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使用互补金属氧化物半导体高密度微电极阵列系统从急性脑片中获取高质量的类癫痫样活动

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DOI：

10.3791/67065

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2024年9月27日

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1Department of Cell Biology and Physiology, Brigham Young University, 2Neuroscience Center, Brigham Young University, 3Department of Statistics, Brigham Young University, 4Department of Biology, Brigham Young University, 5Department of Physics and Astronomy, Brigham Young University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文概述了一种使用互补金属氧化物半导体高密度微电极阵列系统（CMOS-HD-MEAs）的实验方案 记录类似癫痫发作的活动 离体 脑切片

摘要

互补金属氧化物半导体高密度微电极阵列（CMOS-HD-MEA）系统可用于记录细胞培养物的神经生理活动 离体 以CMOS-HD-MEA系统对脑切片进行前所未有的高精度电生理记录。CMOS-HD-MEA最初被优化用于记录细胞培养物中的高质量神经元单位活动，但也已证明可从急性视网膜和小脑切片中获得优质数据。近期研究人员已利用CMOS-HD-MEA从急性啮齿类动物皮层脑切片中记录局部场电位（LFPs）。其中一种受关注的LFP为类癫痫样活动。尽管许多使用者已通过CMOS-HD-MEA记录到短暂的自发性癫痫样放电，但极少有人能稳定地诱导出高质量的类癫痫样活动。造成这一困难的因素可能包括电噪声、使用浸没式记录室时类癫痫样活动产生过程的不稳定性，以及二维CMOS-MEA芯片仅能记录脑切片表面信号的局限性。本方案详述的技术应可帮助使用者借助CMOS-HD-MEA系统在急性脑切片上稳定诱导并记录高质量的类癫痫样活动。此外，本方案还介绍了CMOS-HD-MEA芯片的正确处理方法、实验过程中溶液与脑切片的管理，以及设备的维护措施。

引言

市售高密度微电极阵列（HD-MEA）系统，包含具有数千个记录位点的MEA芯片1,2 以及用于放大和数字化数据的MEA平台，是电生理学研究中一种新兴工具。这些高密度MEA（HD-MEA）系统采用互补金属氧化物半导体（CMOS）技术，可从细胞培养物中高灵敏度地记录电生理数据 离体 脑片制备。这些MEA系统凭借高密度电极和优质的信噪比，为神经生理学研究提供了前所未有的空间和时间分辨率3该技术主要用于研究细胞外动作电位，但也可从多种神经元脑片制备样本中采集高质量的局部场电位（LFPs）4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15由于上述CMOS-HD-MEA系统具备高分辨率记录能力，用户能够以极高的空间精度追踪电生理活动16,17,18这一能力对于追踪网络局部场电位（LFPs）的传播模式尤为重要5,12,15,19,20,21因此，CMOS-HD-MEA 系统能够以前所未有的方式揭示来自多种细胞培养和脑片制备中生理及病理活动的传播模式。尤其值得注意的是，CMOS-HD-MEA 系统的这些能力使研究人员能够同时对比不同脑区的癫痫发作模式，并检测各种抗癫痫化合物对这些模式的影响。通过这种方式，该系统为研究癫痫发作的产生机制（ictogenesis）和发作期传播（ictal propagation），以及理解药理学如何干扰病理性的神经网络活动，提供了一种创新的方法。7,10,14因此，CMOS-HD-MEA 系统这些新功能可显著推动神经系统疾病的研究，并有助于药物发现研究5,7,11,22我们旨在提供使用CMOS-HD-MEA系统研究类癫痫样活动的详细方法。

