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评估大鼠单侧颈段脊髓半切术后呼吸性膈肌功能的恢复

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DOI：

10.3791/66828

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2024年6月14日

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1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Mayo Clinic

本文内容

摘要

呼吸系统并发症是颈段脊髓损伤（cSCI）患者死亡的首要原因。cSCI的动物模型对于机制评估和临床前研究至关重要。本文介绍了一种可重复的方法，用于评估大鼠单侧C2脊髓半切（C2SH）后膈肌（DIAm）功能活动的恢复情况。

摘要

脊髓损伤（cSCI）后，膈肌激活（DIAm）的激活可能因损伤程度不同而受到影响。本文描述了一种单侧C2 半切术（C2SH）模型，该模型会破坏大鼠呼吸过程中同侧膈肌（iDIAm）的正常呼吸电活动（EMG）。为评估膈肌（DIAm）运动控制的恢复情况，需明确由C引起的功能缺损程度2必须首先明确脊髓休克（SH）的存在。通过验证在呼吸过程中膈肌（iDIAm）肌电图（EMG）出现完全的初始性消失，可将后续的恢复情况分类为无恢复或有恢复，并可通过EMG振幅评估恢复的程度。此外，通过测量在颈段脊髓损伤后急性脊髓休克期结束后呼吸过程中iDIAm EMG活动是否持续缺失，2SH，初始C的成功2SH 可通过测量对侧膈肌（cDIAm）的肌电图（EMG）活动来验证，以获取关于 C 代偿效应的信息2SH，同样反映了神经可塑性。此外，清醒动物的膈肌（DIAm）肌电图（EMG）记录可提供关于脊髓损伤（SCI）后DIAm运动控制的重要生理学信息2SH。本文描述了一种严格、可重复且可靠的C2用于研究呼吸神经可塑性、代偿性膈肌辅助肌活动以及治疗策略和药物的优秀平台——大鼠cSCI的SH模型。

引言

美国有超过 30 万名脊髓损伤（SCI）患者，其中约一半为颈段损伤1。这些损伤导致患者生活质量显著下降，并给患者个人、家庭以及医疗系统带来沉重的经济负担。幸运的是，大多数脊髓损伤属于不完全性损伤——这为残存神经通路的强化提供了可能1。这种神经可塑性可能有助于恢复部分功能，包括膈肌运动神经元（DIAm）的活动，而后者对呼吸及非呼吸行为均具有重要意义。因此，促进神经可塑性是帮助脊髓损伤患者的一个极具前景的研究方向2。

脊髓损伤（SCI）的啮齿类动物模型在发现改善人类健康治疗方法方面具有巨大潜力。用于研究神经可塑性的经典SCI模型之一是在C2水平对脊髓进行单侧横断（半切，C2SH），该模型保留对侧脊髓组织完整3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。C2SH对膈神经输出的影响以及保留对侧通路的重要性最早由Porter在一百多年前揭示12，其开创性文章为现代呼吸神经可塑性研究奠定了基础。C2SH模型中断了延髓头端腹侧呼吸群（rVRG）向下的输入，rVRG包含负责传递呼吸节律生成输出的前运动神经元14。这些rVRG前运动神经元还向膈肌运动神经元传递兴奋性神经驱动（图1）。多位研究者对C2SH模型采用了不同的操作方法10,11,15,16，这可能部分解释了不同研究中恢复程度的差异。简而言之，这些方法在是否保留背侧索、是否进行完全半切，或是否进行不完全中断同侧rVRG下行输入的侧向部分横断方面有所不同。通常情况下，C2SH模型特别适用于研究呼吸神经可塑性，因为随着时间推移，自主呼吸时膈肌（iDIAm）肌电图（EMG）活动可出现自发性恢复，且该恢复过程可被多种因素增强，包括神经营养信号通路的激活17,18,19,20,21。然而，在明确分类恢复之前，必须首先确认功能的初始丧失——即自主呼吸iDIAm EMG活动的沉默。但在一些研究中，并未在C2SH手术时验证这种失活状态3,4,6,7,11,22,23。

对切除的脊髓进行组织学评估仅能提供证据，表明同侧兴奋性球脊髓通路（支配脊髓内的膈运动神经元）在相应位置受到了损伤，但组织学证据不能替代生理学证据（例如膈肌肌电图，DIAm EMG）。此外，组织学评估是在 离体 在终末时间点（通常为损伤后数周至数月）以及因此s 不提供 "实时" 一些研究者指出，病灶的大小与功能缺损的程度或缺损的有无相关。5,24,25,26需要注意的是，此类主张的有效性可能在很大程度上取决于具体评估方式 "功能" 被分类（即功能任务的具体内容及其量化方式），而不同研究间的差异凸显了在动物间制造功能上完全相同损伤的困难。事实上，研究者们已强调，损伤程度与肢体肌肉运动功能（通过Basso、Beattie和Bresnahan（BBB）评分进行量化）之间的关系24）不是线性的27,28在之前的研究中，我们未发现 C 的程度与之存在任何关系2SH 及损伤后正常呼吸 iDIAm EMG 活性的恢复程度10,29,30,31，尽管其他研究者已报道通气功能与白质保留程度之间存在关联5因此，在C的情况下2SH模型是一种在手术时以及在慢性脊髓损伤实验的时间进程中尽早验证iDIAm失活功能的方法，既有益又必要。

