脑科学研究的人源血液诱导小胶质样细胞的构建

DOI：

10.3791/66819

⸱

2024年9月6日

 ,  ,  , 
1Department of Neuropsychiatry, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, 2Department of Functional Anatomy and Neuroscience, Asahikawa Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究阐述了一种建立人单核细胞来源的小胶质细胞样（iMG）细胞的新方法，可用于间接评估脑部炎症。该细胞模型可能有助于针对脑部潜在炎症及相关神经精神疾病的研究。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近期利用动物模型开展的研究表明，小胶质细胞在多种神经精神疾病和躯体疾病中作为关键的免疫调节因子具有重要意义。尸检脑组织分析和正电子发射断层扫描成像是评估人类患者小胶质细胞活化的代表性研究方法；研究结果揭示，在患有多种神经精神障碍和慢性疼痛的患者脑中，小胶质细胞呈现活化状态。然而，上述技术仅能用于评估小胶质细胞活化的有限方面。

我们最初设计了一种技术，无需脑组织活检和诱导性多能干细胞技术，通过在新鲜分离的人外周血单核细胞中添加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素34，培养2周，直接诱导生成类似小胶质细胞的细胞（iMG）。这些iMG细胞可用于在细胞水平应激刺激后，进行吞噬能力及细胞因子释放相关的动态形态学和分子水平分析。近期，已通过全面的转录组分析验证了人iMG细胞与脑内原代小胶质细胞之间的相似性。

来源于患者的iMG细胞可作为预测人脑小胶质细胞活化的关键替代标志物，并已帮助揭示了Nasu-Hakola病、纤维肌痛、双相情感障碍和烟雾病患者小胶质细胞此前未知的动态病理生理机制。因此，基于iMG的技术是一种有价值的反向转化研究工具，为阐明多种精神和躯体疾病中小胶质细胞的动态分子病理生理机制提供了新的见解。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年来，脑部炎症被认为在多种脑部及神经精神疾病的发生发展过程中发挥关键作用；通过人类尸检脑组织分析和基于正电子发射断层扫描（PET）的生物成像技术，小胶质细胞已被确认为重要的免疫调节细胞1,2,3,4。尸检脑组织与PET影像分析揭示了诸多重要发现；然而，这些方法在全面捕捉人脑中小胶质细胞动态分子活动方面仍存在局限性。因此，亟需开发新的策略，以实现对人源小胶质细胞在分子与细胞水平上的功能与功能障碍进行系统性评估。

2014年，我们首次开发出一种新技术，可直接诱导生成小胶质细胞样（iMG）细胞5,6，早于2016年首次发表的人诱导性多能干细胞（iPSC）来源的小胶质细胞样细胞7。通过优化细胞因子——粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素34（IL-34），我们在短短两周内成功将人外周血单核细胞转化为iMG细胞。在我们开发该技术时，将神经元细胞从iPS细胞或成纤维细胞中诱导产生的创新重编程方法才刚刚在国际上兴起8,9,10,11。然而，当时尚未有报道关于诱导iPS来源的小胶质细胞的方法，因此迫切需要建立一种来源于人体体细胞的小胶质细胞模型。由于已有研究报道，诸如GM-CSF和IL-34以及巨噬细胞集落刺激因子等细胞因子对小胶质细胞的发育和维持至关重要12,13,14,15，我们推测，联合使用这些细胞因子可直接用于从小核单核细胞生成小胶质细胞模型。最终，我们成功通过联合使用GM-CSF和IL-34，建立了来源于单核细胞的小胶质细胞模型5。此外，部分此类细胞因子组合也被用于从iPS细胞诱导小胶质细胞7,16，并被认为是在获得小胶质细胞特性过程中发挥重要作用的关键因素。

与iPSC方法相比，iMG细胞无需任何遗传修饰，仅通过简单的化学诱导即可在极短时间内获得，从而显著降低了时间和经济成本。此外，iMG细胞无需基因重编程，因此我们认为iMG细胞是评估人类小胶质细胞特征及其状态的有力替代细胞。在2014年关于iMG技术的首篇论文中，我们证实iMG细胞表现出人类小胶质细胞的表型，可明确区别于单核细胞和巨噬细胞。例如，iMG细胞中CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）和C-C趋化因子受体2型（CCR2）的过表达水平高于单核细胞，并表达典型的小胶质细胞标志物，包括跨膜蛋白119（TMEM 119）和嘌呤能受体P2RY125,17。近期，我们进一步验证了来自同一接受脑部手术患者的外周血来源iMG细胞，在已知小胶质细胞标志物的基因表达谱上与脑内小胶质细胞高度相似18。iMG细胞可用于在分子水平上分析其动态功能，如吞噬作用和细胞因子产生，有望弥补死后脑组织研究和PET研究的局限性。