在使用CMOS-HD-MEA系统研究局部场电位（LFP）时，例如在急性脑片中研究癫痫样活动，研究人员可能面临诸多挑战，包括严重的电噪声干扰、实验过程中维持脑片的健康状态，以及从仅记录脑片表面信号的二维（2D）CMOS-MEA芯片中检测到高质量信号。本方案描述了正确接地MEA平台及实验中所用其他设备的基本步骤，这是至关重要的一环，且可能需要根据每个实验室的具体配置进行个性化调整。此外，我们还讨论了在CMOS-HD-MEA系统所用浸没式记录舱中进行长时间记录时，维持脑片健康状态的相关操作步骤23,24,25。另外，与更常见的电生理记录方法（可记录脑片深层信号）不同，大多数CMOS-HD-MEA系统采用不穿透脑片的二维芯片。因此，这些系统依赖健康的神经元外层来产生大部分记录到的LFP信号。其他挑战还包括如何可视化由数千个电极产生的海量数据。为克服这些困难，我们推荐一种简单而有效的方案，以提高获得高质量、可在脑片中传播的网络性癫痫样活动的可能性。我们还简要介绍了一个公开可用的图形用户界面（GUI）以及相关资源，以辅助数据可视化10。

既往发表的文献已提供了MEA记录系统的相关实验方案26,27,28,29。然而，本研究旨在为使用CMOS-HD-MEA系统搭配二维芯片的研究人员提供支持，特别是针对希望从脑片中研究高质量癫痫样活动的研究者。此外，我们比较了两种最常用的诱发癫痫样活动的溶液干预方法，即无镁离子（0 Mg2+）和4-氨基吡啶（4-AP）模型，以帮助用户确定最适合其特定研究需求的致痫培养基。尽管本实验方案主要聚焦于癫痫样活动的诱导，但也可经适当修改后用于探索脑片中的其他电生理现象。

方案

涉及小鼠的实验程序已获得杨百翰大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。实验中使用了雄性和雌性（n = 8）C57BL/6小鼠，年龄至少为P21。

啮齿类动物脑组织制备、MEA芯片设置、灌注及数据分析流程示意图。
图1：CMOS-HD-MEA实验的示意图。（A）采用研究者偏好的切片方法制备脑片，并进行亚区解剖以适配MEA芯片。（B）准备所需溶液和CMOS-HD-MEA芯片。（C）将亚区解剖后的脑片放置于电极阵列上，并浸没在适当的溶液中。（D）从采集的数据中选择相关通道，随后将数据导入用户偏好的分析软件进行处理。请点击此处查看该图的放大版本。

名称浓度 (mM)g/L
氯化钠 (NaCl)1267.36
氯化钾 (KCl)3.50.261
磷酸二氢钠 (NaH2PO4)1.260.151
碳酸氢钠 (NaHCO3)262.18
葡萄糖 (C6H12O6)101.80
氯化镁 (MgCl2)1 (来自 1 M 储液)1 mL
氯化钙 (CaCl2)2 (来自 1 M 储液)2 mL

表1：aCSF溶液。

1. 溶液的配制

  1. 准备实验溶液。
    1. 制备1 L人工脑脊液（aCSF）（详见表1）。
    2. 制备1 L致惊厥溶液。
      注意：本实验方案中用于诱导类似癫痫活动的溶液，可选用含100 µM 4-氨基吡啶（4-AP）的aCSF，或无镁离子的aCSF。
    3. 使用多孔石对所有溶液进行碳合气（carbogenate）处理，至少持续10分钟，然后使用。
    4. 准备一个烧杯用于废弃溶液的收集。
    5. 将1 L aCSF、1 L致惊厥溶液以及废弃溶液用的烧杯放置在灌流系统附近的台面上。
  2. 准备切片和孵育室溶液
    1. 制备0.5 L aCSF，省略CaCl2，并加入3 mM MgCl2（而非1 mM），以配制特殊的切片用溶液。将该溶液保存，用于啮齿类动物脑片制备，并将其放置在急性脑片制备区域附近。
    2. 制备0.5 L aCSF，并将其放入组织孵育室中，用于保存脑片以备后续实验使用。将多孔石插入组织孵育室中，并在将亚解剖后的脑片放入孵育室前，至少进行10分钟的碳合气处理。

