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啮齿类动物下腔静脉球囊血管成形术模型

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DOI：

10.3791/66820

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2024年5月24日

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1Section of Vascular Surgery, Department of Surgery, University of Michigan, 2Surmodics, Inc.

本文内容

摘要

本方案介绍了一种用于在非血栓性、血栓性和血栓后深静脉中测试静脉成形术球囊（VB）干预的存活啮齿动物模型。

摘要

球囊血管成形术是一种常用的临床技术，用于治疗因创伤、先天性解剖异常、急性深静脉血栓形成（DVT）或支架植入所致的深静脉狭窄和闭塞。慢性深静脉阻塞在组织病理学上以血栓形成、纤维化或两者兼有为特征。目前尚无直接针对这些病理过程的治疗方法。因此，建立一种可靠的体内动物模型以测试新型干预手段十分必要。啮齿类动物存活状态下下腔静脉（IVC）球囊血管成形术模型（VBM）可用于在非血栓性和血栓后状态下，于多个时间点研究球囊血管成形术。通过组织、血栓和血液检测方法，如实时聚合酶链式反应（RT-PCR）、蛋白质印迹法（western blot）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、酶谱分析、静脉壁和血栓细胞分析、全血和血浆检测以及组织学分析，可定量评估涂层与非涂层血管成形术球囊的局部和全身效应。该VBM模型具有良好的可重复性，能够模拟人类外科干预操作，可识别静脉壁-血栓蛋白的局部变化，并允许对同一样本进行多种分析，从而减少每组所需的实验动物数量。

引言

未溶解血栓导致的深静脉阻塞是深静脉血栓形成（DVT）的常见后果之一，也是造成血栓后综合征（PTS）的原因之一，每年在医疗上耗费数十亿美元，并显著影响患者生活质量1,2,3。PTS 是一种独特的炎性病理过程，最终导致静脉壁纤维化4，而现有的小型动物 DVT 模型尚不能完全模拟这一病理特征5,6,7，更重要的是，既往模型无法评估治疗干预措施的效果。血栓性静脉阻塞常通过支架置入和球囊静脉成形术进行治疗8,9；然而，由于再狭窄和闭塞的发生率较高，此类干预措施常受到限制10,11,12。

尽管已有用于治疗动脉特异性狭窄/闭塞的药物涂层球囊，但目前尚无针对深静脉的同类产品。静脉再狭窄的分子机制尚不明确，且缺乏直接的治疗方法。4因此，我们的目标是建立一种动物模型，用于通过静脉成形术球囊模拟深静脉血栓后阻塞，以测试局部递送的治疗方法。该模型可再现血栓后状态，并评估不同类型的静脉成形术球囊对静脉壁的影响 体内.

方案

以下实验方案遵循密歇根大学（UMICH）机构动物护理与使用委员会（IACUC）的政策与指南、美国政府关于实验、研究和培训中使用脊椎动物的护理与利用原则以及ARRIVE指南2.0版。密歇根大学动物福利保证协议符合OLAW和美国农业部（USDA）要求，并获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC International）完全认证。本方案已获批准，批准编号为PRO00010841。实验使用来自查尔斯河实验室（Charles River Laboratories）的雄性远交系Sprague Dawley大鼠，体重450 g，年龄15周。

1. 大鼠麻醉

  1. 将动物从笼中取出，放入麻醉前诱导气体室，以0.8至1 L/min（蒸发器控制）的流速，使用5%异氟烷和100%氧气诱导全身麻醉。
  2. 在麻醉诱导室中使大鼠镇静，随后将其从气体室中取出，称重，并用无菌眼膏润滑眼睛，然后将其仰卧置于循环温水加热装置上。通过足底反射（用力捏压脚趾）确认麻醉深度足够。
  3. 使用电动剪刀剃除腹部腹侧的毛发。通过鼻罩连接非重复呼吸回路，以0.8至1 L/min的流速、2.5%异氟烷和100%氧气维持全身麻醉。