我们此前发现了与微胶质细胞相关的、在被诊断为Nasu-Hakola病5、纤维肌痛19、双相情感障碍20,21或烟雾病22的患者中 previously unknown 的动态病理生理机制。此外，基于我们原创的方法学，多个实验室已将iMG细胞（某些实验室为这些细胞命名了其他名称）作为关键的反向转化研究工具加以应用23,24,25,26,27。Sellgren等人依照我们的建议成功生成了iMG细胞，并进行了微阵列分析，结果表明这些细胞与人类脑内微胶质细胞高度相似23。最近，我们通过RNA测序进一步证实了人源iMG细胞与脑组织原代微胶质细胞之间的相似性18。

本研究旨在记录从人类外周血生成iMG细胞的方法，以促进针对神经精神疾病领域的逆向转化研究。该技术作为一种合理的分析工具，具有广阔的应用前景，能够在短时间内轻松地构建小胶质细胞模型，即使在缺乏基因转导设备或专业技术人才的条件有限的实验室中亦可实现。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究方案经九州大学伦理委员会批准，并遵守《赫尔辛基宣言》的所有规定。所有参与者（包括健康志愿者和患者）均签署了书面知情同意书，同意分析其血液样本并发表相关数据。材料与仪器列于材料表中，溶液的组成详见表1。

1. 实验用培养基与缓冲液的制备

  1. 通过在RPMI-1640培养基中添加10%热灭活胎牛血清（56 °C，30分钟）和1%青霉素-链霉素，制备分离培养基。
  2. 在基础缓冲液中加入0.5%牛血清白蛋白（BSA）储备液，配制分离缓冲液，并通过过滤（0.22 µm）进行灭菌。

2. 从全血中分离单个核细胞

  1. 将15 mL密度梯度介质转移至50 mL密度梯度离心管中，在20 °C下以1,000 ×g离心1分钟。
    注意：每支50 mL密度梯度离心管处理15 mL血液。当血量较多时，应增加离心管数量。
  2. 通过倒置混匀肝素抗凝管中采集的血液，并使用火焰灭菌的镊子取下采血管盖。
  3. 将等体积（10–15 mL）的血液加入密度梯度离心管中的密度梯度介质上层。
  4. 将离心机减速等级设置为4级中的第1级，在室温（RT）下以1,000 ×g离心10分钟。
    注意：在此减速速率下，180 ×g（1,000 rpm）的转速将在3分钟内停止。
  5. 准备与50 mL密度梯度离心管数量相等的50 mL离心管，每管加入10 mL PBS（−）。
  6. 离心后，移除血浆上层液体，保留至距白膜层上方约1 cm处。
    注意：将吸液移液管垂直插入管中，从液面中心小心吸取。避免过度吸取，以防扰动白膜层。
  7. 将50 mL密度梯度离心管中剩余的所有上清液倾入含有10 mL PBS（−）的离心管中。
  8. 将离心机减速等级重置为4级中的第3级，在室温（RT）下以250 ×g离心10分钟。在此步骤期间，准备一个50 mL和两个15 mL离心管，以及一个100 µm细胞筛。
  9. 离心结束后，将离心机温度设定为4 °C。观察离心管底部是否有白色沉淀物并带有红色边缘。通过吸除法移去上清液，并轻轻敲击使沉淀物松散。
  10. 使用火焰灭菌的镊子将100 µm细胞筛置于50 mL锥形管上。
  11. 向其中一个已离心的管中加入13 mL分离介质，并冲洗管内壁以充分收集细胞。将细胞悬液依次冲洗其余已离心的管。在从所有管中收集细胞后，将细胞悬液通过细胞筛过滤至50 mL锥形管中。
    注意：在整个细胞分离过程（步骤2.11–2.16）中，分离介质需保持低温。
  12. 按照步骤2.11所述方法，再次用13 mL分离介质冲洗每个管。共收集26 mL细胞悬液。
  13. 将细胞悬液等量分装至两个15 mL锥形管中，进行细胞计数，并计算步骤2.16所需的分离缓冲液体积（每107个总细胞加入60 µL缓冲液）。
    注意：使用15 mL锥形管更为合适，因为液体体积较小，在步骤2.16加样时容易产生气泡。
  14. 在4 °C下以250 ×g离心10分钟。
  15. 离心过程中，使用70%乙醇彻底消毒磁力架（特别是与柱接触的部分），并将其放置在实验台上自然晾干。将分离缓冲液置于冰上保存。
  16. 通过吸除法移去上清液（此阶段可见因红细胞存在而形成的约1 mm厚的红色沉淀），加入适量分离缓冲液，并通过反复吹打约20次轻轻重悬沉淀。

