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方法文章

高产率低损伤的脐带来源间充质干细胞分离

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DOI：

10.3791/66835

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2024年7月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3Obstetrical Department, Longgang District Maternity & Child Healthcare Hospital of Shenzhen City, 4Longgang Maternity and Child Institute of Shantou University, Medical College

本文内容

摘要

本研究介绍了一种独特的钝性分离方法，可保持华通胶（Wharton's jelly, WJ）的完整性，从而减少WJ的损伤，并获得数量更多、活力更高的间充质干细胞（MSCs）。与传统的锐性分离方法相比，该方法具有更高的细胞得率和增殖能力。

摘要

间充质干细胞（MSCs）是一类具有强大再生能力和免疫调节特性的多能细胞。脐带（UC）中的华通胶（WJ）因其是MSCs的优质来源，在生物医学领域受到日益关注。然而，现有方法存在供应量有限和缺乏标准化等挑战。本文介绍一种通过从脐带中分离完整华通胶以提高MSC产量的新方法。该方法采用钝性解剖去除上皮层，保持华通胶整体结构的完整性，从而显著增加收获的MSC数量及其活性。与传统的锐性解剖方法相比，该方法显著减少了华通胶的浪费。为确保WJ-MSCs的纯度并最大限度减少外来细胞的影响，研究采用翻转脐带后利用内部张力剥离内皮层的操作步骤。此外，在组织块培养过程中将培养皿短暂倒置，以促进组织贴附和细胞外生长。对比分析表明，该新方法在华通胶及WJ-MSCs的收获量和细胞活性方面均优于传统方法。两种方法获得的细胞在形态学特征及细胞表面标志物表达模式上的相似性，进一步证实了其特性与纯度，适用于多种应用需求。该方法为WJ-MSCs的分离提供了高产量、高活性的技术路径，在MSCs的临床应用方面展现出巨大潜力。

引言

自1991年首次从华通胶（Wharton's jelly, WJ）中分离出间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）以来，这些多能干细胞因其再生特性和多向分化潜能而受到研究人员的广泛关注1。MSCs可从多种来源分离获得，包括骨髓、外周血、牙髓、脂肪组织、胎儿组织（人类流产组织）以及与出生相关的组织2。脐带（UC）因其采集无创、细胞产量丰富且具有良好的分化能力，表现出高增殖率、强分化潜能以及免疫调节特性，已成为极具前景的细胞来源3。胎儿来源的MSCs具有显著的干性和免疫学特性，因而在过去二十年中成为临床试验和基础研究的主要焦点2,4,5。相较于骨髓或脂肪组织等其他来源的MSCs，脐带来源的MSCs具有更优越的治疗潜力6,7。

脐带（UC）由羊膜上皮、三条血管（两条动脉和一条静脉）以及被称为华通胶（WJ）的胶状物质组成3。有趣的是，脐带仅由内皮和间皮构成，缺乏外膜层，是一种结构简单的血管系统；而华通胶中不含淋巴管或神经8。脐带具有独特的结构，非常适合进行分段分离。脐带间充质干细胞（UC-MSCs）主要位于华通胶中。MSCs 可从华通胶的不同区域分离获得，包括羊膜层、羊膜下层（羊膜层与羊膜下层亦统称为脐带衬里区）以及华通胶的血管周围区域8。华通胶的每个区域都具有其独特的结构、免疫组织化学特征和功能3,6。

源自脐带华通胶（WJ）的间充质干细胞（MSCs）被广泛认为比来自其他来源的MSCs具有更优的临床应用价值3。由于具备多向分化潜能、免疫调节特性、旁分泌作用、抗炎作用以及免疫豁免特性，WJ-MSCs已在多种疾病的临床前和临床研究中得到广泛探索2,3。研究已证实WJ-MSCs在治疗多种疾病方面具有潜力，包括移植物抗宿主病（GvHD）、移植物排斥反应、克罗恩病、自身免疫性疾病以及心血管疾病9,10,11,12,13,14。随着临床对WJ-MSCs的需求持续增长，脐带供体的短缺目前已成为其广泛应用的主要障碍。

华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）的产量取决于所采用的细胞提取方法15。虽然可通过组织块培养法或酶消化法分离WJ-MSCs，但后者方法的传代时间较长，可能增加细胞损伤风险并降低细胞活力16。然而，大量研究表明，组织块培养法可提高细胞产量和活力，且组织块释放的旁分泌因子也有助于促进细胞增殖17,18。