2. 准备啮齿类动物脑切片

  1. 按照上述方法制备所有溶液（参见第1节）。确保在制备过程中所有溶液均充分通入碳氧混合气体（carbogen）。
    注意：推荐使用切割溶液（参见第1.2节），但也可使用其他切割溶液以获得高质量的脑片，例如蔗糖切割溶液30。
  2. 使用振动切片机切割350 µm厚的啮齿类动物脑片。相关仪器操作方案详见参考文献30,31,32,33。
  3. 将切割后的脑片修剪至适合放置于MEA芯片记录电极区域的大小（参见图2）。如图1A和图2A所示，在振动切片机的切片室中，使用10号外科手术刀轻轻来回滚动刀片，对脑片进行二次精细切割。操作时需小心，避免损伤修剪后的脑片。
  4. 将修剪好的脑片置于盛有aCSF的组织保存室中。在放入修剪后的脑片前，确保保存室中的aCSF已通入碳氧混合气体至少10分钟。

3. 仪器设备准备

  1. 准备MEA芯片和系统（图2 和 图3）
    注意：硬质材料（如塑料和金属）若用力接触芯片孔底部，容易损坏MEA芯片。使用移液器向芯片中加入或移出溶液时，切勿让移液器接触芯片孔底部，尤其是芯片孔侧边的参比电极和芯片孔中心的记录电极（图2C）。应将溶液悬空加入芯片孔底部上方，或接触/靠近芯片孔的塑料边缘进行加样。为便于完全移除所有溶液，可将芯片略微倾斜，使液体聚集于芯片孔一侧，然后从积液表面吸取；也可使用防静电擦拭纸轻轻蘸取残留溶液区域。切勿通过握持芯片孔或芯片引脚来搬运芯片（图2C）。芯片孔可容纳约4 mL溶液。后续步骤中，如无特别说明，向芯片孔中加入约2 mL溶液。
    1. 在开始芯片准备前，为不同用途指定专用的转移移液器。分别标记一支移液器用于乙醇，一支用于废液，一支用于aCSF，其余根据需要为其他溶液配备专用移液器，以防止意外混合。
    2. 用190度乙醇填充MEA芯片的孔，使芯片孔底部完全被覆盖（图3）。让乙醇静置30-60秒，然后用废弃移液器将其移除。
    3. 用aCSF填充MEA芯片孔，并用废弃移液器将其移除，以冲洗残留的乙醇。使用预先指定的废液和aCSF移液器，重复向芯片孔中加入并移除aCSF三次。完成三次清洗后，再次加入aCSF并静置至少30秒。
      注意：在用乙醇和aCSF清洗后，若aCSF在芯片腔室内保留至少45分钟，记录电极因疏水相互作用产生的噪声最小。
    4. 在将MEA芯片插入平台前，用190度乙醇润湿一块防静电擦拭纸，并用其擦拭芯片引脚（图2C）。
    5. 轻轻将MEA芯片滑入MEA平台，并启动对接机制以固定芯片。
    6. 检查记录电极和参比电极是否存在气泡（图2C）。如有气泡，使用干净的画笔轻轻扫过电极表面以去除气泡。
    7. 使用CMOS-HD-MEA软件34检查芯片是否存在噪声，并通过伪彩色图直观扫描是否存在气泡、非生物性振荡或由电干扰引起的尖峰信号。适当接地以消除所遇到的任何噪声。
      注意：接地设置将取决于记录环境。在本实验方案中，MEA平台和灌流系统均已接地。

用于记录和分析神经活动的小鼠脑切片微电极阵列示意图。
图 2：配置与技术示意图。（A）本实验方案重点介绍的急性小鼠脑切片选取区域示意图。（1）海马区；（2）新皮层区。（B）急性小鼠脑切片及琴状固定装置在微电极阵列（MEA）上的正确放置方式。（C）3Brain Accura CMOS-HD-MEA 芯片的结构示意图。（D）灌流入口与出口的正确配置。输入管路应深入芯片孔底部，而输出管路应位于芯片孔顶部、与入口相对的一侧，以确保持续流入新鲜且含氧的 aCSF。 请点击此处查看该图的放大版本。

