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通过流式细胞术有效检测Hoechst侧群细胞

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DOI：

10.3791/67012

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2024年8月23日

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1Institute of Hematology, Department of Hematology, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, 2The Lab of Aging Research, State Key Laboratory of Biotherapy, National Clinical Research Center for Geriatrics, West China Hospital, Sichuan University, 3Precision Medicine Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University

本文内容

摘要

本文表明，高功率375 nm和405 nm激光器可有效激发Hoechst 33342，并可作为355 nm激光器在侧群（SP）细胞检测中的可行替代方案，从而拓展了流式细胞术应用中可用激光器的范围。

摘要

通过Hoechst 33342染色并结合流式细胞术（FCM）可鉴定侧群（SP）细胞。Hoechst SP法利用ATP结合盒（ABC）转运蛋白的染料外排特性来分离干细胞。该方法最初用于造血干细胞（HSCs）的鉴定与分离，现主要应用于肿瘤干细胞（CSCs）的鉴定与分离。传统的FCM检测方法采用355 nm激光激发染料以检测SP细胞。本研究成功建立了可有效替代355 nm激光检测SP细胞的其他染料激发方法，即利用高功率的375 nm或405 nm激光，从而在SP细胞检测中实现更高的选择性，而不局限于355 nm激光流式细胞术。

引言

侧群（SP）细胞通过Hoechst 33342染色并结合流式细胞术（FCM）进行鉴定。SP细胞的特征是通过其ATP结合盒（ABC）转运蛋白将荧光DNA染料泵出细胞外1,2。该方法最初用于分离小鼠骨髓造血干细胞（HSCs）1。骨髓中的SP细胞富集了一群具有 CD117+Sca-1+Lin-Thy1low 表型特征的HSCs3,4。此后，该方法被广泛应用于从其他组织中分离和富集干细胞，包括心肌5、肝脏6、肺7、肾脏8和前脑9。特别是近十年来，该方法已被用于分离癌症干细胞（CSCs）。CSCs是一类数量较少的细胞群体，具有肿瘤起始、自我更新、耐受化疗以及转移潜能等特性10。CSCs最初在造血系统恶性肿瘤中被发现11，随后在多种实体瘤中也被观察到，如前列腺癌12、卵巢癌13、胃癌14、乳腺癌15和肺癌16。尽管目前已有多种CSC鉴定技术，但由于SP技术在不同组织和细胞系中具有广泛的适用性，仍被广泛采用。此外，该技术结合荧光激活细胞分选（FACS）是一种有效的CSC分离手段16,17,18。实验结果表明，SP细胞具有显著的致瘤能力，并且干细胞相关基因的表达水平显著升高19,20。我们先前的研究21也显示，对多发性骨髓瘤中分离的SP细胞进行转录组分析，发现干细胞相关信号通路（如Hedgehog通路）显著富集。同时，我们对急性髓系白血病SP细胞中差异表达基因进行了通路富集分析22，发现这些差异基因主要富集于干细胞相关通路（Wnt/β-catenin、TGF-β、Hedgehog、Notch）。研究发现，1 × 105个SP细胞可在BALB/c裸鼠体内形成肿瘤22，而非SP细胞则不能，表明SP细胞具有白血病干细胞的特性。Hoechst SP法在CSC鉴定中的有效性已得到充分证实。