本文强调了使用膈肌肌电图（DIAm EMG）实时确认颈髓损伤（C）后呼吸过程中膈肌肌电活动首次消失的应用2SH 以及损伤后 3 天（第 3 天）的后续确证性评估18,21,31,32,33. 在早期与 C 的研究中2SH 模型中，通过重复开腹手术记录膈肌 EMG10,13,30,34然而，近期的研究采用了慢性肌电图电极，可实现对麻醉和清醒大鼠的肌电图记录。此外，慢性电极降低了气胸风险，且无需反复进行剖腹手术，从而避免了因反复手术可能引起的膈肌（DIAm）功能抑制。35,36. 尽管存在多种版本的 C2SH 模型已被许多研究者使用，但在手术时并未验证 iDIAm 活性的沉默情况3,4,6,7,11,22,23若无此类失活确认，则难以确定后续功能恢复中有多少应归因于同侧与对侧通路的神经可塑性，而这两者可能具有不同的影响。这一问题尤为重要，因为从rVRG到膈肌运动神经元的吸气神经驱动主要为同侧性，当C2SH33然而，仍存在来自对侧rVRG的兴奋性吸气输入，这些输入在损伤部位下方交叉，支配同侧膈肌运动神经元，并可被增强 通过 神经可塑性以促进功能恢复。通过消除对膈肌运动神经元的主要同侧兴奋性输入，自主呼吸时的同侧膈肌（iDIAm）肌电活动消失（至少在麻醉状态下），而对侧膈肌（cDIAm）的活动则持续存在甚至增强。因此，呼吸过程中iDIAm肌电活动的丧失是脊髓损伤（C2SH (图2).

在清醒动物中，早在C2SH术后1-4天即可检测到一定程度的膈肌（iDIAm）肌电活动23,37。此外，在去大脑动物中，高位颈段半切术后数分钟至数小时内即可出现iDIAm活动，且该活动可被麻醉所抑制38。此外，通过在损伤后第3天麻醉状态下大鼠呼吸（正常通气）期间确认iDIAm肌电活动的缺失，可验证C2SH手术的成功。共聚焦成像研究证实，在损伤初期，膈神经运动神经元上的谷氨酸能突触输入已丧失37。在损伤后第3天，若仍存在任何残余的正常通气iDIAm肌电活动，则提示来自同侧延髓腹外侧呼吸组（rVRG）的下行吸气驱动未完全切除。本文分为三个部分：（1）慢性DIAm肌电记录，（2）C2SH手术，以及（3）清醒与麻醉动物中的肌电信号采集。本方案描述了一种严格、可重复且可靠的C2SH大鼠慢性脊髓损伤（cSCI）模型，是研究呼吸神经可塑性、代偿性对侧膈肌（cDIAm）活动以及治疗策略和药物干预的理想平台。

方案

本方案已获得梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee）批准（方案编号：A00003105-17-R23）。本研究所用动物为约3月龄、体重在200 g至350 g之间的雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠。研究中所用试剂和设备的详细信息见《材料表》（Table of Materials）。