脑片电生理实验装置示意图；冲洗、安装、覆盖并使用拧成股的防静电擦拭纸。
图3：脑片实验中芯片准备与放置的示意图。（A）先用乙醇冲洗芯片孔一次，再用aCSF冲洗三次。（B）使用防静电擦拭纸蘸乙醇擦拭引脚。（C）将芯片安装到位。（D）将脑片放置在电极上。（E）将栅网（harp）放置在脑片上（正确的放置方法参见图2）。（F）用拧成股的防静电擦拭纸轻蘸靠近脑片的记录电极孔的角落。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 实验

  1. 放置脑片
    1. 将铂金丝网置于称量皿（或其他洁净表面）上，靠近MEA平台。用约3 mL aCSF覆盖丝网，以降低其疏水性。
    2. 使用剪刀剪去移液管尖端的细小部分。剪掉约三分之一（约1.5英寸）的移液管尖端。
      注意：此改造后的移液管在收集和转移脑片时不会对其造成挤压或损伤。
    3. 用改造后的移液管从切片保存室中取出一片脑片。轻柔地将脑片及移液管中的溶液排入芯片孔中。为正确放置脑片，可轻轻从另一移液管释放更多aCSF以调整脑片位置，或使用软毛画笔在溶液中制造液流，推动脑片覆盖至记录电极上。尽量减少与记录电极或脑片的接触，以最小化损伤。
    4. 使用镊子，将丝网轻轻放置于脑片上方，线面朝下，以压紧脑片使其贴附于记录电极上。避免丝网接触电极阵列。调整丝网方向，使其无框的一侧朝向进液针，且丝网框架不接触任何记录电极（图2C，D）。
    5. 取一支废弃移液管，吸除多余的aCSF。取一块防静电擦拭布，将其一角拧成尖端，用于吸除记录电极周围残留的aCSF，注意不要触碰记录电极、脑片或丝网（图2）。
    6. 使用专用的aCSF移液管，迅速加入足量的碳合aCSF以覆盖脑片，约2 mL。
    7. 重复步骤4.1.5和4.1.6两次。
    8. 用碳合aCSF填充孔洞，直至孔洞约¾满，约3 mL。
    9. 使用显微镜或相机拍摄MEA芯片上的脑片图像。确保图像具有足够高的分辨率，能够清晰显示记录电极阵列的边界以及脑片的解剖结构。
  2. 运行实验
    1. 操作灌流系统
      1. 将进液管和出液管插入装有aCSF的烧杯中，并将进液针和出液针插入芯片孔内。将进液针置于芯片孔底部附近，位于记录电极阵列外侧。将出液针置于芯片孔顶部边缘附近，使液体上升至接近孔口边缘，约4 mL，确保整个实验过程中脑片始终浸没于液体中（图2D）。
      2. 设置灌流系统的进液速率为5 mL/min，出液速率为7 mL/min。
        注意：建议出液速率高于进液速率，以避免溶液从芯片孔溢出，并在脑片表面形成液流。