3. 使用CD11b微珠分离单核细胞

  1. 使用前将人FcR阻断试剂涡旋振荡10秒。按所需用量加入试剂（每107个总细胞加入20 µL FcR阻断试剂），并在4 °C条件下孵育5分钟。
  2. 使用前将CD11b微珠涡旋振荡10秒。按所需用量加入试剂（每107个总细胞加入20 µL CD11b微珠），在4 °C条件下孵育20分钟，期间每5分钟手动轻轻晃动一次。
  3. 孵育结束后，加入10 mL分离缓冲液，轻轻吹打混匀，于4 °C以300 ×g离心10分钟。
  4. 离心过程中，将磁性分离柱置于磁力架上，并用3 mL分离缓冲液冲洗柱子。
    注意：避免触碰磁性柱的磁性部分，并正确安装柱子。若柱内出现气泡，需用移液器将其去除。整个分离过程（步骤3.4–3.9）中，分离缓冲液必须保持预冷状态。
  5. 离心后，用移液器吸除上清液，加入1 mL分离缓冲液，轻轻吹打混匀，然后将细胞悬液加载至分离柱中。
  6. 每次柱子储液腔排空后，用3 mL分离缓冲液洗涤柱子，重复3次。
  7. 将分离柱转移至15 mL锥形管中，避免触碰磁性部分；向柱内加入5 mL分离缓冲液，并将推杆插入管中，推动液体通过柱子完成洗脱。
  8. 将收集于管中的细胞悬液于4 °C以300 ×g离心10分钟。
  9. 吸除上清液，将细胞重悬于分离培养基中。由于回收的细胞数量约为步骤2.13中计数细胞的5–10%，应根据细胞数量调整重悬体积。
    注意：分离培养基应在室温下使用，不得预热，以避免细胞从4 °C经历快速温度变化。
  10. 对细胞进行计数后，将500 µL细胞悬液（浓度为40 × 104 个细胞/mL）分装至24孔板的每个孔中，过夜孵育。
    注意：应根据不同的培养板调整接种体积，相应地使用移液器操作。例如，12孔板每孔接种1 mL，8孔腔室载玻片每孔接种250 µL。
  11. 最后，按照实验机构制定的感染性废弃物处理政策，对受污染的设备进行处置或消毒。

4. 从单核细胞诱导产生iMG细胞

  1. 通过在基础诱导培养基中添加1%抗生素-抗真菌素溶液、10 ng/mL重组人GM-CSF和100 ng/mL重组人IL-34，制备诱导培养基。
  2. 将前一天接种所用的分离培养基更换为诱导培养基。将培养板向前倾斜，用巴氏吸管从孔底前缘迅速吸除耗尽的培养基。每次最多更换1块板（= 24孔），并立即轻柔地加入500 µL诱导培养基。
    注意：此步骤应选择贴壁的单核细胞。
  3. 将细胞培养孵育14天以完成诱导过程。
  4. 14天后再次更换培养基，加入500 µL诱导培养基。此后，为维持诱导后的细胞生长，每周更换一次诱导培养基，每次加入500 µL新鲜诱导培养基。