2. 大鼠超声扫描

  1. 在成像过程中监测生理指标，包括呼吸频率、心率和体温。
  2. 进行下腔静脉（IVC）腹部成像时，涂抹导电凝胶并将探头置于横切面位置。在预设外周血管模式后，使用二维成像模式（B模式），将线性探头（10 MHz）置于腹部中央，通过施加压力调整深度，直至腹腔血管清晰可见。
  3. 使用高频线性探头（10 MHz），结合彩色多普勒和脉冲波多普勒模式，通过评估可压缩性和血流特征来区分下腔静脉与腹主动脉。
    1. 使用超声探头施加压力时，可通过可压缩性进行鉴别：下腔静脉可被压缩，而腹主动脉则保持其形态和通畅性。
  4. 使用彩色多普勒和脉冲波多普勒评估血流方向和速度。彩色多普勒图像中，朝向探头的血流显示为红色，远离探头的血流显示为蓝色。将仪器切换至脉冲波多普勒模式（双功模式），以评估随时间变化的血流方向和速度。使用超声设备的自动图像捕获工具获取必要的血流图像（不同超声系统的图像采集具体参数可能有所差异）。
    1. 采用以下评估方法：腹主动脉的血流朝向探头，呈三相波形；而下腔静脉的血流为自发性远离探头，且波幅明显较低。
    2. 若近端下腔静脉显示正常波形，但在远端检测到无相位变化或缺失（平坦）的波形，应考虑两点之间存在静脉阻塞的可能性。
  5. 定位下腔静脉后，识别其中段部分，即位于肾静脉下方与下腔静脉分叉处上方的中三分之一段，此区域最可能包含腰静脉。
  6. 在横切面下，利用横断面B模式图像测量中段下腔静脉的壁间直径，记录血管的最大直径。不同超声设备的图像采集方式可能有所差异。使用光盘（CD）以DICOM文件格式存储数据。

3. 大鼠显微手术与术后恢复

  1. 使用浸有氯己定擦拭液和氯己定溶液的纱布对腹部进行三次清洁，以确保无菌手术条件。皮下注射0.65 mg/kg的缓释型布托啡诺注射混悬液作为大鼠镇痛剂，因其不会干扰用于蛋白质分析的炎症分子生物标志物检测面板。
  2. 将灭菌保鲜膜作为手术覆盖物，包裹大鼠胸腹部区域、显微镜旋钮（放大与聚焦）及目镜。
  3. 使用虹膜剪在剑突下方约2 cm处沿腹正中线做一长约3 cm的切口，切开皮肤和腹壁，暴露腹腔内容物。用无菌生理盐水浸湿的2英寸×2英寸纱布将肠管推向动物右侧。
  4. 为暴露下腔静脉（IVC），使用无菌棉签进行钝性分离。在切口中放置金属拉钩，以便观察下腔静脉。
  5. 从肾静脉至髂总动脉分叉处，使用低温精细电凝笔烧灼所有下腔静脉腰支，并用7-0不可吸收聚丙烯缝线结扎侧支血管。
  6. 在下腔静脉近端（与主动脉分离，位于肾静脉稍下方）放置一个弧形血管微夹；在远端下腔静脉（与主动脉分离，位于下腔静脉分叉上方）放置一个直形微夹。
  7. 在左肾静脉尾侧、下腔静脉前壁正中位置，缝合一针8-0尼龙U形缝线。
  8. 将一根0.014 mm的尖端导丝预先穿入血管成形球囊导管内，逆血流方向经微夹远端插入肾下段下腔静脉。
  9. 采用Seldinger技术将球囊推进至下腔静脉中段。取出尖端导丝后，使用20 mL注气注射器对血管成形球囊充气3分钟，产生0–30 Atm范围内的正压，使下腔静脉扩张10%至15%。在进行下腔静脉插管前，所有系统均需用无菌生理盐水冲洗，以防空气栓塞。
    注意：直径为2.8 mm的下腔静脉将扩张至3.22 mm（15%过度扩张）。达到所需扩张程度所需的充气压力取决于球囊特性，相关信息可在制造商包装上查得。
  10. 在血管成形球囊放气并拔出后，收紧U形缝线。移除微夹。
  11. 以两层缝合法关闭剖腹切口。使用5-0合成可吸收聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Polyglactin）缝线连续缝合腹壁和皮肤。
  12. 将大鼠置于单独笼具中恢复，在术后30分钟内于加热灯下观察（加热灯与笼具最小距离为24英寸），随后送回原饲养单元。
  13. 对于各实验组的假手术动物，仅进行解剖操作，不实施下腔静脉分支结扎、电凝或插管。
  14. 对于血栓后状态模型，在下腔静脉近端（与主动脉分离，位于肾静脉稍下方）放置一直形血管微夹，持续24小时。采用相同的解剖与缝合技术。
    1. 通过超声检查确认下腔静脉闭塞征象，包括可见下腔静脉夹、远端下腔静脉无血流信号以及髂总静脉扩张。随访时间点可根据研究设计个性化设定。
    2. 为观察所模拟的生理变化，建议在术后前72小时内选择时间点以观察早期血栓形成，并在术后3至7天选择时间点以观察后期血栓消退。本模型中已验证的后期时间点包括术后7至28天5,13。
  15. 对血栓后状态进行球囊血管成形术时，采用步骤3.5–3.9所述技术，但需注意：由于血栓后状态下下腔静脉直径增大，可能需要更高的充气压力才能实现目标扩张程度。
  16. 根据美国兽医协会（AVMA）现行《啮齿类动物安乐死指南》推荐的方法实施安乐死，须采用两种确认方式（放血和重要器官摘除），以确保动物不会复苏。