Hoechst SP 检测方案随着研究的进展已得到优化和完善。该方案涉及对染料浓度、细胞密度、孵育温度和时间、缓冲液组成以及pH值的严格控制。按照本方案制备的细胞样品进行了流式细胞术分析。由于Hoechst染料需使用355 nm紫外激光激发，并通过690/50 nm滤光片（Hoechst红）和450/50 nm滤光片（Hoechst蓝）同时检测其荧光发射信号，因此FCM需要配备350 nm激光器。然而，由于成本较高，大多数流式细胞仪并未常规配备350 nm激光器。因此，我们尝试寻找一种替代方法，以实现通过流式细胞术有效检测SP细胞时对 染料的激发。在本研究中，评估并比较了375 nm和405 nm激光器在检测SP细胞方面的能力与355 nm激光器的性能。我们的研究结果表明，使用355 nm、375 nm和405 nm激光器检测到的SP细胞具有显著的一致性。这些结果提示，高功率的375 nm和405 nm激光器可作为检测SP细胞时355 nm激光器的可行替代方案。增加Hoechst 33342染料的可选激发光源，有助于更多型号的流式细胞仪应用于SP细胞检测。

方案

本研究中使用的实验共采用了10只年龄在8至12周之间的C57BL/6小鼠。实验操作均依照四川大学机构动物护理与使用委员会批准的方案进行（#201609309）。本文所用的实验材料及流式细胞术参数详见材料表。

1. 小鼠骨髓细胞的分离与收集

  1. 严格按照机构指南实施小鼠安乐死。为使小鼠失去意识，先给予2%异氟烷吸入麻醉，随后逐渐增加异氟烷剂量至5%，直至呼吸停止。
  2. 在手术室或通风橱内解剖小鼠。使用70%乙醇清洁并消毒小鼠。
  3. 用锋利的剪刀完全剪开腿部皮肤和肌肉，分离出股骨。
  4. 在研钵中用研磨棒轻轻碾碎股骨，并用DMEM培养基冲洗骨髓细胞，直至骨骼变白。
  5. 将获得的骨髓细胞通过100 µm滤膜过滤至15 mL离心管中，在4 °C条件下以800 × g离心5分钟。
  6. 弃去上清液，加入1 mL红细胞裂解缓冲液，在4 °C裂解残留红细胞1分钟。在4 °C以800 × g离心5分钟。离心后，再用DMEM培养基洗涤一次。
  7. 将细胞重悬于2 mL孵育液（DMEM培养基 + 5% FBS）中，使用自动细胞计数仪计数细胞，并用孵育液调整细胞浓度至1.0 × 106 个细胞/mL。

2. 细胞染色

  1. 向每只小鼠的2 mL骨髓细胞悬液中加入5 µg/mL Hoechst 33342。另取1 mL等分试样，加入100 µM维拉帕米作为阴性对照。
  2. 在37 °C水浴中孵育90分钟，每30分钟轻轻振荡一次。
  3. 孵育结束后，将细胞置于冰上冷却5分钟，然后在4 °C下以250 × g离心5分钟。用预冷的运行缓冲液（HBSS + 2% FBS）重悬细胞，于4 °C离心5分钟，弃去上清液。
  4. 将所得细胞沉淀每份用500 µL运行缓冲液重悬。在进行流式细胞术（FCM）分析前，向细胞中加入2 µg/mL碘化丙啶（PI），冰上放置约5分钟。

