高产率低损伤的脐带来源间充质干细胞分离

摘要

本研究介绍了一种独特的钝性分离方法，可保持华通胶（Wharton's jelly, WJ）的完整性，从而减少WJ的损伤，并获得数量更多、活力更高的间充质干细胞（MSCs）。与传统的锐性分离方法相比，该方法具有更高的细胞得率和增殖能力。

摘要

间充质干细胞（MSCs）是一类具有强大再生能力和免疫调节特性的多能细胞。脐带（UC）中的华通胶（WJ）因其是MSCs的优质来源，在生物医学领域受到日益关注。然而，现有方法存在供应量有限和缺乏标准化等挑战。本文介绍一种通过从脐带中分离完整华通胶以提高MSC产量的新方法。该方法采用钝性解剖去除上皮层，保持华通胶整体结构的完整性，从而显著增加收获的MSC数量及其活性。与传统的锐性解剖方法相比，该方法显著减少了华通胶的浪费。为确保WJ-MSCs的纯度并最大限度减少外来细胞的影响，研究采用翻转脐带后利用内部张力剥离内皮层的操作步骤。此外，在组织块培养过程中将培养皿短暂倒置，以促进组织贴附和细胞外生长。对比分析表明，该新方法在华通胶及WJ-MSCs的收获量和细胞活性方面均优于传统方法。两种方法获得的细胞在形态学特征及细胞表面标志物表达模式上的相似性，进一步证实了其特性与纯度，适用于多种应用需求。该方法为WJ-MSCs的分离提供了高产量、高活性的技术路径，在MSCs的临床应用方面展现出巨大潜力。

引言

自1991年首次从华通胶（Wharton's jelly, WJ）中分离出间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）以来，这些多能干细胞因其再生特性和多向分化潜能而受到研究人员的广泛关注¹。MSCs可从多种来源分离获得，包括骨髓、外周血、牙髓、脂肪组织、胎儿组织（人类流产组织）以及与出生相关的组织²。脐带（UC）因其采集无创、细胞产量丰富且具有良好的分化能力，表现出高增殖率、强分化潜能以及免疫调节特性，已成为极具前景的细胞来源³。胎儿来源的MSCs具有显著的干性和免疫学特性，因而在过去二十年中成为临床试验和基础研究的主要焦点^2,4,5。相较于骨髓或脂肪组织等其他来源的MSCs，脐带来源的MSCs具有更优越的治疗潜力^6,7。

脐带（UC）由羊膜上皮、三条血管（两条动脉和一条静脉）以及被称为华通胶（WJ）的胶状物质组成³。有趣的是，脐带仅由内皮和间皮构成，缺乏外....

方案

样本取自中国广东省深圳市龙岗区妇幼保健院的知情同意健康捐赠者。本研究使用人类样本已获得北京中医药大学深圳医院伦理委员会（SZLDH2020LSYM-095）和深圳市龙岗区妇幼保健院医学伦理委员会（LGFYYXLLS-2020-005）的批准。所有实验均按照批准的指南进行。所用试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 人类脐带的采集

1. 在无菌条件下从合作医院获取人脐带样本。
   注意：选择年龄小于35岁、 preferably 为初产妇的供体，无肝炎、性传播疾病或遗传性疾病病史。乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和巨细胞病毒的入院检查结果需为阴性。选择剖宫产作为分娩方式。
2. 选取一段长约10–15 cm的平直且完整的脐带。
3. 在剖宫产娩出足月新生儿后，立即用止血钳夹闭脐带两端，并在止血钳内侧端之间用外科结扎法结扎。（所采集的脐带如图1步骤1所示）。
   注意：剖宫产操作可确保采集过程的无菌性。建议使用0号或2-0号缝线打结，以获得更好的抗张强度。
4. 使用手术剪在止血钳与结扎线之间剪断已结扎的脐带（图1，步骤1）。
5. 用生理盐水冲洗脐带，去除表面可能存在的血凝块，并迅速转移至含有20 m....