1. 电极植入

  1. 准备电极
    1. 确保备齐以下设备：（1）多股不锈钢丝，（2）带#11刀片的手术刀，（3）剪刀，（4）解剖显微镜，（5）直尺，（6）镊子，（7）25 G针头，（8）2把钳子（其中至少一把带有压接区域）。
    2. 电极制备过程的详细步骤如图3所示。为成对差分记录电极，至少重复此过程两次。
    3. 首先，测量并截取18 cm长的不锈钢丝。
    4. 在不锈钢丝一端距末端4 cm处打一个基本的单结，如图3所示；当导线短端植入并缝合至膈肌（DIAm）时，该结将起到锚定作用。
    5. 使用手术刀和外科解剖显微镜，小心剥离靠近短端导线结处2 mm的绝缘层。务必注意不要切断多股导线中的任何一股。
      注：此裸露部分作为电极的导电表面。通常，若不慎切断三股或更多股导线，信号质量将开始下降，此时应更换电极。
    6. 接下来，剥离导线短端末端约5 mm的绝缘层，然后将其插入25 G针头的管腔中，制成类似缝合线的工具，用于将电极植入DIAm。
      注：根据个人偏好，也可使用更高规格的针头（例如高达28 G）。由于高规格针头直径更细，可能降低气胸风险。但同时，将多股导线插入更细针头管腔的难度也可能增加。
    7. 为此，从包装中取出一个25 G针头，用两把钳子在距锋利斜面端约1 cm处反复从侧面弯折，直至其断裂。
      注：此过程切勿操之过急；否则剪切力可能导致针头管腔闭合，需重复操作。
    8. 将剥离后的导线末端插入断裂的1 cm针头管腔中，确保针头紧邻导线剩余的绝缘部分。
    9. 确保针头与导线短端剩余部分之间无裸露导体，然后压接针头以将其固定在导线上。
      注：此时压接可确保断裂针头的微观毛刺边缘被压平。
    10. 接下来，使用两把钳子小心弯曲已固定的针头，使其曲率类似于标准外科缝合针。
    11. 最后，剥离导线长端末端约5 mm的绝缘层（图3）。电极缝合入DIAm后，导线长端将被皮下引出，以便进行DIAm EMG记录。
    12. 重复上述步骤，制备第二个用于差分记录的电极。
  2. 膈肌EMG电极植入
    1. 手术前，对所有手术器械进行灭菌或高压灭菌，包括（1）小型动物电推剪，（2）带#11刀片的手术刀，（3）手术剪，（4）镊子，以及（5）微型持针器。
    2. 准备一个清洁的笼子，并提供食物、水、垫料和环境丰富化设施。将其放置在加热垫上，用于术后动物饲养。
    3. 使用适当的消毒剂对手术区域进行消毒，并穿戴个人防护装备（刷手服、帽子、口罩和外科手套）。将预先制备的电极置于环氧乙烷中灭菌。
    4. 在手术区域放置加热垫，以维持大鼠在麻醉和手术期间的体温。在加热垫上覆盖无菌手术巾。
    5. 称重大鼠体重，并根据机构动物护理与使用指南计算适当的麻醉剂量。
    6. 通过腹腔注射给予大鼠氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）或其他适当麻醉剂（遵循机构批准的方案）进行麻醉。术前注射缓释布托啡诺（1 mg/kg）和卡洛芬（5 mg/kg）。待动物对足趾夹捏无反应后继续操作。
    7. 使用电推剪从剑突开始，向后剃毛至后肢约一半位置。同时剃除大鼠背部将引出电极的位置（通常在肩胛骨区域），确保动物无法触及电极引出端。用纱布清除多余毛发。
    8. 用浸有氯己定葡萄糖酸盐（4% w/v）的无菌纱布清洁皮肤，随后用70%异丙醇擦拭。交替使用氯己定葡萄糖酸盐和异丙醇清洁三次。
    9. 将动物仰卧位放置在无菌加热垫上。从剑突开始，使用手术刀和无菌 #11刀片做一条4–5 cm长的头尾方向切口，以暴露下方的腹肌层。
    10. 在肌层沿中线再做一条3–4 cm长的切口，以暴露腹腔内容物。注意不要切穿腹腔器官。
    11. 确保膈肌的腹侧（即下侧）表面可见，尽管动物右侧会被肝脏遮挡。
    12. 使用手术刀柄或其他钝器向下推压肝脏及其他器官，以暴露膈肌的腹侧表面。
    13. 将电极从异丙醇中取出，用无菌生理盐水冲洗后准备使用。然后使用微型持针器，将一个预先制备的电极垂直于膈肌中肋部的肌纤维方向放置。肌纤维在膈肌上呈放射状分布。
      注：膈肌较薄（约2 mm），切勿穿刺。目标是将电极导线的裸露部分（图3）嵌入膈肌内。
    14. 在手术显微镜下，小心将电极缝合线（针头端）插入膈肌。利用针头的曲率引导电极进入并穿出膈肌腹侧表面，确保导线整个裸露部分完全嵌入肌肉内。
    15. 小心拉动针头，直至导线上的结在膈肌内锚定。确保导线裸露部分（2 mm）完全位于膈肌内，且在针头首次进入膈肌的位置处有结固定。
    16. 随后，将针头从电极导线上剪下，并丢弃至锐器容器中。
    17. 使用两把镊子，在缝合线（3-0）针头穿出膈肌的位置打结。具体操作为：在导线短端打一个环，将环滑至膈肌腹侧表面，然后小心收紧成结。此时电极（裸露部分）应在进入点和穿出点均被固定。
    18. 剪除导线短端多余的线段。
    19. 按照步骤1.2.14–1.2.18，在同一侧膈肌上距离第一个电极约3 mm处缝合植入另一个电极。
      注：固定好的电极导线可安全留置于大鼠体内，用于持续数周的慢性EMG测量。
    20. 以相同方式在对侧半膈肌进行电极对的植入。
    21. 接下来，确保电极导线的长端均位于腹腔外，开始用3-0缝线逐层缝合肌肉以关闭腹腔。每对电极均需打环并固定。
      注：确保腹腔内留有2–3 cm导线，以便大鼠伸展时不会对膈肌造成张力。
    22. 用生理盐水清除多余血液，然后用3-0缝线连续缝合肌层以关闭腹膜。
    23. 在背部中线电极引出处，交替使用氯己定葡萄糖酸盐和酒精消毒三次。将16 G导管从大鼠背部中线皮肤穿至开放的腹部皮肤，将一对电极导线经导管引至大鼠背部。
    24. 在另一侧重复此过程，使用第二个导管将第二对电极导线引出。
    25. 用3-0缝线间断缝合腹部皮肤。
    26. 接下来，对每对电极导线打结并缝合固定。
    27. 给予动物皮下生理盐水注射（约每50 g体重1 ml）。将动物置于加热垫上的清洁笼中恢复。
      注：剖腹术可能导致膈肌活动受抑制35,36。在进行任何EMG测量的定量分析前，至少应等待72小时。