3. 流式细胞术

注意：有关所用各种系统和配置的概述，请参见表1。

  1. 使用流式细胞仪（FCM）中的日常质控（QC）荧光微球校准所需通道的变异系数（CV）值，并在成功完成质量控制后进行样本检测。
    1. 选择软件的桌面快捷方式并启动软件。
    2. 在“质控/标准化”菜单中选择开始质控/标准化，以进入质控实验界面。
    3. 将QC荧光微球样本管插入样本管架中。
    4. 点击开始加载样本并运行质控程序。质控通过后，流式细胞仪即可投入使用。
  2. 分别使用355 nm、375 nm和405 nm激光激发相同样本中的Hoechst 33342染料，以在690/50 nm通道检测Hoechst红光信号，在450/50 nm通道检测Hoechst蓝光信号。
    1. 在“文件”菜单中选择新建实验创建新实验，指定文件路径并保存实验。
    2. 在“设置”菜单中选择设置通道。选中通道信号复选框（Y585、V450、V660、NUV450、NUV660、UV450、UV660），然后在“标签”列中添加试剂名称（Y585：PI；V450：Hoechst Blue-405 nm；V660：Hoechst red-405 nm；NUV450：Hoechst Blue-375 nm；NUV660：Hoechst Blue-375 nm；UV450：Hoechst Blue-355nm；UV660：Hoechst Blue-355 nm）。
    3. 在图谱区域点击伪彩图图标创建图谱。点击坐标轴名称以更改所显示的通道。
    4. 在“样本管”界面点击添加样本管创建新的样本管并修改其名称。
    5. 选择运行加载样本、查看图谱并设定门控。调节增益和阈值参数，选择记录以保存数据。
  3. 设计门控设置逻辑。
    1. 对于第一个图谱，点击X轴选择FSC-W，点击Y轴选择FSC-A。选择多边形门绘制门A，圈选单个细胞并排除贴壁细胞（图1A）。
    2. 对于第二个图谱，点击X轴选择FSC-A，点击Y轴选择SSC-A。选择多边形门绘制门B，分离非碎片化细胞并排除细胞碎片（图1B）。
    3. 对于第三个图谱，点击X轴选择PI-A，点击Y轴选择SSC-A。选择多边形门绘制门D。选择PI染色阴性的活细胞（图1C），并绘制门C以获取活细胞群。
    4. 对于第四个二维图谱，点击X轴选择Hoechst Red，点击Y轴选择Hoechst Blue。右键点击图谱，从下拉菜单中选择属性。将X轴和Y轴均设置为线性格式。选择多边形门绘制门SP，以获取SP细胞（图1D）。
  4. 为评估样本适用性，使用特定流式细胞仪的355 nm激光23进行SP细胞检测。
  5. 同时使用355 nm（激光功率：20 mW）和405 nm（激光功率：80 mW）激光检测对照细胞（添加维拉帕米）和实验细胞。
  6. 在690/50 nm和450/50 nm通道采集对应于两种激光的荧光信号。观察355 nm和405 nm激光对Hoechst 33342染料的有效激发，并清晰显示SP细胞群（图2B-C）。
  7. 对于相同样本，使用375 nm（激光功率：60 mW）和405 nm（激光功率：80 mW）激光进行细胞检测。

结果

在图2中，对照组使用维拉帕米（verapamil）处理，该药物可阻断干细胞中的ABC转运蛋白，从而防止Hoechst 33342被清除。因此，未使用维拉帕米的组别中的干细胞会排出Hoechst 33342，形成被称为SP细胞的阴性细胞群。355 nm激光可有效激发Hoechst 33342染料，从而清晰观察到骨髓中的SP细胞（图2A）。通过355 nm激光与405 nm激光检测同一样品所获得的SP细胞结果基本一致（图2D）。

从图2和 图3可以看出，其他类型的非传统流式细胞仪也能识别SP细胞。结果表明，375 nm和405 nm激光均可有效激发Hoechst 33342以获取SP细胞（图3A-B）。在需要检测或分离CSCs或HSCs时，可选择使用375 nm或405 nm激光，而非355 nm激光。

流式细胞术图谱；FSC、SSC、PI、Hoechst染色；细胞大小、粒度分析。
图1：基于流式细胞术的设门策略用于检测SP细胞。（A）使用FSC-A和FSC-W排除黏附细胞。A门代表单细胞群。（B）采用FSC-A和SSC-A参数去除细胞碎片。B门代表完整细胞群。（C）选择碘化丙啶（PI）染色阴性的活细胞。C门代表活细胞群。（D）通过690/50 nm（Hoechst-red）和450/50 nm（Hoechst-blue）通道获取荧光信号。SP门代表SP细胞群。请点击此处查看该图的放大版本。