      3. 打开进液和出液。将进液针从芯片孔中取出，直至针头开始排出液体而非空气，然后将其重新放回步骤4.2.1.1所述位置。
      4. 使用溶液加热器将溶液维持在生理温度或接近生理温度，约为34–37 °C。
      5. 让aCSF持续灌流脑片10分钟，使脑片适应记录环境。
      6. 10分钟后，将出液管转移至废弃烧杯中，再将进液管移至含有致痫溶液的烧杯中。让非致痫性aCSF在10分钟内被冲洗出灌流系统并流入废弃烧杯。
      7. 将出液管转移至含有致痫溶液的烧杯中。
      8. 让致痫溶液持续循环，直至实验结束。
      9. 若脑片记录时间超过2小时，建议准备另一份致痫溶液，以补偿活跃脑片对葡萄糖的消耗。
    2. 更换脑片
      1. 关闭进液。10–15秒后关闭出液。
      2. 使用镊子取下丝网，并将其放置于称量皿或其他表面上。
      3. 使用改造后的移液管取出并丢弃脑片。切勿触碰参考电极或记录电极阵列（图2C）。
      4. 将进液管放回装有非致痫性aCSF溶液的烧杯中，出液管置于废弃烧杯中。进液针和出液针保留在芯片孔内。运行灌流系统10分钟，以彻底清除芯片孔和灌流系统中残留的致痫溶液。使用新的脑片重新开始实验流程（从步骤4.1开始）。
  3. 结束实验
    1. 清洗装置
      1. 依次从孔中移除丝网、脑片和溶液。
      2. 卸下MEA芯片，将其放置于洁净表面上，并向芯片孔中加入去离子水。
      3. 倒掉去离子水，以清除aCSF溶液残留的盐分。
      4. 使用移液管向芯片孔中加入洗涤剂溶液。将移液管尖端悬于芯片孔内，并对准记录电极。快速反复挤压和释放移液管，使洗涤剂剧烈冲洗记录电极1分钟。静置5–10分钟。
      5. 吸除洗涤剂，然后用去离子水冲洗芯片孔4–6次，以彻底去除洗涤剂及任何残留溶质。
      6. 吸干芯片孔中的所有水分，然后将一块防静电擦拭布覆盖在MEA芯片上，过夜干燥。
      7. 在MEA记录平台原先放置MEA芯片的位置，放置一个称量皿或其它防水托盘。将丝网置于托盘中央，并将进液针和出液针分别置于丝网两侧。
      8. 通过管路向废弃烧杯中依次灌注50 mL水、50 mL 140度乙醇和200 mL水，以清洗灌流系统和丝网。
        注意：此时可提高灌流速度以缩短清洗时间，但出液速度必须始终高于进液速度，以防溢流。
      9. 清洗碳合石：将其置于盛有蒸馏水的烧杯中，并通过管路通入碳合气5分钟。随后将其取出，放置于干燥洁净的表面上过夜，并加以覆盖以防灰尘积聚。