散点图显示大鼠体重与下腔静脉直径的相关性；R²=0.3250，统计分析结果。
图1：经腹双功能超声测量的下腔静脉（肾下段横截面）直径分布情况。 数据按动物体重进行分组。体重与下腔静脉直径之间未发现显著相关性。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 样品制备

  1. 采用高效液相色谱法（HPLC）检测技术对药物涂层血管成形球囊进行确证性组织转移实验。
  2. 解剖下腔静脉和主动脉并移除 整块 用于福尔马林固定石蜡包埋及组织学分析。
  3. 用于蛋白质分析时，使用稀释浓度的 RIPA 缓冲液 60,000 µg/g 样品，在低温环境下使用组织匀浆器处理 4 °C，并于 -80 °C 处理后

结果

静脉球囊模型（VBM）是一种用于评估静脉成形球囊在完全止血控制中作用的模型。首先，我们测量了下腔静脉（IVC）中段肾下部分的直径，如图1所示，以确定合适的球囊尺寸。其次，图图2展示了所建立的逐步显微外科技术，同时我们在图3中展示了关键步骤的示例。请注意，下腔静脉插管时采用逆行入路，并使用了尖端加硬的导丝。

剖腹手术示意图：动物准备、解剖、下腔静脉暴露和血管结扎步骤。
图2：在大鼠中测试血管成形术球囊的显微外科技术。此处描述了所使用的技术。请点击此处查看该图的放大版本。

用于心血管的带针持、夹子和雷帕霉素涂层球囊的手术示意图。
图3：体内球囊置入技术图像。（A）止血控制。（B）下腔静脉肾下段U形缝合。（C）通过U形缝合置入导丝，并使用3 mm雷帕霉素涂层球囊。（D）逆行球囊静脉成形术置入（雷帕霉素涂层）。缩写：IVC = 下腔静脉；AO = 主动脉；CBV = 涂层球囊静脉成形术。请点击此处查看该图的放大版本。

其他正常的静脉血管测量值以及下腔静脉与主动脉之间的区别见图4。血栓的超声表现见图5。最后，可在图6中观察到术前超声测量与血栓形成后测量的直径比较。下腔静脉在血管夹闭合前后脉冲波多普勒血流速度的平均值（mm/s）见图7。

