啮齿类动物下腔静脉球囊血管成形术模型

摘要

本方案介绍了一种用于在非血栓性、血栓性和血栓后深静脉中测试静脉成形术球囊（VB）干预的存活啮齿动物模型。

摘要

球囊血管成形术是一种常用的临床技术，用于治疗因创伤、先天性解剖异常、急性深静脉血栓形成（DVT）或支架植入所致的深静脉狭窄和闭塞。慢性深静脉阻塞在组织病理学上以血栓形成、纤维化或两者兼有为特征。目前尚无直接针对这些病理过程的治疗方法。因此，建立一种可靠的体内动物模型以测试新型干预手段十分必要。啮齿类动物存活状态下下腔静脉（IVC）球囊血管成形术模型（VBM）可用于在非血栓性和血栓后状态下，于多个时间点研究球囊血管成形术。通过组织、血栓和血液检测方法，如实时聚合酶链式反应（RT-PCR）、蛋白质印迹法（western blot）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、酶谱分析、静脉壁和血栓细胞分析、全血和血浆检测以及组织学分析，可定量评估涂层与非涂层血管成形术球囊的局部和全身效应。该VBM模型具有良好的可重复性，能够模拟人类外科干预操作，可识别静脉壁-血栓蛋白的局部变化，并允许对同一样本进行多种分析，从而减少每组所需的实验动物数量。

引言

未溶解血栓导致的深静脉阻塞是深静脉血栓形成（DVT）的常见后果之一，也是造成血栓后综合征（PTS）的原因之一，每年在医疗上耗费数十亿美元，并显著影响患者生活质量^1,2,3。PTS 是一种独特的炎性病理过程，最终导致静脉壁纤维化⁴，而现有的小型动物 DVT 模型尚不能完全模拟这一病理特征^5,6,7，更重要的是，既往模型无法评估治疗干预措施的效果。血栓性静脉阻塞常通过支架置入和球囊静脉成形术进行治疗^8,9；然而，由于再狭窄和闭塞的发生率较高，此类干预措施常受到限制^10,11,12。

尽管已有用于治疗动脉特异性狭窄/闭塞的药物涂层球囊，但目前尚无针对深静脉的同类产品。静脉再狭窄的分子机制尚不明确，且缺乏直接的治疗方法。⁴因此，我们的目标是建立一种动物模型，用于通过静脉成形术球囊模拟深静脉血栓后阻塞，以测试局部递送的治疗方法。该模型可再现血栓后状态，并评估不同类型的静脉成形术球囊对静脉壁的影响 体内.

方案

以下实验方案遵循密歇根大学（UMICH）机构动物护理与使用委员会（IACUC）的政策与指南、美国政府关于实验、研究和培训中使用脊椎动物的护理与利用原则以及ARRIVE指南2.0版。密歇根大学动物福利保证协议符合OLAW和美国农业部（USDA）要求，并获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC International）完全认证。本方案已获批准，批准编号为PRO00010841。实验使用来自查尔斯河实验室（Charles River Laboratories）的雄性远交系Sprague Dawley大鼠，体重450 g，年龄15周。

1. 大鼠麻醉

1. 将动物从笼中取出，放入麻醉前诱导气体室，以0.8至1 L/min（蒸发器控制）的流速，使用5%异氟烷和100%氧气诱导全身麻醉。
2. 在麻醉诱导室中使大鼠镇静，随后将其从气体室中取出，称重，并用无菌眼膏润滑眼睛，然后将其仰卧置于循环温水加热装置上。通过足底反射（用力捏压脚趾）确认麻醉深度足够。
3. 使用电动剪刀剃除腹部腹侧的毛发。通过鼻罩连接非重复呼吸回路，以0.8至1 L/min的流速、2.5%异氟烷和100%氧气维持全身麻醉。