维拉帕米流式细胞术分析。图示为 Hoechst 染色细胞及其激发-发射数据。
图 2：高功率 405 nm 激光检测侧群细胞的效果与 355 nm 激光相当。（A）采用传统流式细胞仪的 355 nm 激光激发 Hoechst 33342 染料，以检测骨髓中的侧群细胞。（B, C）使用同一台流式细胞仪的 355 nm 和 405 nm 激光分别检测骨髓中的侧群细胞。（D）同一份样本经 355 nm 激光与 405 nm 激光检测所得的侧群细胞基本一致。请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术散点图，Hoechst染色，细胞周期分析，荧光强度分布。
图3：高功率375 nm和405 nm激光器能够检测侧群细胞。 （A）高功率375 nm激光器可检测侧群细胞。（B）骨髓中的侧群细胞也可利用405 nm激光器进行检测。 请点击此处查看此图的放大版本。

激光类型激光波长 (nm)激光功率 (mW)Hoechst 红色滤光片 (nm)Hoechst 蓝色滤光片 (nm)
Moflo Astrios EQ 氩气激光355100692/75448/59
CytoFLEX LX 半导体激光35520690/50450/50
40580690/50450/50
CytoFLEX S 半导体激光37560690/50450/50
CytoFLEX SRT 半导体激光40580690/50450/50

表1：流式细胞仪配置概要。

讨论

我们采用所述方案进行了三次实验，每次试验涉及3-4只小鼠，共使用了10只小鼠。SP细胞的比例在0.05%至0.76%之间。需要注意的是，不同小鼠之间存在个体差异。我们使用了四台流式细胞仪来分析Hoechst染色样本。观察到，在新型流式细胞仪上使用20 mW 355 nm激光激发Hoechst染料的效果，相当于在传统流式细胞仪上使用100 mW 355 nm激光的激发效果。这一现象可归因于两种系统所采用的激光类型不同。375 nm和405 nm激光所表现出的效果，可能原因是这两种激光具有较高的输出功率，并结合了雪崩光电二极管（APD）检测器的使用。Hoechst Red-A通道检测的是接近红光的长波长（690 nm），在此波长下光电倍增管（PMT）的光电转换效率相对较低。然而，APD的光电转换效率约为PMT的十倍24。因此，当APD检测器与高功率的375 nm和405 nm激光结合使用时，能够高效地区分SP细胞。405 nm激光不仅能够有效检测SP细胞，而且在区分弱Hoechst Red阳性细胞亚群方面，表现出优于355 nm激光的能力。

该实验方案的关键步骤是使用配备375 nm激光器或455 nm激光器的流式细胞仪，通过690/50 nm（Hoechst-红色）和450/50 nm（Hoechst-蓝色）通道检测细胞。尽管该技术采用375 nm和405 nm激光器而非355 nm激光器 （分析SP细胞的传统激光器 1）来检测SP细胞，而前者在流式细胞仪中更为常见，但需要高功率的375 nm和405 nm激光器，这构成了该技术的局限性。该方法的意义在于拓展了用于检测Hoechst染料的激光器范围，从而使其他型号的流式细胞仪也可用于SP细胞的检测。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

 本工作得到中国国家自然科学基金（编号：81800207）对 J.H. 的资助。衷心感谢贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc.）在流式细胞术检测及参数校准方面提供的支持。 我们感谢四川大学华西口腔医院口腔疾病研究国家重点实验室的 Jiao Chen，以及四川大学华西医院再生医学研究中心的 Yu Qi 在流式细胞术数据采集方面提供的帮助。  

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
自动细胞计数器Countstar1M1200
细胞滤膜（100 µm）BIOFILCSS-013-100
日常质控荧光微球Beckman CoulterB5230
含4.5 g/L葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM培养基）CORNING10-013-CVRC
胎牛血清CORNING35-081-CV
HBSSHycloneSH30030.02
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261
碘化丙啶（PI）Sigma-AldrichP4170
红细胞裂解缓冲液BeyotimeC3702
维拉帕米Sigma-AldrichV4629

参考文献

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