超声成像；尺寸测量、血流分析；多普勒、灰阶；医学诊断工具。
图 4：经腹双功能超声图像，包含下腔静脉横径测量示例。 （A）近端下腔静脉。（B）中段肾下水平下腔静脉。（C）远端下腔静脉。彩色多普勒分析：（D）中段肾下水平下腔静脉和（E）腹主动脉。请点击此处查看该图的放大版本。

下腔静脉夹闭置入的超声成像示意图，显示夹闭前后血管血流评估。
图5。显示夹闭前和夹闭后图像的示意图。（A）夹闭后超声检查结果，证实下腔静脉闭塞。（B）近端和远端主动脉血流。（C）近端下腔静脉血流。（D）髂总静脉。请点击此处查看该图的放大版本。

夹子放置前后血流的超声图像；下腔静脉和主动脉视图，速度分析。
图6．超声图像。夹子放置前及放置后15分钟、30分钟和45分钟的超声变化，证实下腔静脉阻塞。请点击此处查看该图的放大版本。

比较假手术组与夹闭组下腔静脉血流速度（mm/s）的柱状图，已进行统计学分析
图7：平均脉冲波多普勒血流速度。 夹闭前与夹闭后下腔静脉的平均血流速度（mm/s）（**：P ≤ 0.01，采用Mann-Whitney检验）。误差线表示标准误。请点击此处查看该图的放大版本。

为了分析不同新型涂层静脉成形术干预的效果，我们建议检测能够体现目标药物作用的效应蛋白。对于本研究中使用的西罗莫司涂层静脉成形球囊，我们检测了大鼠下腔静脉（IVC）裂解液中磷酸化AKT（p-AKT）蛋白水平，以确认mTOR通路的抑制作用，因为p-AKT是西罗莫司作用下游的蛋白，其表达水平会随西罗莫司的作用而降低14,15。从图8中可以观察到，在接受涂层球囊静脉成形术（CBV）后，p-AKT水平相较于假手术组显著降低。

p-AKT 水平的柱状图；假手术组与 CBV 组的数据及统计学显著性。
图 8：p-AKT 蛋白水平。 在正常条件下，假手术组与覆药球囊静脉成形术（CBV）组大鼠下腔静脉裂解液中 p-AKT 蛋白水平，证实使用西罗莫司涂层球囊进行静脉成形术可抑制 mTOR 通路，产生靶向效应。（**：P ≤ 0.01，采用 Mann-Whitney 检验）。误差线表示标准误。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

对于体重≥250 g的大鼠，可使用直径为2.5–3.5 mm范围内的球囊进行VBM操作。对于体重超过750 g的大鼠，该技术的限制因素主要是腹腔内脂肪组织较多和器官体积较大，而非下腔静脉（IVC）直径的变化。根据我们的经验，为了在静脉壁蛋白分析、活性检测及组织学分析中获得组间统计学显著性，每组需要10只或更多动物。在手术过程中，定期监测体温和呼吸频率对于确保操作成功至关重要，同时术后精心管理也十分关键。

VBM 是一种安全且可重复的方法（91次操作中有83次成功，存活率为91.2%），平均操作时间为30分钟。与操作相关的并发症包括麻醉并发症（1%，1/91）、阿片类药物不良反应（1%，1/91）、出血（2.1%，2/91）和血栓形成（4.3%，4/91）。在模型开发过程中，采用经下腔静脉（IVC）逆行插管技术，将插管点置于肾下腔静脉附近，从而增大导丝插入角度，减少腹腔器官干扰，显著降低了下腔静脉出血的发生率。此外，在导丝插入和充气阶段，建议配备一名手术助手，以确保施加的压力、充气时间以及锐利导丝的回撤操作准确无误。在放气后，必须正确回收静脉成形球囊，防止在插入点处撕裂下腔静脉壁。压力测量需严格遵循制造商的指导，以避免球囊过度膨胀或破裂。上述措施共同促进了操作的稳定性，减少了出血并发症，提高了动物存活率。