2. 颈髓半切术

  1. 按之前的方法准备无菌手术区域。
  2. 手术前，对所有手术器械进行高压灭菌或消毒。所需设备包括：(1) 小动物电推剪，(2) 带#11刀片的手术刀，(3) 手术剪，(4) 镊子，(5) 咬骨钳，(6) 拉钩，(7) 角度解剖刀。
  3. 膈肌（DIAm）EMG电极植入约72小时后，称量大鼠体重，并根据机构动物护理与使用指南计算合适的麻醉剂量。
  4. 在麻醉大鼠前，将其放入Bowman式笼子中，并按照步骤3.2所述记录双侧DIAm EMG信号。
  5. 通过腹腔注射给予氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）以麻醉大鼠，或根据当地机构动物护理与使用委员会（IACUC）的规程选用其他合适的麻醉剂。术前皮下注射缓释布托啡诺（1 mg/kg），腹腔注射卡洛芬（5 mg/kg）， 或根据当地机构规程选用其他合适的镇痛药。
  6. 当动物对足趾夹捏无反应时，方可继续操作。每隔约15分钟检查一次麻醉深度，方法为足趾夹捏测试。
  7. 开始手术前，将大鼠置于俯卧位，并按照步骤3.3所述记录麻醉状态下大鼠的EMG信号。
    注意：确保所有记录均在大鼠保持相同体位的情况下进行。
  8. 从耳部水平向下至肩胛骨区域剃除颈部毛发，并用湿纱布清除毛发。
  9. 使用氯己定葡糖酸盐溶液（4% w/v）和异丙醇（70%）交替擦拭皮肤三次。用无菌手术巾覆盖动物身体（上背部除外）。
  10. 使用手术刀做一条4 cm长的头尾方向切口。牵开皮肤并切断肩胛棘上肌（acromiotrapezius）。然后分离菱形肌，暴露脊柱肌（spinalis muscles）。
    注意：肩胛棘上肌即中斜方肌，其肌纤维走向大致与脊柱平行。菱形肌位于肩胛棘上肌下方平面，其肌纤维呈斜向走行。
  11. 剥离 C1至C3节段的脊柱肌。
    注意：脊柱肌紧邻脊柱走行。
  12. 在手术显微镜下，使用咬骨钳小心地在C2节段进行椎板切除术，确保不损伤主要动脉或神经。
  13. 切开并牵开C2节段的硬脊膜。
  14. 在进行脊髓半切术的同时，将大鼠背部暴露的电极导线连接至放大器。详见步骤3。
  15. 在监测DIAm EMG信号的同时，将角度解剖刀插入背根进入脊髓处稍下方，并按图2A所示方式，一直切断至腹侧中点。
    注意：若使用电子加热垫，监测EMG时可能需要关闭加热垫，以避免引入噪声。
  16. 完成切断后数秒内，应确认损伤同侧的平静呼吸DIAm EMG活动停止，同时对侧DIAm（cDIAm）EMG活动出现代偿性增强（图2C）。
  17. 若平静呼吸的同侧DIAm（iDIAm）EMG活动仍持续存在，可按照图2C所示位置再次用解剖刀进行切割。但切勿跨越中线；若切至对侧，极可能导致动物死亡。
  18. 使用无菌缝线（3-0）缝合肌肉层，然后缝合皮肤。
  19. 为维持水合状态，按每50 g动物体重皮下注射1 mL生理盐水，并将动物置于清洁笼具中，使用加热垫促进恢复。密切监测动物术后恢复情况。
  20. 约72小时后（C2SH术后第3天），按照步骤3.2的方案记录清醒大鼠的EMG活动。操作时注意避免损伤大鼠背部的缝线。
  21. 随后再次麻醉大鼠（遵循机构批准的规程），所用麻醉剂量应低于手术所需深度麻醉剂量（约为正常剂量的⅓至½）。只要大鼠角膜反射完整且对足趾夹捏有反应，可酌情追加麻醉剂量。
  22. 按照步骤3的方案监测DIAm EMG活动。
    注意：将大鼠置于与初始iDIAm EMG活动评估时相同的体位。
  23. 若在第3天未检测到平静呼吸的iDIAm EMG活动（即与吸气相cDIAm EMG活动同步的活动），可判定初始C2SH手术成功，可将该动物纳入后续分析。

3. 数据采集与分析

  1. 常规设置与数据提取
    1. 将前置放大器的带通滤波器设置为100 Hz（高通）和1000 Hz（低通）。
      注意：这些滤波器设置可消除运动伪影，并显著减少60 Hz噪声和心电图（ECG）污染（其峰值功率约为75 Hz），同时保留肌内膈肌（DIAm）EMG信号绝大部分的频率成分。根据奈奎斯特采样定理，以2000 Hz的采样频率进行数字化，以避免混叠，并提供足够的分辨率来观察复合EMG中的运动单位活动。如果需要对低于100 Hz的频率范围进行专门的频率成分分析，则必须调整前置放大器的滤波设置，以确保感兴趣的频率未被滤除。
    2. 在计算机上的可视化软件中监测两个通道（左侧和右侧半膈肌EMG），并将数据以适当格式保存，以便后续分析。
    3. 采集至少1–2分钟的平静呼吸记录，以获得足够的分析数据。
    4. 确保在三个或更多时间点采集数据：
      1. 在C2SH手术前，分别在清醒和麻醉状态下建立平静呼吸的基线记录。
      2. 在C2SH手术期间，确认在麻醉状态下同侧膈肌（iDIAm）EMG的平静呼吸活动被完全抑制。
      3. 在C2SH术后第3天，确认同侧膈肌EMG的平静呼吸活动仍处于缺失状态，并确立清醒动物功能缺损的初始程度，此时结果受脊髓休克2,39或呼吸抑制剂（如布托啡诺）给药的影响较小。
    5. 使用任何支持对数字化信号进行计算的软件（例如Matlab、Python、R）分析DIAm EMG记录。基本流程如下：
      1. 加载原始EMG文件。根据滤波设置，可能需要校正信号中的直流偏移。
        注意：一个简单的解决方法是将原始EMG信号减去其自身的均值。
      2. 使用50 ms的移动窗口计算EMG信号的均方根值。可通过每次将50 ms的计算窗口向前移动一个采样点，直至信号末尾来实现。
        注意：对单个DIAm EMG事件的分析具有最高的统计效能，并允许对平静呼吸和非平静呼吸活动进行聚类分析。因此，检测DIAm EMG中单个呼吸事件的起始和终止至关重要，这一点已在先前的报告中强调40。
    6. 通过可视化瞬时呼吸频率和爆发持续时间的直方图，对平静呼吸活动进行筛选，方法如先前报告所示41。
  2. 清醒状态下的记录
    1. 将大鼠置于Bowman式啮齿类动物笼中进行清醒状态记录。圆柱形的Bowman式笼子可容纳体重达750 g的成年大鼠。
    2. 拧开Bowman式笼子一侧的金属杆，轻柔地引导大鼠进入笼内，再将金属杆重新拧紧，使大鼠被限制在圆柱形笼中。
      注意：在开始记录前，应让大鼠在笼中适应至少30分钟。如条件允许，最好在任何测量前让大鼠连续多天适应Bowman式笼子。在适应期间，向大鼠提供零食是良好的操作实践。
    3. 为尽量减少外部视觉刺激，可使用纸巾或类似物品在笼子前端（大鼠头部所在位置）搭建一个遮蔽帐篷。此外，应尽量减少噪音，并始终确保大鼠的生理舒适。
      注意：明显的不适表现包括焦躁不安、呼吸急促以及挣扎试图逃离笼子。若观察到上述任一表现，应将大鼠送回其居住笼，并在其情绪更稳定时再尝试记录。
    4. 对于体型较小的大鼠（<300 g），可在笼内空隙中填充材料（如纸巾、棉球），以防止大鼠在笼内转身180度。
    5. 待大鼠适应后，小心地将从大鼠背部引出的导线连接至前置放大器，该放大器将模拟信号输入模数转换器，并按照步骤3.1中所述流程进行操作。
  3. 麻醉状态下的记录
    1. 每次均将大鼠置于相同位置，最好为俯卧位，以更接近清醒大鼠的自然姿势。
    2. 将从大鼠背部引出的导线连接至前置放大器，该放大器将模拟信号输入模数转换器，并按照步骤3.1中所述流程进行操作。
  4. 动物恢复
    1. 将大鼠放入一个无垫料的干净空笼中进行恢复。
    2. 将笼子置于加热垫上。
    3. 在术后前3小时内，定期（<15分钟）监测大鼠状态，直至其开始活动；之后以较低频率（30分钟）监测，直至动物完全清醒。
    4. 待大鼠能够自主活动后，将其转移至含有垫料、食物、饮水及环境丰富化设施的干净笼中。
    5. 在整个实验过程中，至少每日监测一次大鼠状态。重点关注体重变化/摄食能力、切口部位及缝线的完整性。术后72小时内 需重复给予缓释布托啡诺（buprenorphine ER）和卡洛芬（carprofen）或其他适当镇痛药物。