5. 数据分析

注意：用于分析由 CMOS-HD-MEA 产生的电生理数据的分析软件包有多种，包括 3Brain 公司的 BrainWave、Yet Another Spike Sorter (YASS) 以及自定义的 Python 工具34,35,36,37。我们从 BrainWave 的数据文件格式中提取数据，用于 Xenon LFP 分析平台，以生成 图4 和 图5 中展示的结果。图6 中的数据分析使用了自定义的 Matlab 代码。Xenon LFP 分析平台的相关操作流程已公开提供10。以下步骤专门针对使用 Brainwave 438 进行的记录；对于其他系统，请参考相应系统的支持文档34,35,36,37。下文提供了采用本方案生成数据的分析步骤概览。有关数据导出、可视化和分析的完整操作细节，包括教学视频和所有相关代码文件，请参见39。

  1. 导出记录文件以进行分析。
    1. 为将要降采样的数据记录文件创建一个文件夹。
    2. 裁剪在步骤 4.1.9 中拍摄的图像，仅保留包含脑切片的记录阵列部分。
    3. 打开 ExportToHDF5-ChannelSelection.py 文件（该代码文件可在 GitHub 的 xenon-lfp-analysis/code-files/3Brain-processing40 目录下获取），并将窗口顶部列出的 URL 复制粘贴到网页浏览器中。
    4. 输入数据记录文件的文件路径，并上传与该记录相关联的阵列裁剪图像。
    5. 在 选择导出通道 下，使用套索选择工具在阵列的裁剪图像上选中海马区和新皮层区域。
    6. 将跳过的行数和跳过的列数均设置为 2。
      注：记录文件通常较大；如果适合所需的分析，可对导出的数据进行降采样。可选择空间降采样（通过跳过记录电极的行和列）和时间降采样（通过降低采样频率）。在本分析中，每隔 2 行和 2 列进行跳过；这可在空间上对数据进行降采样，同时避免对特定通道产生偏差。各通道之间的距离足够远，其活动差异可能具有显著性；因此，不进行通道信号平均。当跳过电极的行和列时，未选中通道的数据不会包含在输出文件中。
    7. 将降采样频率设置为 300 Hz。
    8. 点击 导出通道 按钮以生成通道选择文件。
      注：软件将自动将通道选择文件保存至数据记录文件所在的文件夹。
    9. 打开 ExportToHDF5-ExtractDownsample.py 文件（同样可在 GitHub 的 xenon-lfp-analysis/code-files/3brain-processing40 目录下找到），粘贴包含通道选择文件和数据记录文件的文件夹路径，然后按键盘上的回车键，生成数据记录文件的降采样版本。
  2. 使用分析平台
    1. 在计算机的命令提示符中输入 run_lfp_analysis，然后按回车键以打开分析平台。
    2. 输入图像和降采样后记录文件的文件路径，然后点击提交。
    3. 在 选择分析时间范围 下，选择整个记录时段。
    4. 在 选择绘图通道 下，将海马区设为第 1 组，新皮层设为第 2 组。
    5. 在 通道点阵图 下，将 阈值 设为 0.06 mV，将 时间持续时间 设为 0.02 s。
    6. 点击 应用设置并生成点阵图。
    7. 利用点阵图探索显示感兴趣活动模式的不同通道。
      ​注：高质的类癫痫样活动示例见 图 4（图 4A-D），质量欠佳的活动示例见（图 4E-F）。

脑活动分析；新皮层、海马区通道数据比较；图表；0 Mg\(^2+\)，4AP。
图4：0 Mg2+ 和 4-AP 模型中癫痫样活动演化的示例。（A）在约40分钟内施加含0 Mg2+的aCSF所产生的示例点阵图。（B）从新皮层（蓝色）和海马区（红色）记录的示例电生理轨迹，显示来自0 Mg2+模型的癫痫样活动。（C）在约40分钟内施加100 mM 4-AP所产生的示例点阵图。（D）从新皮层（紫色）和海马区（绿色）记录的示例电生理轨迹，显示施加4-AP后产生的癫痫样活动。（E）在约40分钟内施加含0 Mg2+的aCSF所产生的示例点阵图，显示的是爆发样活动，而非其他代表性轨迹中所见的类惊厥活动。（F）从新皮层（深紫色）和海马区（铁锈色）记录的示例电生理轨迹，显示0 Mg2+模型中次优的活动状态，用于与B和D中所见的高质量类惊厥活动进行对比。请点击此处查看该图的放大版本。

神经活动频谱图和电生理轨迹，展示脑区反应。
图5：0 Mg2+ 和 4-AP 模型诱导的癫痫样放电的代表性结果。（A）由 0 Mg2+ 模型诱导的典型新皮层类癫痫发作事件示例图，包括（Ai）类癫痫发作事件的频谱图，（Aii）相应的电生理轨迹，（Aiii）对 Aii 轨迹应用的 80 Hz 高通滤波结果，（Aiiii）Aii 轨迹的放大区段。（B）由 0 Mg2+ 模型诱导的典型海马癫痫样爆发示例图，包括（Bi）癫痫样爆发的频谱图，（Bii）相应的电生理轨迹，（Biii）对 Bii 轨迹应用的 80 Hz 高通滤波结果，（Biiii）Bii 轨迹的放大区段。（C）由 4-AP 模型诱导的典型新皮层类癫痫发作事件示例图，包括（Ci）癫痫样活动的频谱图，（Cii）相应的电生理轨迹，（Ciii）对 Cii 轨迹应用的 80 Hz 高通滤波结果，（Ciiii）Cii 轨迹的放大区段。（D）在 4-AP 模型下海马癫痫样爆发的示例图，包括（Di）癫痫样活动的频谱图，（Dii）相应的电生理轨迹，（Diii）对 Dii 轨迹应用的 80 Hz 高通滤波结果，（Diiii）Dii 轨迹的放大区段。请点击此处查看该图的放大版本。