5. 免疫细胞化学

  1. 用移液器吸除第3.10步中接种有细胞的8孔腔室载玻片中的培养基，并用PBS（−）洗涤一次。
  2. 用4%多聚甲醛在室温下固定细胞20分钟。
  3. 去除固定液，用PBS（−）洗涤细胞，每次5分钟，共洗涤3次。
  4. 用含0.1% Triton X-100的PBS（−）在室温下对细胞进行透化处理。
  5. 将透化后的细胞在封闭液（3% BSA/PBS（−））中于室温孵育1小时。
  6. 在4 °C下，将细胞与一抗（材料表）共同孵育过夜。
    注意：所有抗体均用封闭液稀释。
  7. 用PBS（−）洗涤细胞，每次5分钟，共洗涤3次。
  8. 将洗涤后的细胞与合适的荧光标记二抗在室温下孵育1小时（材料表）。
  9. 用PBS（−）洗涤细胞，每次5分钟，共洗涤3次，以去除未结合的二抗。
  10. 将细胞与用PBS（−）稀释的DAPI溶液（1:10,000）在室温下孵育5分钟。
  11. 用PBS（−）洗涤细胞，每次5分钟，共洗涤3次。
  12. 使用封片剂封片，并在荧光显微镜下观察细胞。

结果

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重要的是，iMG 细胞在个体间以及不同时间点上均表现出显著的异质性，包括形态学特征和基因表达水平。某些个体中的 iMG 细胞呈现大量分支状形态（图 1A），而在其他个体中则保持球形（图 1B）。即使在同一受试者体内，iMG 细胞的特性也可能存在差异，这使其成为检测疾病状态生物标志物的关键工具。相反，对这类个体间差异的研究要求尽可能降低技术误差。iMG 细胞定义为使用 GM-CSF 和 IL-34 诱导至少 14 天的单核细胞。为最大限度减少技术误差，建议统一诱导时间，使用相同量的试剂，并避免使用过期试剂。

免疫染色验证还证实，iMG细胞表达小胶质细胞标志物，包括P2RY12和TMEM119（图2）。先前的研究表明，iMG细胞的形态学和基因表达特征与双相情感障碍的病理生理学相关20,21。在加入GM-CSF和IL-34处理后第3天即可观察到最早出现的分支状细胞，当每周更换一次培养基时，状态最佳的iMG细胞可存活超过1个月。iMG细胞可用于基因表达分析。例如，在干扰素γ或IL-4刺激下，iMG细胞会改变其基因表达模式，可用于M1和M2极化小胶质细胞的功能评估5,22。此外，FITC标记的微珠可诱导类阿米巴样的形态改变，并上调TNFα及其他基因的表达5。 Furthermore，通过检测微珠的荧光强度可评估吞噬作用5,22。此外，由于iMG细胞为活细胞，可通过拍摄细胞图像（图3）或进行延时摄影（视频1）来观察其实际运动和形态变化。

显微镜下细胞形态比较；A组与B组；显微成像研究。
图1：iMG细胞的形态学特征。（A）典型的分支状iMG细胞具有微小的胞体和大量分支的侧突。（B）部分样本形态存在差异，例如阿米巴样形态。比例尺，50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

小胶质细胞研究中TMEM119和P2RY12蛋白的免疫荧光显微镜图像。
图2：iMG细胞的免疫细胞化学染色。 iMG细胞表达典型的小胶质细胞标志物：（A）TMEM119，（B）P2RY12。细胞核用DAPI染色（蓝色）。比例尺 = 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞形态变化；显微镜图像；细胞分化分析；三个样本比较。
图3：iMG细胞的形态学改变。 iMG细胞在诱导过程中发生形态变化。细胞突起在诱导第3天左右出现（A），随着诱导进行，在第7天（B）和第14天（C）逐渐伸长。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

视频1：iMG细胞的延时摄影。 位于中央的具有分支状形态的iMG细胞在伸出和回缩其突起的过程中，似乎与周围细胞建立了接触。此外，该细胞还吞噬了受损细胞。图像采集时间间隔为46秒，拍摄总时长约14小时。请点击此处下载该视频。

表1：溶液组成 请点击此处下载该表格。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用iMG细胞的分析技术可作为强大的反向转化研究工具5,6。为了获得足量的人源iMG细胞，实验人员在设计研究时应考虑若干关键问题。来源于人体的血液样本极为敏感，因此所获取的样本需及时处理，并谨慎操作以避免污染。具体而言，血液样本应在采集后立即进行分离，不得长时间无人看管。通常实验应在采血后3小时内开始，以确保结果的有效性；然而，血液样本也可在4°C条件下保存超过3小时，并在启动分离程序前恢复至室温。