结果

本文所述方法通过设定明确的评估标准，以减少在坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）大鼠模型中DIAm EMG检测的操作者间差异2SH。首先，在切断 C 后，正常呼吸的 iDIAm EMG 活动立即停止2SH 必须被观察到，如图所示 图2若未达到此标准，可进行二次横断，直至平静呼吸的膈肌前部活动消失。其次，在损伤后第3天2在动物处于麻醉状态时，必须持续验证正常呼吸性iDIAm肌电图信号的缺失。 图 4A 展示了一个成功的 C 的示例2通过损伤后第3天在麻醉状态下持续缺乏正常呼吸的iDIAm EMG活动来确定SH。 图4B 显示同一动物在未麻醉清醒状态下的膈肌（DIAm）EMG活动，突出表明与损伤前基线相比，同侧膈肌（iDIAm）活动有所减少但并未完全消失。值得注意的是，在清醒和麻醉状态下，对侧膈肌（cDIAm）EMG活动均有所增加。第3天的麻醉状态下记录证实了最初的C2SH 成功了，但定量分析应在清醒动物中进行。在清醒动物中，脊髓损伤后第 3 天的膈肌 EMG 活性2SH 代表恢复的起始点。 图4B 表明在清醒大鼠中，第3天的iDIAm肌电活动减弱，但并未消失。

在某些情况下，C2SH 并未伴随节律性呼吸相关的同侧膈肌（iDIAm）EMG 活动的完全停止（图 5A）。采用本论文所述方法时，发生不完全 C2SH 的情况少于所有案例的 5%；然而，必须在 C2SH 术后第 3 天对每只大鼠进行 DIAm EMG 活动评估，以验证 C2SH 操作的成功。图 5A 展示了一只大鼠在损伤后第 3 天的 DIAm EMG 活动示例，该大鼠在术后第 3 天仍存在节律性呼吸相关的 iDIAm EMG 活动，表明 C2SH 效果不充分。需要注意的是，C2SH 有效性的验证是在动物麻醉状态下进行的。持续存在的节律性 EMG 活动提示至少部分同侧脑干脊髓通路未被完全切断，这可能会影响实验结果的解释。图 5B 显示，在清醒大鼠中，术后第 3 天 iDIAm EMG 活动有所减弱，但并未完全消失。然而，同侧下行传入通路的残留可能减轻最初的神经功能缺损。

损伤前后脊髓通路示意图；神经元通路、募集及中断情况。
图1：概念框架。 头端腹侧呼吸群（rVRG）向颈段脊髓（C3-C5）的膈肌运动神经元发出下行输入。这些下行轴突的大部分支配同侧膈肌运动神经元池，但有小部分穿过中线，激活对侧运动神经元池。在C2水平脊髓半切（SH）损伤后，rVRG对同侧膈肌运动神经元池的下行输入即被中断。请点击此处查看该图的放大版本。

脊髓示意图、脊髓半切手术过程、神经生理学实验、波形数据。
图2：C2SH 和膈肌（DIAm）肌电活动的代表性记录。（A）显示大鼠脊髓的横截面视图及切断部位（红色阴影区域），并标注了重要结构。脊髓损伤通过将解剖刀插入背根进入点稍下方，并切割至大约中线位置实现（半透明红色阴影区域）。注意外侧索和腹侧索中的主要运动传导束被切断，而背侧索得以保留。（B）纵向视图展示了同侧运动神经元活动的沉默，这与用于实时确认损伤效果良好的原始肌电图波形（C）相互补充。当脊髓被损伤后，正常的同侧膈肌（iDIAm）肌电活动停止，表明支配膈肌运动神经元的同侧传入通路已被切断；与此同时，对侧膈肌（cDIAm）肌电活动立即增强，如图所示。请点击此处查看该图的放大版本。