不同范式下各脑区高频振荡功率的箱线图与表格比较。
图6：在刻板样癫痫样放电期间，不同范式和脑区各频段相对于基线功率百分比的比较。（A）对于大多数频段，癫痫样放电期间的功率在不同范式和脑区之间存在显著差异（双因素方差分析，Tukey 检验，*P < 0.05，**P < 0.001，***P < 0.0001）。每个箱线图中间的线表示均值，箱子的上下边界为均值±1个标准误（SEM），最外侧的线为均值±2个标准误。）（B）两种范式和各脑区在150 Hz以上与高频活动相关的频段中均表现出有限的功率。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

在对来自多个通道的活动进行可视化时，通常的做法是1,4,5,10，我们发现首先生成使用CMOS-HD-MEA系统所获取数据的点阵图是有益的（图4A、C、E）。该图通过在y轴上显示每个通道、在x轴上显示时间，可提供每片脑切片中所有记录通道活动的鸟瞰视图。在此点阵图中，每个信号点代表一个超过设定的LFP电压阈值的通道（见步骤5.2.6及先前发表的研究10）。此类点阵图可指示电生理活动在时空上的发生位置与时间（图4A、C、E）。以这种方式可视化数据，可使用户充分利CMOS-HD-MEA系统的空间与时间分辨率能力。来自对应于点阵图通道的新皮层和海马区代表性轨迹展示了各通道特定LFP数据的可视化方式（图4B、D、F）。不同脑区和实验范式下的癫痫样放电事件的放大图显示于图5，而0 Mg2+范式与4-AP范式下观察到的相对频段功率的比较总结于图6。在所有显示的频段（1–150 Hz）中，两种范式下海马区和新皮层区的类发作活动均显著高于基线水平，该结果已通过数字陷波滤波器去除60 Hz电噪声（北美交流电频率）。

使用0 Mg时2+ 对于4-AP模型，新皮层区域经常观察到强烈的脑电图样癫痫样活动。海马区域在不同脑片之间表现出更大的变异性，部分脑片显示癫痫样活动，而其他脑片则呈现较短（约1秒）的短暂放电。图4 和 图5）。每次记录的功率均归一化至10秒 "安静" 每次记录开始时的基线段，期间未观察到放电现象。所有进一步的讨论均基于 "功率" 表示与样本内对照基线相比的频谱功率。在0 Mg条件下，新皮层活动在多个频段表现出更强的功率。2+ 与4-AP范式相比，该范式在 delta（1-4 Hz）、theta（4-8 Hz）、低 gamma（30-60 Hz）和高 gamma（60-150 Hz）频段均表现出差异。图6）。此外，0 Mg条件下海马的活动性2+ 与0 Mg条件下新皮层相比，该范式在高频γ频段（60-150 Hz）显示出更高的功率2+ 范式中，以及与4-AP范式中检测的两个脑区相比时图6）。尽管在我们的研究中，与0 Mg相比，4-AP范式在大多数频段表现出的功率较低2+ 在所述条件下，海马区4-AP样本倾向于表现出更多的总体癫痫样放电（图4D）。在分析高频活动时，我们未观察到不同脑区或范式之间存在任何差异。图6B）。这很可能是因为记录是在二维非穿透式记录芯片上进行的，意味着由于产生活动的神经元与电极记录位点之间存在距离，高频活动可能未被有效捕捉。综上所述，本文结果表明，在使用CMOS-HD-MEA系统配合二维CMOS-MEA芯片时，采用0 Mg条件通常可在癫痫样放电期间获得更高的总体信号功率2+ 范式，可记录高质量数据至高伽马频段（1至150 Hz）。此外，本文所呈现的数据表明，若希望利用该方案研究伽马频段的信息，则4-AP模型可能并非此系统的理想选择。然而，该模型在较低功率频段可提供丰富的数据，同时表现出大量癫痫样放电。重要的是，采用上述方案时，两种模型均能表现出高质量的类癫痫发作活动。