为确保结果稳定，建议培养基等试剂在开封后一个月内使用，并在过期后丢弃。使用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞时，某些样本中可能会观察到细胞聚集现象。在此情况下，必须用PBS（−）稀释全血样本以防止聚集。在诱导分化为小胶质细胞的过程中，培养基在14天内不进行更换，以避免对细胞造成不必要的刺激。完成诱导分化后，更换新鲜培养基可能有助于恢复活力减弱的细胞，并在一段时间内维持其存活状态。

本研究建立的iMG技术存在一定的局限性：实验诱导产生的"小胶质细胞样细胞"虽与人脑中实际的小胶质细胞相似，但并不完全相同。此外，先前的研究已报道了人单核细胞来源的小胶质细胞样细胞的诱导方法，不同研究团队基于原始iMG方法提出了各自不同的实验方案和命名方式28。例如，某些方案使用M-CSF29,30,31,32或TGF-β33，这些因子被报道可在iPSC来源的小胶质细胞培养体系中或Geltrex24,34等包被基质上促进小胶质细胞样表型的形成；这些因子可能在诱导小胶质细胞样细胞方面具有有效性。

原始的iMG技术具有优势，因其仅需两种细胞因子且无需包被，操作简单且易于重复，从而能够利用人血开展多种反向转化实验。相反，技术的进步促进了多种产品的开发。磁性分离方法包括基于柱的阳性选择法（类似于本方案）、阴性选择法以及无柱分离法。此外，除磁性分离外，还可考虑使用塑料贴壁法作为替代分离方法。基于柱的阳性选择法可确保细胞纯度，但该技术耗时较长，且磁珠刺激会显著影响细胞状态35。相比之下，阴性选择法和塑料贴壁法对细胞的损伤可能较小，但这些方法获得的细胞纯度可能较低35,36。未来可能需要根据其他方案进行进一步优化。

上述研究结果证实，该iMG技术的主要优势在于其耗时短、成本效益高，并能够处理大量样本，适用于高通量研究。因此，该技术可用于从人类样本中获取知识，随后利用不同的动物模型开展进一步的验证研究。此外，应用iMG技术在细胞和动物模型上研究所获得的结果也可能具有重要价值。通过这种方式，我们的iMG技术可实现双向转化研究，以“床旁到实验台”和“实验台到床旁”的模式推进科研进程。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作部分得到了以下科研资助项目的资助：（1）日本促进科学振兴会（KAKENHI；JP18H04042、JP19K21591、JP20H01773 和 JP22H00494 资助 TAK，JP22H03000 资助 M.O.）；（2）日本医疗研究开发机构（AMED；JP21wm0425010 资助 TAK，JP22dk0207065 资助 M.O.）；以及（3）日本科学技术振兴机构 CREST（JPMJCR22N5 资助 TAK）。资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。我们感谢 Editage（www.editage.jp）在英文语言润色方面提供的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1% Triton X-100Sigma-Aldrich30-5140-5
4% 多聚甲醛Nacalai Tesque09154-14
抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液）gibco15240-062描述为 "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS 冲洗液 Miltenyi Biotec130-091-222描述为 "basic buffer solution"，并用作 "isolation buffer"
CD11b MicroBeads Miltenyi Biotec130–049-601
DAPI 溶液DOJINDO28718-90-3
杜氏磷酸盐缓冲液Nacalai Tesque14249-24描述为 "PBS (−)"
胎牛血清biowestS1760-500
人 FcR 封闭试剂 Miltenyi Biotec130–059-901
Leucosep Greiner Bio-One227290描述为 "density gradient centrifugation tube"
MACS LS 柱 Miltenyi Biotec130-042-401描述为 "magnetic column"
MACS BSA 储存液 Miltenyi Biotec130-091-376描述为 "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand Miltenyi Biotec130-042-303描述为 "magnetic stand"
青霉素-链霉素Nacalai Tesque26253–84
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP10144描述为 "mounting media"
重组人 GM-CSFR&D Systems215-GM
重组人 IL-34R&D Systems5265-IL
RPMI 1640 培养基 + GlutaMAX 补充剂（预补充培养基）Thermo Fisher Scientific61870036描述为 "basal induction medium"
RPMI-1640Nacalai Tesque30264-56
抗体
抗 P2RY12 抗体Sigma-AldrichHPA014518一抗，兔源，1:100
抗 TMEM119 抗体Sigma-AldrichHPA051870一抗，兔源，1:100
山羊抗兔 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568invitrogenA-11011二抗，兔源，1:1000

参考文献

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