用于逆向转化脑科学研究的人源血液诱导小胶质样细胞的构建

摘要

本研究阐述了一种建立人单核细胞来源的小胶质细胞样（iMG）细胞的新方法，可用于间接评估脑部炎症。该细胞模型可能有助于针对脑部潜在炎症及相关神经精神疾病的研究。

摘要

近期利用动物模型开展的研究表明，小胶质细胞在多种神经精神疾病和躯体疾病中作为关键的免疫调节因子具有重要意义。尸检脑组织分析和正电子发射断层扫描成像是评估人类患者小胶质细胞活化的代表性研究方法；研究结果揭示，在患有多种神经精神障碍和慢性疼痛的患者脑中，小胶质细胞呈现活化状态。然而，上述技术仅能用于评估小胶质细胞活化的有限方面。

我们最初设计了一种技术，无需脑组织活检和诱导性多能干细胞技术，通过在新鲜分离的人外周血单核细胞中添加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素34，培养2周，直接诱导生成类似小胶质细胞的细胞（iMG）。这些iMG细胞可用于在细胞水平应激刺激后，进行吞噬能力及细胞因子释放相关的动态形态学和分子水平分析。近期，已通过全面的转录组分析验证了人iMG细胞与脑内原代小胶质细胞之间的相似性。

来源于患者的iMG细胞可作为预测人脑小胶质细胞活化的关键替代标志物，并已帮助揭示了Nasu-Hakola病、纤维肌痛、双相情感障碍和烟雾病患者小胶质细胞此前未知的动态病理生理机制。因此，基于iMG的技术是一种有价值的反向转化研究工具，为阐明多种精神和躯体疾病中小胶质细胞的动态分子病理生理机制提供了新的见解。

引言

近年来，脑部炎症被认为在多种脑部及神经精神疾病的发生发展过程中发挥关键作用；通过人类尸检脑组织分析和基于正电子发射断层扫描（PET）的生物成像技术，小胶质细胞已被确认为重要的免疫调节细胞^1,2,3,4。尸检脑组织与PET影像分析揭示了诸多重要发现；然而，这些方法在全面捕捉人脑中小胶质细胞动态分子活动方面仍存在局限性。因此，亟需开发新的策略，以实现对人源小胶质细胞在分子与细胞水平上的功能与功能障碍进行系统性评估。

2014年，我们首次开发出一种新技术，可直接诱导生成小胶质细胞样（iMG）细胞^5,6，早于2016年首次发表的人诱导性多能干细胞（iPSC）来源的小胶质细胞样细胞⁷。通过优化细胞因子——粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素34（IL-34），我们在短短两周内成功将人外周血单核细胞转化为iMG细胞。在我们开发该技术时，将神经元细胞从iPS细胞或成纤维细胞中诱导产生的创新重编程方法才刚刚在国际上兴起^8....

方案

本研究方案经九州大学伦理委员会批准，并遵守《赫尔辛基宣言》的所有规定。所有参与者（包括健康志愿者和患者）均签署了书面知情同意书，同意分析其血液样本并发表相关数据。材料与仪器列于材料表中，溶液的组成详见表1。

1. 实验用培养基与缓冲液的制备

1. 通过在RPMI-1640培养基中添加10%热灭活胎牛血清（56 °C，30分钟）和1%青霉素-链霉素，制备分离培养基。
2. 在基础缓冲液中加入0.5%牛血清白蛋白（BSA）储备液，配制分离缓冲液，并通过过滤（0.22 µm）进行灭菌。

2. 从全血中分离单个核细胞

1. 将15 mL密度梯度介质转移至50 mL密度梯度离心管中，在20 °C下以1,000 ×g离心1分钟。
   注意：每支50 mL密度梯度离心管处理15 mL血液。当血量较多时，应增加离心管数量。
2. 通过倒置混匀肝素抗凝管中采集的血液，并使用火焰灭菌的镊子取下采血管盖。
3. 将等体积（10–15 mL）的血液加入密度梯度离心管中的密度梯度介质上层。
4. 将离心机减速等级设置为4级中的第1级，在室温（RT）下以1,000 ×g

