本文表明，高功率375 nm和405 nm激光器可有效激发Hoechst 33342，并可作为355 nm激光器在侧群（SP）细胞检测中的可行替代方案，从而拓展了流式细胞术应用中可用激光器的范围。
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本文内容
摘要
摘要
通过Hoechst 33342染色并结合流式细胞术（FCM）可鉴定侧群（SP）细胞。Hoechst SP法利用ATP结合盒（ABC）转运蛋白的染料外排特性来分离干细胞。该方法最初用于造血干细胞（HSCs）的鉴定与分离，现主要应用于肿瘤干细胞（CSCs）的鉴定与分离。传统的FCM检测方法采用355 nm激光激发染料以检测SP细胞。本研究成功建立了可有效替代355 nm激光检测SP细胞的其他染料激发方法，即利用高功率的375 nm或405 nm激光，从而在SP细胞检测中实现更高的选择性，而不局限于355 nm激光流式细胞术。
引言
侧群（SP）细胞通过Hoechst 33342染色并结合流式细胞术（FCM）进行鉴定。SP细胞的特征是通过其ATP结合盒（ABC）转运蛋白将荧光DNA染料泵出细胞外1,2。该方法最初用于分离小鼠骨髓造血干细胞（HSCs）1。骨髓中的SP细胞富集了一群具有 CD117+Sca-1+Lin-Thy1low 表型特征的HSCs3,4。此后，该方法被广泛应用于从其他组织中分离和富集干细胞，包括心肌5、肝脏6、肺7、肾脏8和前脑9。特别是近十年来，该方法已被用于分离癌症干细胞（CSCs）。CSCs是一类数量较少的细胞群体，具有肿瘤起始、自我更新、耐受化疗以及转移潜能等特性10。CSCs最初在造血系统恶性肿瘤中被发现11，随后在....
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方案
本研究中使用的实验共采用了10只年龄在8至12周之间的C57BL/6小鼠。实验操作均依照四川大学机构动物护理与使用委员会批准的方案进行（#201609309）。本文所用的实验材料及流式细胞术参数详见材料表。
1. 小鼠骨髓细胞的分离与收集
- 严格按照机构指南实施小鼠安乐死。为使小鼠失去意识，先给予2%异氟烷吸入麻醉，随后逐渐增加异氟烷剂量至5%，直至呼吸停止。
- 在手术室或通风橱内解剖小鼠。使用70%乙醇清洁并消毒小鼠。
- 用锋利的剪刀完全剪开腿部皮肤和肌肉，分离出股骨。
- 在研钵中用研磨棒轻轻碾碎股骨，并用DMEM培养基冲洗骨髓细胞，直至骨骼变白。
- 将获得的骨髓细胞通过100 µm滤膜过滤至15 mL离心管中，在4 °C条件下以800 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，加入1 mL红细胞裂解缓冲液，在4 °C裂解残留红细胞1分钟。在4 °C以800 × g离心5分钟。离心后，再用DMEM培养基洗涤一次。
- 将细胞重悬于2 mL孵育液（DMEM培养基 + 5% FBS）中，使用自动细胞计数仪计数细胞，并用孵育液调整细胞浓度至1.0 × 106 个细胞/mL。
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结果
在图2中，对照组使用维拉帕米（verapamil）处理，该药物可阻断干细胞中的ABC转运蛋白，从而防止Hoechst 33342被清除。因此，未使用维拉帕米的组别中的干细胞会排出Hoechst 33342，形成被称为SP细胞的阴性细胞群。355 nm激光可有效激发Hoechst 33342染料，从而清晰观察到骨髓中的SP细胞（图2A）。通过355 nm激光与405 nm激光检测同一样品所获得的SP细胞结果基本一致（图2D）。
从图2和 图3可以看出，其他类型的非传统流式细胞仪也能识别SP细胞。结果表明，375 nm和405 nm激光均可有效激发Hoechst 33342以获取SP细胞（图3A
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讨论
我们采用所述方案进行了三次实验，每次试验涉及3-4只小鼠，共使用了10只小鼠。SP细胞的比例在0.05%至0.76%之间。需要注意的是，不同小鼠之间存在个体差异。我们使用了四台流式细胞仪来分析Hoechst染色样本。观察到，在新型流式细胞仪上使用20 mW 355 nm激光激发Hoechst染料的效果，相当于在传统流式细胞仪上使用100 mW 355 nm激光的激发效果。这一现象可归因于两种系统所采用的激光类型不同。375 nm和405 nm激光所表现出的效果，可能原因是这两种激光具有较高的输出功率，并结合了雪崩光电二极管（APD）检测器的使用。Hoechst Red-A通道检测的是接近红光的长波长（690 nm），在此波长下光电倍增管（PMT）的光电转换效率相对较低。然而，APD的光电转换效率约为PMT的十倍24。因此，当APD检测器与高功率的375 nm和405 nm激光结合使用时，能够高效地区分SP细胞。405 nm激光不仅能够有效检测SP细胞，而且在区分弱Hoechst Red阳性细胞亚群方面，表现出优于355 nm激光的能力。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作得到中国国家自然科学基金（编号：81800207）对 J.H. 的资助。衷心感谢贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter, Inc.）在流式细胞术检测及参数校准方面提供的支持。 我们感谢四川大学华西口腔医院口腔疾病研究国家重点实验室的 Jiao Chen，以及四川大学华西医院再生医学研究中心的 Yu Qi 在流式细胞术数据采集方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 自动细胞计数器 | Countstar | 1M1200 | |
| 细胞滤膜（100 µm） | BIOFIL | CSS-013-100 | |
| 日常质控荧光微球 | Beckman Coulter | B5230 | |
| 含4.5 g/L葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM培养基） | CORNING | 10-013-CVRC | |
| 胎牛血清 | CORNING | 35-081-CV | |
| HBSS | Hyclone | SH30030.02 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| 碘化丙啶（PI） | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Beyotime | C3702 | |
| 维拉帕米 | Sigma-Aldrich | V4629 |
参考文献
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Zhou, S., et al.
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重印与许可