2. 大鼠超声扫描

1. 在成像过程中监测生理指标，包括呼吸频率、心率和体温。
2. 进行下腔静脉（IVC）腹部成像时，涂抹导电凝胶并将探头置于横切面位置。在预设外周血管模式后，使用二维成像模式（B模式），将线性探头（10 MHz）置于腹部中央，通过施加压力调整深度，直至腹腔血管清晰可见。
3. 使用高频线性探头（10 MHz），结合彩色多普勒和脉冲波多普勒模式，通过评估可压缩性和血流特征来区分下腔静脉与腹主动脉。
   1. 使用超声探头施加压力时，可通过可压缩性进行鉴别：下腔静脉可被压缩，而腹主动脉则保持其形态和通畅性。
4. 使用彩色多普勒和脉冲波多普勒评估血流方向和速度。彩色多普勒图像中，朝向探头的血流显示为红色，远离探头的血流显示为蓝色。将仪器切换至脉冲波多普勒模式（双功模式），以评估随时间变化的血流方向和速度。使用超声设备的自动图像捕获工具获取必要的血流图像（不同超声系统的图像采集具体参数可能有所差异）。
   1. 采用以下评估方法：腹主动脉的血流朝向探头，呈三相波形；而下腔静脉的血流为自发性远离探头，且波幅明显较低。
   2. 若近端下腔静脉显示正常波形，但在远端检测到无相位变化或缺失（平坦）的波形，应考虑两点之间存在静脉阻塞的可能性。
5. 定位下腔静脉后，识别其中段部分，即位于肾静脉下方与下腔静脉分叉处上方的中三分之一段，此区域最可能包含腰静脉。
6. 在横切面下，利用横断面B模式图像测量中段下腔静脉的壁间直径，记录血管的最大直径。不同超声设备的图像采集方式可能有所差异。使用光盘（CD）以DICOM文件格式存储数据。

3. 大鼠显微手术与术后恢复

1. 使用浸有氯己定擦拭液和氯己定溶液的纱布对腹部进行三次清洁，以确保无菌手术条件。皮下注射0.65 mg/kg的缓释型布托啡诺注射混悬液作为大鼠镇痛剂，因其不会干扰用于蛋白质分析的炎症分子生物标志物检测面板。
2. 将灭菌保鲜膜作为手术覆盖物，包裹大鼠胸腹部区域、显微镜旋钮（放大与聚焦）及目镜。
3. 使用虹膜剪在剑突下方约2 cm处沿腹正中线做一长约3 cm的切口，切开皮肤和腹壁，暴露腹腔内容物。用无菌生理盐水浸湿的2英寸×2英寸纱布将肠管推向动物右侧。
4. 为暴露下腔静脉（IVC），使用无菌棉签进行钝性分离。在切口中放置金属拉钩，以便观察下腔静脉。
5. 从肾静脉至髂总动脉分叉处，使用低温精细电凝笔烧灼所有下腔静脉腰支，并用7-0不可吸收聚丙烯缝线结扎侧支血管。
6. 在下腔静脉近端（与主动脉分离，位于肾静脉稍下方）放置一个弧形血管微夹；在远端下腔静脉（与主动脉分离，位于下腔静脉分叉上方）放置一个直形微夹。
7. 在左肾静脉尾侧、下腔静脉前壁正中位置，缝合一针8-0尼龙U形缝线。
8. 将一根0.014 mm的尖端导丝预先穿入血管成形球囊导管内，逆血流方向经微夹远端插入肾下段下腔静脉。
9. 采用Seldinger技术将球囊推进至下腔静脉中段。取出尖端导丝后，使用20 mL注气注射器对血管成形球囊充气3分钟，产生0–30 Atm范围内的正压，使下腔静脉扩张10%至15%。在进行下腔静脉插管前，所有系统均需用无菌生理盐水冲洗，以防空气栓塞。
   注意：直径为2.8 mm的下腔静脉将扩张至3.22 mm（15%过度扩张）。达到所需扩张程度所需的充气压力取决于球囊特性，相关信息可在制造商包装上查得。
10. 在血管成形球囊放气并拔出后，收紧U形缝线。移除微夹。
11. 以两层缝合法关闭剖腹切口。使用5-0合成可吸收聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Polyglactin）缝线连续缝合腹壁和皮肤。
12. 将大鼠置于单独笼具中恢复，在术后30分钟内于加热灯下观察（加热灯与笼具最小距离为24英寸），随后送回原饲养单元。
13. 对于各实验组的假手术动物，仅进行解剖操作，不实施下腔静脉分支结扎、电凝或插管。
14. 对于血栓后状态模型，在下腔静脉近端（与主动脉分离，位于肾静脉稍下方）放置一直形血管微夹，持续24小时。采用相同的解剖与缝合技术。
    1. 通过超声检查确认下腔静脉闭塞征象，包括可见下腔静脉夹、远端下腔静脉无血流信号以及髂总静脉扩张。随访时间点可根据研究设计个性化设定。
    2. 为观察所模拟的生理变化，建议在术后前72小时内选择时间点以观察早期血栓形成，并在术后3至7天选择时间点以观察后期血栓消退。本模型中已验证的后期时间点包括术后7至28天^5,13。
15. 对血栓后状态进行球囊血管成形术时，采用步骤3.5–3.9所述技术，但需注意：由于血栓后状态下下腔静脉直径增大，可能需要更高的充气压力才能实现目标扩张程度。
16. 根据美国兽医协会（AVMA）现行《啮齿类动物安乐死指南》推荐的方法实施安乐死，须采用两种确认方式（放血和重要器官摘除），以确保动物不会复苏。