结果

重要的是，iMG 细胞在个体间以及不同时间点上均表现出高度的异质性，包括形态学特征和基因表达水平。某些个体中的 iMG 细胞呈现大量分支状结构（图 1A），而在其他个体中则保持球形（图 1B）。即使在同一受试者体内，iMG 细胞的特性也可能存在差异，这使其成为检测疾病状态生物标志物的关键工具。相反，对这类个体间差异的研究要求尽可能降低技术误差。iMG 细胞定义为使用 GM-CSF 和 IL-34 诱导单核细胞至少 14 天后获得的细胞。为最大限度减少技术误差，建议标准化诱导时间，使用相同量的试剂，并避免使用过期试剂。

免疫染色验证也证实，iMG细胞表达小胶质细胞标志物，包括P2RY12和TMEM119（图2）。既往研究表明，iMG细胞的形态学和基因表达特征与双相情感障碍的病理生理学相关^20,21

讨论

利用iMG细胞的分析技术可作为强大的反向转化研究工具^5,6。为了获得足量的人源iMG细胞，实验人员在设计研究时应考虑若干关键问题。来源于人体的血液样本极为敏感，因此所获取的样本需及时处理，并谨慎操作以避免污染。具体而言，血液样本应在采集后立即进行分离，不得长时间无人看管。通常实验应在采血后3小时内开始，以确保结果的有效性；然而，血液样本也可在4°C条件下保存超过3小时，并在启动分离程序前恢复至室温。

为确保结果稳定，建议培养基等试剂在开封后一个月内使用，并在过期后丢弃。使用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞时，某些样本中可能会观察到细胞聚集现象。在此情况下，必须用PBS（−）稀释全血样本以防止聚集。在诱导分化为小胶质细胞的过程中，培养基在14天内不进行更换，以避免对细胞造成不必要的刺激。完成诱导分化后，更换新鲜培养基可能有助于恢复活力减弱的细胞，并在一段时间内维持其存活状态。

本研究建立的iMG技术存在一定的局.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	30-5140-5
4% 多聚甲醛	Nacalai Tesque	09154-14
抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液）	gibco	15240-062	描述为 "antibiotic-antimycotic solution"
autoMACS 冲洗液	Miltenyi Biotec	130-091-222	描述为 "basic buffer solution"，并用作 "isolation buffer"
CD11b MicroBeads	Miltenyi Biotec	130–049-601
DAPI 溶液	DOJINDO	28718-90-3
杜氏磷酸盐缓冲液	Nacalai Tesque	14249-24	描述为 "PBS (−)"
胎牛血清	biowest	S1760-500
人 FcR 封闭试剂	Miltenyi Biotec	130–059-901
Leucosep	Greiner Bio-One	227290	描述为 "density gradient centrifugation tube"
MACS LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401	描述为 "magnetic column"
MACS BSA 储存液	Miltenyi Biotec	130-091-376	描述为 "bovine serum albumin (BSA) stock solution"
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	描述为 "magnetic stand"
青霉素-链霉素	Nacalai Tesque	26253–84
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P10144	描述为 "mounting media"
重组人 GM-CSF	R&D Systems	215-GM
重组人 IL-34	R&D Systems	5265-IL
RPMI 1640 培养基 + GlutaMAX 补充剂（预补充培养基）	Thermo Fisher Scientific	61870036	描述为 "basal induction medium"
RPMI-1640	Nacalai Tesque	30264-56
抗体
抗 P2RY12 抗体	Sigma-Aldrich	HPA014518	一抗，兔源，1:100
抗 TMEM119 抗体	Sigma-Aldrich	HPA051870	一抗，兔源，1:100
山羊抗兔 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568	invitrogen	A-11011	二抗，兔源，1:1000