本研究采用一种独特的分离方法获取完整的华通氏胶，从而获得增殖能力更强、活力更高且数量更多的间充质干细胞，同时最大限度地减少对华通氏胶的损伤。该创新性方法为分离华通氏胶间充质干细胞提供了一种简化的策略，满足了间充质干细胞应用中的关键需求。

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方案

样本取自中国广东省深圳市龙岗区妇幼保健院的知情同意健康捐赠者。本研究使用人类样本已获得北京中医药大学深圳医院伦理委员会（SZLDH2020LSYM-095）和深圳市龙岗区妇幼保健院医学伦理委员会（LGFYYXLLS-2020-005）的批准。所有实验均按照批准的指南进行。所用试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 人类脐带的采集

  1. 在无菌条件下从合作医院获取人脐带样本。
    注意：选择年龄小于35岁、 preferably 为初产妇的供体，无肝炎、性传播疾病或遗传性疾病病史。乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和巨细胞病毒的入院检查结果需为阴性。选择剖宫产作为分娩方式。
  2. 选取一段长约10–15 cm的平直且完整的脐带。
  3. 在剖宫产娩出足月新生儿后，立即用止血钳夹闭脐带两端，并在止血钳内侧端之间用外科结扎法结扎。（所采集的脐带如图1步骤1所示）。
    注意：剖宫产操作可确保采集过程的无菌性。建议使用0号或2-0号缝线打结，以获得更好的抗张强度。
  4. 使用手术剪在止血钳与结扎线之间剪断已结扎的脐带（图1，步骤1）。
  5. 用生理盐水冲洗脐带，去除表面可能存在的血凝块，并迅速转移至含有20 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌50 mL塑料管中。
    注意：转移过程中未使用抗生素。
  6. 密封管子，放入聚苯乙烯盒中的冰上，于4 °C保存，待运送至实验室。
    注意：应在采集后4小时内进行脐带解剖。

2. 脐带华通胶的分离

  1. 按照以下步骤处理脐带：
    1. 准备一个灭菌托盘，内含外科器械、无菌包装的90 mm培养皿、1000 µL移液器、无菌PBS、75%乙醇溶液以及无异源成分的人源间充质干细胞培养基。
      注：齿状镊子和蚊式钳有助于高效处理滑腻的脐带。
    2. 在将物品放入生物安全柜之前，对所需物品及工作区域进行表面去污染。
      注：开始操作前，让工作区域的空气净化数分钟。
    3. 对管子表面进行消毒，并在生物安全柜中将样本转移至培养皿。将带有结节的样本浸入75%乙醇中30秒，然后在新的培养皿中用无菌PBS多次冲洗。
      注：脐带必须在浸入75%乙醇前结扎，浸入时间应控制在30秒至1分钟之间，以实现充分消毒而不造成损伤。
    4. 剪除结节，并用手术剪刀和镊子在两个结节之间横向将脐带切成约2 cm长的小段。
      注：带有结节的脐带末端应予以丢弃。脐带段长度不宜过长或过短，否则均可能增加操作难度。
    5. 使用1000 µL移液器以PBS灌注静脉（较大的血管），直至液体从脐带另一端流出时完全透明19。
  2. 解剖脐带。
    1. 将已切割的一段脐带转移至新的培养皿中。
      注：横切面上应清晰可见两条动脉和一条静脉8（图2B）。
    2. 加入适量PBS，以保持脐带在整个操作过程中湿润。
    3. 用镊子夹住脐带，并借助蚊式钳沿其长轴方向拉出动脉。
      注：若动脉被拉断，可尝试从脐带另一端继续拉出，因动脉壁具有较强弹性。
    4. 将脐带水平固定，较厚的一侧朝上，将镊子的一叶插入脐静脉内，然后夹紧，确保镊子夹在较厚的一侧。
    5. 使用手术刀，沿镊子另一叶的边缘，从一端到另一端在线状切开羊膜上皮层（图3）。
      注：切割时应尽量减少对华通胶的损伤，以保持其完整性。
    6. 从切口的一角开始，用齿状钳提起羊膜上皮的一角，再用角膜剪沿上皮内表面水平继续剪开一小段。
      1. 用钳子分离华通胶与羊膜上皮，并逐渐扩展至脐带一端的整个圆周，纵向剥离上皮层（图3）。
        ​注：华通胶是由致密的羊膜上皮包裹的黏液性结缔组织8。整个操作应平稳进行，若剥离过程中遇到困难，可使用蚊式钳进行钝性分离。
    7. 将镊子的两叶插入静脉内，夹住一部分华通胶，然后将其翻转，使脐静脉上皮暴露出来（图3）。
    8. 由于内部张力作用，静脉上皮与周围华通胶之间自然分离，可轻松剥离静脉上皮（图3）。
  3. 采用传统方法解剖脐带以进行对比20。
    1. 选取另一段与先前脐带重量相近的已切割样本，转移至新的培养皿中。
    2. 用剪刀沿脐静脉纵向剪开，并展开脐带以暴露血管和华通胶。
    3. 去除脐静脉和两条动脉，并用剪刀和手术刀将华通胶从内皮层上刮下。