电极制作步骤示意图：测量、剥线、插入、压接、弯曲、再剥线。
图3：电极制作。展示了制造DIAm EMG电极的过程。基本步骤包括：测量并剪切适当长度的导线（步骤1），打结固定并剥除绝缘层以暴露电极部分（步骤2），将一根25号针头连接到导线上（步骤3和4），将针头弯曲成类似于外科缝合针的弧度（步骤5），最后剥除另一段绝缘层，以暴露将连接放大器用于记录肌电图（EMG）的导线部分（步骤6）。请点击此处查看该图的放大版本。

脊髓半切波形结果，麻醉与清醒状态下术前及术后对比。
图4：成功的脊髓半切术。（A）显示一只大鼠在C2SH术前及术后第3天麻醉状态下的膈肌（DIAm）肌电图（EMG）活动。该大鼠在术后第3天未检测到正常的同侧膈肌（iDIAm）EMG活动，表明初始的C2SH手术成功。注意与术前相比，对侧膈肌（cDIAm）EMG活动出现代偿性增强，且呼吸频率增加。（B）显示同一大鼠在C2SH术后第3天非麻醉清醒状态下的DIAm EMG活动。可见同侧iDIAm EMG活动明显减弱——尽管未完全消失。注意与术前相比，cDIAm EMG活动代偿性增强，且呼吸频率增加。请点击此处查看该图的放大版本。

麻醉状态和清醒状态下脑电波形，显示不完全脊髓半切术的效果。
图 5：不完全脊髓半切术。 （A）显示一只麻醉大鼠在C2SH术前及损伤后第3天的膈肌（DIAm）EMG活动。在此大鼠中，损伤后第3天仍持续存在正常的同侧膈肌（iDIAm）EMG活动，表明初次C2SH手术不充分。因此，该大鼠被排除在后续功能恢复分析之外。注意尽管C2SH不完全，对侧膈肌（cDIAm）EMG活动出现代偿性增强，但呼吸频率增加不明显。（B）显示同一只大鼠在C2SH术后第3天非麻醉清醒状态下的DIAm EMG活动。可见同侧DIAm EMG活动减弱，对侧DIAm EMG活动增强，且呼吸频率略有增加。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

C2 脊髓半切术
本文所述方法强调对DIAm EMG活动的评估，该评估可作为C的验证依据2 横断外侧索和腹侧索而保留背侧索的脊髓损伤（图2A）。该手术方案具有两大主要优势。首先，它保留了背索（dorsal funiculi），从而维持大鼠的行走功能，同时仍切断同侧膈神经运动神经元的传入通路。其次，通过监测膈肌（DIAm）的肌电图（EMG），我们能够验证C2 在手术过程中，当动物处于麻醉状态时，通过损伤来消除正常的膈肌（iDIAm）EMG活动。在损伤后第3天，再次于动物麻醉状态下确认正常的iDIAm EMG活动是否持续被抑制。先前研究表明，在损伤后3至7天，延髓头端腹侧网状核（rVRG）对膈肌运动神经元的兴奋性输入以及膈肌运动神经元中NMDA受体的表达均有所下降；而在损伤后7天以上，谷氨酸能突触输入和NMDA受体表达随时间逐渐增加。33,42. 这些数据与C的组织学证实相结合，2 病灶10,13,29,30,33，表明在损伤后第3天麻醉状态下持续无活动可提供有关初始C疗效的信息2SH。在多年开展的多项研究中，术后14天在麻醉状态下观察到的自发恢复率相对稳定，介于30%–40%之间。2SH18,19,20,29,31,43，表明这种验证C成功的方法2SH 具有可重复性和可靠性。

C2SH 操作包含多个关键步骤。重要的是，本文提出的 C2SH 模型保留了背索（dorsal funiculi），因此不会导致肢体运动功能障碍。而在涉及背索的完整 C2 脊髓半切模型中，肢体运动功能障碍则显著更严重3,4,5,6,7,37。因此，C2SH 模型（图 2A）的一个额外优势在于，除了在麻醉的大鼠中通过 C2 损伤阻断正常呼吸时膈肌（iDIAm）的肌电活动外，这些大鼠在行走及其他功能方面与假性椎板切除术大鼠的功能状态相似。因此，它们通常能够自主进食和理毛，这减轻了护理负担，同时仍可用于研究膈肌的神经运动控制及呼吸神经可塑性。为确保正确实施 C2 模型，必须格外注意避免过度损伤。将解剖刀插入背根进入脊髓的稍下方位置，并谨慎切割腹侧部分，是两个实用的经验原则。目标是确保正常呼吸时的 iDIAm 肌电活动完全消失；如有需要，可通过多次小范围切割来实现。事实上，在 C2SH 手术后的一周内，若动物出现行走困难或难以抓取食物颗粒的情况，即可明确提示脊髓存在过度损伤。

电极放置与肌电图记录
与其它方法相比，慢性膈肌（DIAm）肌电图电极具有多项明显优势。电极可（且应当）在C2SH手术前数天植入，从而为动物提供充足的恢复时间，且无需在同一手术过程中同时进行剖腹术和C2SH操作。这一点非常重要，因为已有充分共识认为剖腹术会抑制膈肌功能35,36。通过植入慢性DIAm电极，也避免了早期研究中反复进行剖腹术的需要10,13；同时，由于无需在每次实验时将电极插入膈肌，气胸的风险也显著降低。然而，电极植入过程仍可能导致若干潜在的严重不良事件。尽管避免反复插入电极可降低气胸风险，但该风险并未完全消除，事实上仍可能发生气胸，导致动物立即死亡或出现长期健康问题。为降低此风险，最佳操作规范是确保穿过膈肌的针头不穿透膈肌上表面。此外，在操作电极导线时应避免使用尖锐的镊子，以防对膈肌造成损伤。偶尔，大鼠可能会啃咬腹部缝线，若不加以干预，可能导致内脏脱出。因此，在电极植入后应定期观察大鼠，以便及早发现此类行为。在某些情况下，可对大鼠实施麻醉以修复缝线损伤。但最理想的做法是在手术期间及术后提供充分的镇痛，并确保手术过程中无菌环境不被破坏，从而预防此类行为的发生。在极端情况下，对于反复自行拆除缝线的大鼠，可能需要实施安乐死。