图1：经腹双功能超声测量的下腔静脉（肾下段横截面）直径分布情况。 数据按动物体重进行分组。体重与下腔静脉直径之间未发现显著相关性。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 样品制备

1. 采用高效液相色谱法（HPLC）检测技术对药物涂层血管成形球囊进行确证性组织转移实验。
2. 解剖下腔静脉和主动脉并移除 整块 用于福尔马林固定石蜡包埋及组织学分析。
3. 用于蛋白质分析时，使用稀释浓度的 RIPA 缓冲液 60,000 µg/g 样品，在低温环境下使用组织匀浆器处理 4 °C，并于 -80 °C 处理后

结果

静脉球囊模型（VBM）是一种用于评估静脉成形球囊在完全止血控制中作用的模型。首先，我们测量了下腔静脉（IVC）中段肾下部分的直径，如图1所示，以确定合适的球囊尺寸。其次，图图2展示了所建立的逐步显微外科技术，同时我们在图3中展示了关键步骤的示例。请注意，下腔静脉插管时采用逆行入路，并使用了尖端加硬的导丝。

图2：在大鼠中测试血管成形术球囊的...

讨论

对于体重≥250 g的大鼠，可使用直径为2.5–3.5 mm范围内的球囊进行VBM操作。对于体重超过750 g的大鼠，该技术的限制因素主要是腹腔内脂肪组织较多和器官体积较大，而非下腔静脉（IVC）直径的变化。根据我们的经验，为了在静脉壁蛋白分析、活性检测及组织学分析中获得组间统计学显著性，每组需要10只或更多动物。在手术过程中，定期监测体温和呼吸频率对于确保操作成功至关重要，同时术后精心管理也十分关键。

VBM 是一种安全且可重复的方法（91次操作中有83次成功，存活率为91.2%），平均操作时间为30分钟。与操作相关的并发症包括麻醉并发症（1%，1/91）、阿片类药物不良反应（1%，1/91）、出血（2.1%，2/91）和血栓形成（4.3%，4/91）。在模型开发过程中，采用经下腔静脉（IVC）逆行插管技术，将插管点置于肾下腔静脉附近，从而增大导丝插入角度，减少腹腔器官干扰，显著降低了下腔静脉出血的发生率。此外，在导丝插入和充气阶段，建议配备一名手术助手，以确保施加的压力、充气时间以及锐利导丝的回撤操作准确无误。在放气后，必须正确回收静脉成形球囊，防止在插入点处撕裂下腔静脉壁。压...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-0 DemeCRYL	DemeTech	G183019F4P	每盒12个
5-0 DemeCRYL	DemeTech	G285017B0P	每盒12个
7-0 DemeLENE	DemeTech	PM197011F13M	每盒12个
8-0 DemeLON	DemeTech	NL868007C7P	每盒12个
斜角夹施加器	SCANLAN	3795-01A	7-1/4″ (18.5 cm)
Baxter 0.9% 氯化钠灌洗瓶	巴克斯特	货号：195-7124	1000 mL 瓶
博维电凝器低温精细尖头	Symmetry Surgical Inc	AA00	10/bx
布托啡诺	Fidelis 动物健康	SKU- 099114	1.3 mg/mL，3 mL
CD（Sprague Dawley）大鼠	查尔斯河实验室	菌株编号 001	雄性，400 克
Clip-It 可追踪计时器	可追溯产品	货号 5046
棉签 applicator 3"	Dukal Corporation	922-00037BX100	1000/盒
酶解型外科器械清洁剂与预浸泡液	Medline	MDS88000B9	1 单位
眼用润滑剂	Optixcare	SKU-065441	20克
Gaymar T/Pump Stryker 局部加温/降温治疗系统	Stryker	TP700
海费茨微型夹 12 mm × 2.25 mm	SCANLAN	3795-20	直的
Heifetz 微型夹 12 mm × 2.25 mm	SCANLAN	3795-28	弯曲的
Heifetz 微型夹 8 mm × 1.75 mm	SCANLAN	3795-14	直的
Heifetz 微型夹 8 mm × 1.75 mm	SCANLAN	3795-18	弯曲的
充气装置	Merit Medical	IN4130	带模拟显示屏的BasixCOMPAK
异氟烷	MFR VETONE	SKU-501017	100 mL，吸入用液体
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手术显微镜	Zeiss	S100 / OPMI pico
外科洗手 &和手洗	Vetoquinol	NDC：17030-003-16	16 盎司
超声耦合剂	Medline	CTR001305	8.5 盎司，每箱 12 罐
超声系统	西门子	ACUSON Antares	三维、彩色、连续波（CW）、脉冲波（PW）、功率连续波/连续波频谱
球囊血管成形术	定制化