3. 脐带间充质干细胞的分离与培养

  1. 将收集的华通氏胶（WJ）置于预先标记的90 mm培养皿中，用剪刀和镊子将其切成1-3 mm大小的组织块。
  2. 将培养皿倒置（盖子朝下），放入37 °C、5% CO2的培养箱中孵育30分钟，以增强组织块与塑料表面的贴附。
  3. 将培养皿翻转，轻柔加入适量人源间充质干细胞（MSC）培养基进行后续培养。
    注意：加液时应使用最低流速，确保组织块仍保持贴壁状态。
  4. 每3天更换一次人源MSC培养基。前7天内每2天观察一次成纤维样细胞的生长情况，并更换三分之二的培养基；第7天时更换全部培养基，之后每日观察一次。
    注意：前7天内避免移动培养皿。约4天后可观察到明显的成纤维样细胞向外生长。
  5. 持续传代培养至细胞融合度达到80%。
    注意：此步骤通常需要7-10天。
    1. 将PBS、0.25%胰蛋白酶及无异源成分的人源MSC培养基在水浴中预热至37 °C。
    2. 用移液器吸除上清液后，以PBS清洗，再加入预热的0.25%胰蛋白酶消化细胞，直至轻敲培养皿时细胞可脱落。
    3. 按4:1比例加入预热的MSC培养基中和胰酶活性，收集细胞悬液，于4 °C下以300 × g离心5分钟。
      注意：此批细胞定义为第0代（P0）。
    4. 用移液器弃去上清液，将细胞重悬于人源MSC培养基中，按1×104 cells/cm2的接种密度接种至新的培养皿中进行扩增。
  6. 在第一、第二和第三代扩增后，使用血细胞计数板分别统计两种方法获得的总细胞数量。在第一、第三和第五代时，于显微镜下观察细胞形态。
    注意：这些细胞的形态应与P0代细胞相似。
  7. 使用第五代细胞进行流式细胞术及其他实验。

4. 通过流式细胞术检测细胞表面标志物的表达

  1. 用0.25%胰蛋白酶消化第5代（P5）细胞，用细胞染色缓冲液洗涤细胞，并在4 °C下以300 × g离心5分钟。将沉淀用细胞染色缓冲液重悬至每管100 µL。
  2. 标记各管，并根据制造商说明书加入适量与别藻蓝蛋白（APC）、异硫氰酸荧光素（FITC）或藻红蛋白（PE）偶联的抗体：CD44-APC、CD73-APC、CD90-FITC、CD105-FITC、CD11B-PE、CD19-PE、CD43-PE、HLA-DR-PE21。室温避光孵育15–20分钟。
  3. 将染色后的细胞在4 °C下以300 × g离心5分钟，用移液器吸除上清液，并用细胞染色缓冲液洗涤一次。
  4. 再次离心细胞，并用300 µL细胞染色缓冲液重悬细胞。
  5. 将细胞上机进行流式细胞仪检测，并根据制造商说明书分析抗体染色细胞。

5. 通过细胞计数法测定细胞生长曲线

  1. 使用两种方法将P5细胞用人间充质干细胞培养基稀释，制备单细胞悬液。
  2. 将8,000个细胞接种至24孔板的每孔中，每种方法共接种21孔。
    注意：接种前需用移液器轻轻吹打和抽吸混匀细胞。
  3. 接种后24小时，从三个孔中收集细胞。使用血细胞计数板进行细胞计数，并计算平均值。
    注意：细胞计数前轻轻振荡培养板。可适当延长振荡时间，以防止细胞聚集成团。
  4. 每隔24小时重复一次细胞计数，持续7天。以时间（天）为X轴，细胞数量（×104/mL）为Y轴，绘制生长曲线。