记录和分析肌电图（EMG）信号并非本研究的主要重点，且高度依赖于各实验室所配备的具体设备和软件。尽管在材料表中提供了设备信息，但用于放大和记录EMG活动的硬件选择多种多样，具体选用将取决于各实验室在功能、可获得性和成本之间的综合权衡。然而，有一些EMG记录的基本原则值得特别说明。一个潜在的问题是植入电极的移位或损坏，这可能限制对膈肌（DIAm）EMG的定量评估。如果电极从DIAm脱落，或者大鼠咬断或以其他方式损坏了外露的导线，则可能无法记录到EMG信号，或噪声水平会发生变化。为避免此类情况，应在DIAm电极植入手术期间确认电极已牢固固定于DIAm，并能够记录到高信噪比（SNR）的信号。此外，将电极导线从背部较高位置引出，并剪除多余导线，使大鼠无法接触到电极导线，均有助于慢性电极的成功使用。作为外露导线的替代方案，使用头帽37或遥测技术44,45也是可行的选择。这两种方法均可更方便地在清醒动物中获得记录，但实施难度可能略高于简单地将多股导线外露。所有附近的电子设备都可能成为噪声来源。至关重要的是，所有设备必须正确接地，使用屏蔽电缆，并在进行主动记录时避免触碰大鼠。除了在记录期间关闭电子加热垫外，照明设备、邻近仪器、电动手术台及其他类似装置也可能需要暂时关闭，以实现低噪声记录。为最大限度减少环境干扰，所有无需在DIAm EMG记录期间运行的电子设备均应关闭。如条件允许，应在电磁屏蔽室内进行记录。随着时间推移，DIAm EMG电极周围可能出现组织瘢痕化和纤维化，导致电极导电性下降，从而降低信噪比（SNR）。此外，即使姿势发生轻微变化，也可能对DIAm EMG信号产生显著影响；因此，为尽量减少这些可能造成干扰的因素，应在各次记录会话中保持大鼠姿势一致。

另一个重要考虑因素是滤波和采样设置。电极类型（即，肌内电极） 与食管/表面电极在确定信号频率成分以及相应高低通滤波器的设置方面具有重要意义。研究人员已投入大量精力，以确定用于表面/食管膈肌肌电图（DIAm EMG）信号分析的最佳滤波器参数。46在大鼠膈肌（DIAm）中尚未开展类似研究，但此前我们已证实，使用慢性植入的肌内电极记录到的大鼠DIAm肌电图（EMG）频率成分几乎全部低于1000 Hz，其质心频率约为300 Hz。47在对通过表面和肌内电极获取的人体肱二头肌肌电图功率谱的平均频率和中位频率进行直接比较时，Christensen 等人48 发现肌内电极的平均频率和中位频率均约为体表电极的3倍。在DIAm中，研究人员使用双极食管电极时报告的中心频率约为100 Hz。49,50,51,52,53,54，这表明先前为肌内电极确定的300 Hz大致符合Christensen等人所展示的相同趋势。48尽管如此，多项利用啮齿类动物模型进行肌内差分干涉振幅EMG研究的已发表文献中，其高通滤波器均设置为300 Hz4,37,55,56 甚至有些高达 500 Hz57不可否认，这种滤波方法会显著降低膈肌（DIAm）肌电图（EMG）信号的幅度，至少减少一半。我们提出一种破坏性小得多的方法：（1）在100 Hz处进行高通滤波，因为心电图（ECG）功率谱的大部分低于100 Hz，而相比之下，膈肌肌电图（DIAm EMG）功率谱中低于100 Hz的部分则少得多51,52，以及（2）通过波形匹配去除残留的 ECG58因此，大多数研究中膈肌电活动（DIAm EMG）的合适滤波范围可设置在100 Hz至1000 Hz之间，采样频率至少为2000 Hz，以捕捉数据中所有相关特征。随后可采用既往研究报告中发表的技术对DIAm EMG进行详细分析。40,41,47,58.

清醒与麻醉状态下的动物
值得注意的是，一些研究指出，C2SH 的 cSCI 模型并不会导致正常呼吸时同侧膈肌（iDIAm）肌电活动（EMG）完全消失23,37。从某种意义上说，这并不令人意外，因为此前已有报道指出，在需要更强呼吸驱动的行为过程中（例如深呼吸和对气道阻塞的反应），会出现"突破性"活动4,7,29,42。这些数据表明，将 C2SH 模型视为完全持续性失活的真实模型可能是不恰当的。事实上，已有证据显示，在完全性 C2SH 损伤后仅四天，清醒动物体内的驱动已足够强，可检测到正常呼吸时的 iDIAm EMG 活动37，尽管在损伤后一天内该活动并不持续存在23。在所有情况下，麻醉均会抑制颈段高位脊髓半切术后同侧膈肌的活动，这一点已在先前的报告中被强调23,38，并在图4和图5中得到展示。目前尚无已发表的数据描述本研究中提出的保留背侧索的 C2SH 模型（图2A）在清醒大鼠中的膈肌 EMG 活动情况。未来的研究应详细表征该 C2SH 模型在清醒动物中膈肌 EMG 活动的时间进程。尽管如此，仍建议在损伤后第3天、在麻醉条件下验证正常呼吸时 iDIAm EMG 活动是否持续缺失，以模拟最初进行脊髓损伤或横断时的实验条件。当损伤后第3天在清醒动物中可能已出现正常呼吸时的 iDIAm EMG 活动时，需注意的是，即使使用半剂量的麻醉剂，通常也会导致正常呼吸时的 iDIAm EMG 活动完全停止。在此类剂量下，动物保持安静且处于镇静状态。除了确认 C2SH 手术期间及损伤后第3天 eupneic iDIAm EMG 活动的沉默外，还建议在终末实验后取出脊髓，以进行组织学分析，确认 C2SH 损伤的位置和范围9,29,59。将损伤的组织学确认与 eupneic iDIAm EMG 活动的功能性沉默相结合，可为成功建立 C2SH 模型提供有力证据。