以下预防措施也可减轻下腔静脉出血。首先，确认背部分支已完全电凝，侧支已结扎。这还能确保基于先前啮齿类动物下腔静脉结扎-淤血分析的研究结果具有可重复性5,16,17。其次，使用近端和远端夹闭夹确认正确闭合，以确保完全的止血控制。最后，在移除下腔静脉夹之前，确认球囊取出后U形缝线已完全闭合。如果出现出血， 通常用棉签轻轻按压下腔静脉直至实现止血，即可停止出血。若仍有出血，可使用其他止血剂，如可吸收明胶粉末。

如果球囊扩张、回缩以及U形缝合关闭时间少于5分钟，血栓形成并发症应可降至最低。必要时可给予抗凝治疗。迄今为止，尚无完全经皮的方法可模拟目前在人体中进行的微创球囊静脉成形术。入路血管（大鼠股静脉）的尺寸明显更小（平均0.81 mm）18，小于完全经血管内操作所需最小商用4F鞘管的外径（1.61 mm）。该方法的局限性包括需要熟练的显微外科医生以及需要专用设备。

综上所述，VBM 模型能够紧密模拟深静脉血栓形成后下腔静脉成形术的临床情况。该模型是研究不同药物干预方案下，经多个时间点观察成形术球囊对下腔静脉内血管作用效果的重要工具。该技术未来的应用包括其他医疗器械的临床前测试，如支架、血栓切除导管、球囊涂层以及新型药物治疗手段。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究由美国静脉论坛（AVF）2023年基础科学研究基金和Surmodics公司资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-0 DemeCRYLDemeTechG183019F4P每盒12个
5-0 DemeCRYLDemeTechG285017B0P每盒12个
7-0 DemeLENEDemeTechPM197011F13M每盒12个
8-0 DemeLONDemeTechNL868007C7P每盒12个
斜角夹施加器SCANLAN3795-01A7-1/4″ (18.5 cm)
Baxter 0.9% 氯化钠灌洗瓶巴克斯特货号：195-71241000 mL 瓶
博维电凝器低温精细尖头Symmetry Surgical IncAA0010/bx
布托啡诺Fidelis 动物健康SKU- 0991141.3 mg/mL，3 mL
CD（Sprague Dawley）大鼠查尔斯河实验室菌株编号 001雄性，400 克
Clip-It 可追踪计时器可追溯产品货号 5046
棉签 applicator 3"Dukal Corporation922-00037BX1001000/盒
酶解型外科器械清洁剂与预浸泡液MedlineMDS88000B91 单位
眼用润滑剂OptixcareSKU-06544120克 
Gaymar T/Pump Stryker 局部加温/降温治疗系统StrykerTP700
海费茨微型夹 12 mm × 2.25 mmSCANLAN3795-20直的
Heifetz 微型夹 12 mm × 2.25 mmSCANLAN3795-28弯曲的
Heifetz 微型夹 8 mm × 1.75 mm SCANLAN3795-14直的
Heifetz 微型夹 8 mm × 1.75 mm SCANLAN3795-18弯曲的
充气装置 Merit MedicalIN4130带模拟显示屏的BasixCOMPAK
异氟烷MFR VETONESKU-501017100 mL，吸入用液体
显微外科手术器械包，包含镊子和持针钳定制化
氧气，E型气罐MedlineMDM1630
尖端导丝定制化
无菌Glad保鲜膜格拉德货号 # PSS-140ETO暴露
无菌非织造纱布垫 2片装 4层 4英寸×4英寸 MedlineSKU PRM21444H100Ct
手术显微镜 ZeissS100 / OPMI pico
外科洗手 &和手洗VetoquinolNDC：17030-003-1616 盎司
超声耦合剂MedlineCTR0013058.5 盎司，每箱 12 罐
超声系统西门子ACUSON Antares三维、彩色、连续波（CW）、脉冲波（PW）、功率连续波/连续波频谱
球囊血管成形术定制化

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