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结果

收集、培养及后续分析脐带间充质干细胞（UC-MSCs）的操作流程总结于图1中。采用本研究特有的方法将脐带精确地分割为若干段；主要操作步骤的具体示意图见图2。对组织块培养中外延细胞的生长情况进行常规监测和记录。培养约4天后，可见贴壁的梭形细胞逐渐从组织块中爬出，并越来越多地呈漩涡状排列。这些细胞被定义为P0代，并继续增殖以进行后续传代，且在增殖和传代过程中保持一致的细胞大小和形态。传统方法与当前方法在细胞大小和形态方面差异 negligible（可忽略）（图3）。

传统的解剖方法包括从血管和脐带（UC）内层上皮刮除外膜华通氏胶（WJ）。通过重量校正，两种方法在WJ得率上表现出显著差异。WJ得率可通过测量2 cm脐带（2.4 g ± 0.2 g）中WJ的重量百分比来计算。对当前方法与传统方法在WJ得率比例上的比较显示，采用新方法后WJ得率显著提高（图4A

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讨论

间充质干细胞（MSCs）是再生医学研究中的一个活跃领域，具有深远的应用前景22。其独特的生物学特性使其成为科学研究的焦点，并有望彻底改变多种疾病和损伤的治疗方式7。脐带华通胶来源的间充质干细胞（WJ-MSCs）是MSCs的一个独特亚群，可从脐带（UC）中血管间组织与羊膜上皮之间的胶状结缔组织中分离获得23。MSCs的临床应用关键在于获得足够数量的细胞24。然而，随着传代次数的增加，细胞开始表现出一定程度的衰老现象，MSCs的增殖能力在第5代（P5）之后逐渐下降24。因此，优化提高MSC产量的方法至关重要。

分离华通胶间充质干细胞（WJ-MSCs）最有效的方法是在保持其完整性的前提下解剖整个华通胶6。研究表明，来自脐带边缘区域的这些边界细胞比血管间区域的华通胶间充质干细胞具有更强的迁移能力和更高的增殖...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作受到国家自然科学基金（82172107）、广东省自然科学基金（2021A1515011927、2021A1515010918、2020A1515110347）、深圳市医疗卫生科研基金（SMRF.D2301015）、深圳市科技创新委员会（JCYJ20210324135014040、JCYJ20220530172807016、JCYJ20230807150908018、JCYJ20230807150915031）以及龙岗区经济与技术发展专项资金（LGKCYLWS2022007）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
APC 抗人 CD44 抗体 Biolegend 338806
24 孔细胞培养板Thermo Scientific142475
APC 抗人 CD73（外切-5'-核苷酸酶）抗体 Biolegend 344006
APC 小鼠 IgG1, κ 同型对照（FC）抗体Biolegend 400122
高压灭菌器HIRAYAMAHVE-50
自动细胞计数仪CountstarFL-CD
BAMBANKER 冷冻保存液Wako302-14681
细胞染色缓冲液Biolegend 420201
离心机Eppendorf5424R
超净工作台上海智城C1112B
CO2 培养箱Thermo ScientificHERAcell 150i
D-PBSSolarbioD1040
电热鼓风干燥箱上海精宏DHG-9423A
FITC 抗人 CD105 抗体 Biolegend 323204
FITC 抗人 CD90（Thy1）抗体 Biolegend 328108
FITC 小鼠 IgG1, κ 同型对照（FC）抗体Biolegend 400110
流式细胞仪BeckmanCytoFLEX
血细胞计数板Superior Marienfeld640410
细胞内染色通透洗涤缓冲液（10×） Biolegend 421002
倒置生物显微镜ZEISSAxio Vert. A1
液氮储存罐Thermo ScientificCY50935-70
生理盐水（NS）MeilunbioMA0083
PBSSolarbioP1032
PE 抗人 CD11b 抗体Biolegend 393112
PE 抗人 CD19 抗体 Biolegend 392506
PE 抗人 CD34 抗体Biolegend 343606
PE 抗人 CD45 抗体Biolegend 368510
PE 抗人 HLA-DR 抗体 Biolegend 307606
PE 小鼠 IgG1, κ 同型对照（FC）抗体Biolegend 400114
PE 小鼠 IgG2a, κ 同型对照（FC）抗体Biolegend 400214
精密电子天平SatoriusPRACTUM313-1CN
雪花制冰机ZIEGRAZBE 30-10
无菌 50 mL 塑料离心管Greniner227270
恒温水浴锅上海一恒HWS12
胰蛋白酶 1:250SolarbioT8150
UltraGRO-AdvancedHelios HPCFDCGL50
超纯水与纯水净化系统Milli-QMilli-Q Reference
无异种成分人源间充质干细胞培养基FUKOKU T2011301

参考文献

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