结果

收集、培养及后续分析脐带间充质干细胞（UC-MSCs）的操作流程总结于图1中。采用本研究特有的方法将脐带精确地分割为若干段；主要操作步骤的具体示意图见图2。对组织块培养中外延细胞的生长情况进行常规监测和记录。培养约4天后，可见贴壁的梭形细胞逐渐从组织块中爬出，并越来越多地呈漩涡状排列。这些细胞被定义为P0代，并继续增殖以进行后续传代，且在增殖和传代过程中保持一致的细胞大小和形态。传统方法与当前方法在细胞大小和形态方面差异 negligible（可忽略）（图3）。

传统的解剖方法包括从血管和脐带（UC）内层上皮刮除外膜华通氏胶（WJ）。通过重量校正，两种方法在WJ得率上表现出显著差异。WJ得率可通过测量2 cm脐带（2.4 g ± 0.2 g）中WJ的重量百分比来计算。对当前方法与传统方法在WJ得率比例上的比较显示，采用新方法后WJ得率显著提高（图4A

讨论

间充质干细胞（MSCs）是再生医学研究中的一个活跃领域，具有深远的应用前景²²。其独特的生物学特性使其成为科学研究的焦点，并有望彻底改变多种疾病和损伤的治疗方式⁷。脐带华通胶来源的间充质干细胞（WJ-MSCs）是MSCs的一个独特亚群，可从脐带（UC）中血管间组织与羊膜上皮之间的胶状结缔组织中分离获得²³。MSCs的临床应用关键在于获得足够数量的细胞²⁴。然而，随着传代次数的增加，细胞开始表现出一定程度的衰老现象，MSCs的增殖能力在第5代（P5）之后逐渐下降²⁴。因此，优化提高MSC产量的方法至关重要。

分离华通胶间充质干细胞（WJ-MSCs）最有效的方法是在保持其完整性的前提下解剖整个华通胶⁶。研究表明，来自脐带边缘区域的这些边界细胞比血管间区域的华通胶间充质干细胞具有更强的迁移能力和更高的增殖.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC 抗人 CD44 抗体	Biolegend	338806
24 孔细胞培养板	Thermo Scientific	142475
APC 抗人 CD73（外切-5'-核苷酸酶）抗体	Biolegend	344006
APC 小鼠 IgG1, κ 同型对照（FC）抗体	Biolegend	400122
高压灭菌器	HIRAYAMA	HVE-50
自动细胞计数仪	Countstar	FL-CD
BAMBANKER 冷冻保存液	Wako	302-14681
细胞染色缓冲液	Biolegend	420201
离心机	Eppendorf	5424R
超净工作台	上海智城	C1112B
CO2 培养箱	Thermo Scientific	HERAcell 150i
D-PBS	Solarbio	D1040
电热鼓风干燥箱	上海精宏	DHG-9423A
FITC 抗人 CD105 抗体	Biolegend	323204
FITC 抗人 CD90（Thy1）抗体	Biolegend	328108
FITC 小鼠 IgG1, κ 同型对照（FC）抗体	Biolegend	400110
流式细胞仪	Beckman	CytoFLEX
血细胞计数板	Superior Marienfeld	640410
细胞内染色通透洗涤缓冲液（10×）	Biolegend	421002
倒置生物显微镜	ZEISS	Axio Vert. A1
液氮储存罐	Thermo Scientific	CY50935-70
生理盐水（NS）	Meilunbio	MA0083
PBS	Solarbio	P1032
PE 抗人 CD11b 抗体	Biolegend	393112
PE 抗人 CD19 抗体	Biolegend	392506
PE 抗人 CD34 抗体	Biolegend	343606
PE 抗人 CD45 抗体	Biolegend	368510
PE 抗人 HLA-DR 抗体	Biolegend	307606
PE 小鼠 IgG1, κ 同型对照（FC）抗体	Biolegend	400114
PE 小鼠 IgG2a, κ 同型对照（FC）抗体	Biolegend	400214
精密电子天平	Satorius	PRACTUM313-1CN
雪花制冰机	ZIEGRA	ZBE 30-10
无菌 50 mL 塑料离心管	Greniner	227270
恒温水浴锅	上海一恒	HWS12
胰蛋白酶 1:250	Solarbio	T8150
UltraGRO-Advanced	Helios	HPCFDCGL50
超纯水与纯水净化系统	Milli-Q	Milli-Q Reference
无异种成分人源间充质干细胞培养基	FUKOKU	T2011301