本文介绍了一种在大鼠中建立颈段脊髓半切（C2SH）损伤模型的方法，该模型可导致实验性脊髓损伤（cSCI）后立即抑制正常呼吸期间同侧膈肌（iDIAm）的肌电活动，并在损伤后第3天麻醉状态下持续保持抑制。由于本研究所提出的C2SH模型保留了背侧索，因此肢体运动功能得以维持，从而避免了非靶向效应。这使得研究者能够在整体健康状况相对良好的大鼠中开展关于高位颈髓损伤对膈肌神经肌肉控制影响的纵向研究，从而显著降低实验动物护理负担。在损伤后第3天麻醉状态下确认肌电活动缺失，有助于为后续评估正常呼吸时iDIAm肌电活动恢复程度建立明确的基线。该方法为在大鼠中实施C2SH损伤提供了一种严谨、可靠且可重复的技术手段。该模型有望显著增进人们对呼吸神经可塑性时间进程及其与潜在治疗策略之间关系的理解。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）的资助（NIH R01HL146114）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
25 G 针头Cardinal Health1188825100Covidien Monoject 皮下标准针头：25 G x 1" (0.508 mm x 2.5 cm) A
3-0 Vicryl 紫色编织线EthiconJ774D3-0 缝合线
Adson-Brown 镊子Fine Science Tools11627-12尖端形状：直型，尖端类型：鲨齿状，尖端宽度：1.4 mm，尖端尺寸：2 x 1.4 mm，合金/材料：不锈钢，长度：12 cm
Bowman Style 笼具Braintree ScientificPOR-530适用体重范围：250 至 750 g；最大长度：9" (228 mm)；基本单元由 0.5" (123 mm) 宝石级丙烯酸材料制成。
Castroviejo 缝合针持Fine Science Tools12565-14尖端形状：直型，尖端宽度：1.5 mm，夹持长度：10 mm，锁扣：有，剪刀功能：无，合金/材料：不锈钢，长度：14 cm，带齿：是
特性：碳化钨
屏蔽式 1 米夹式导联线Biopac Systems, IncLEAD110S用于肌电图（EMG）的屏蔽导联线
数据采集软件LabChartLabChart 7.3.8用于多通道记录和实时评估的数据记录、可视化和分析软件
数据分析软件 - Matlab 2023bMathworks, Inc.Version 23.2用于事后分析的通用编程语言
解剖刀Fine Science Tools10056-12刃口长度：4 mm，厚度：0.5 mm，合金/材料：不锈钢，长度：12.5 cm，刀片形状：30° 角度
Dumont #3 镊子Fine Science Tools11293-00型号：#3，尖端形状：直型，尖端类型：标准型，尖端尺寸：0.17 x 0.1 mm，长度：12 cm，合金/材料：Dumostar
肌电图放大器Biopac Systems, IncEMG100C肌电图（EMG）放大器
Friedman 骨凿Fine Science Tools16000-14尖端形状：弯曲型，杯口尺寸：2.5 mm，合金/材料：不锈钢，长度：13 cm，关节动作：单动式
Friedman-Pearson 骨凿Fine Science Tools16021-14合金/材料：不锈钢，长度：14 cm，关节动作：单动式，杯口尺寸：1 mm，尖端形状：弯曲型
独立电源模块Biopac Systems, IncIPS100C可在不依赖 Biopac Systems, Inc. MP 系列数据采集系统的情况下，独立运行 100 系列放大器模块
Kelly 止血钳Fine Science Tools13019-14尖端类型：带齿，尖端宽度：1.5 mm，夹持长度：22 mm，合金/材料：不锈钢，长度：14 cm，尖端形状：弯曲型
刀状刮匙V. MuellerVM101-4414尖端：锐利，尖端直径：2 mm
显微解剖剪Biomedical Research Instruments, Inc.11-2420长度：4"，角度：直型，刀刃长度：23 mm
多股不锈钢丝Cooner Wire, Inc.AS 631线规：AWG 40；总直径：0.011 mm（带绝缘层），0.008 mm（无绝缘层）。
PowerLab 8/35ADInstrumentsPL3508数据采集系统
手术刀片 #11Fine Science Tools10011-00刀片形状：斜角型，刃口长度：20 mm，厚度：0.4 mm，合金/材料：碳钢
手术刀柄 #3Fine Science Tools10003-12合金/材料：不锈钢，长度：12 cm
SD 大鼠InotivOrder code: 002SD 远交系大鼠（雌性和雄性）
手术显微镜OlympusSZ61手术显微镜 
缝线剪George Tiemann & Co.110-1250SB合金/材料：不锈钢，尖端形状：直型，尖端类型：一端锐利/一端钝，长度：4.5"
Vannas 弹簧剪Fine Science Tools15000-08尖端类型：锐利，刃口长度：2.5 mm，尖端直径：0.05 mm，长度：8 cm，合金/材料：不锈钢，带齿：否，尖端形状：直型
Weitlaner 牵开器Codman50-5647齿状结构：2 x 3 钝齿，长度：4.5"

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