不同癫痫发作模型之间的差异可能导致基于这些范式细胞机制以及脑区微观解剖结构的特征性独特癫痫样活动模式41。例如，4-AP 可阻断特定类型的电压门控 K+ 通道（主要是 Kv3 家族），延长神经元兴奋性的持续时间，从而在数分钟内诱导海马区出现癫痫样活动42,43,44,45,46。然而，当暴露于 4-AP 时，新皮层通常比海马区出现癫痫样活动的潜伏期要长得多41。另一方面，0 Mg2+ 模型主要通过洗脱谷氨酸能神经元中 NMDA 受体的 Mg2+ 阻断作用，从而诱导早期的新皮层癫痫样活动47,48,49,50。尽管在许多突出的组别中，不同脑区与范式之间存在显著差异，但这些范式与脑区之间也保留了一些关键的相似性。在所有脑区和范式中，alpha 和 beta 频段的功率均具有可比性；在海马区域内，不同范式在 delta 频段的表现也相似（图6）。此外，正如预期，在癫痫样活动期间，所有频率（1–150 Hz）的总体功率均较基线水平升高（图5 和 图6）。最后，在暴露于 4-AP 期间对新皮层区域的一个值得注意的观察结果是：在频谱图中呈现出条纹状模式，表现为发作起始时较高频率的活动增强，随后随着活动进展频率逐渐降低（图5C），这可能提示发作起始阶段存在较高的神经元间同步性。

讨论

本方案包含针对急性脑片管理的具体指南，旨在解决CMOS-HD-MEA使用者常遇到的两个问题：脑片下方产生噪声，以及维持脑片的健康环境。当脑片未能充分贴附于电极阵列时，会在其下方形成气泡，从而导致噪声的产生；这种噪声将导致无法获取有效数据。为缓解这些问题，本方案强调两个关键步骤：第一，在放置脑片时确保弓形丝装置方向正确，以避免灌流液流入时扰动脑片（步骤4.1.4）；第二，使用防静电擦拭布清除电极周围多余的aCSF，以促进脑片有效贴附（步骤4.1.5–4.1.7）。方案中另一个重点问题是芯片表面的疏水性，这可能导致气泡形成并在记录过程中引入噪声。推荐通过乙醇处理后用去离子水冲洗的方法来缓解该问题（步骤3.1.2、3.1.3和3.1.6）。然而，若问题仍然存在，还可采取额外措施：用140-proof乙醇充满芯片孔，再用画笔轻轻刷洗电极阵列30至60秒，随后吸除乙醇，并用去离子水冲洗芯片孔三次。之后，向孔中加入aCSF，并从步骤4继续执行后续操作。

维持脑片的健康环境至关重要，需通过合理放置进液和出液针头以及调节灌流系统的流速来实现（步骤 4.2.1）。必须对脑片进行充分的氧合，并找到最有效的灌流速率23,51。由于上述问题，界面式记录舱（interface chambers）常被用于急性脑片记录，可提供更稳定的氧合条件。然而，已有研究报道，使用界面式记录舱会导致神经元间细胞外间隙受压，从而随时间推移改变脑片的生理状态24,52,53。这种生理状态的改变会引起表面张力动力学变化，导致神经元的基础电敏感性升高54。这种额外的兴奋性会增加类癫痫事件及其他感兴趣的局部场电位（LFP）出现的可能性。相比之下，大多数CMOS-HD-MEA平台采用的浸没式记录舱能够更高效地向脑片输送药物和葡萄糖23,51。为了在使用CMOS-HD-MEA平台进行持续超过2小时的记录过程中维持脑片的健康状态，建议预先准备另一种促癫痫溶液（步骤 4.2.1.9），以确保脑片拥有足够的葡萄糖来持续产生电活动。

空间分辨率的缺乏可能是电生理学中的主要局限性23,55。例如，膜片钳是一种常用于电生理学的技术，能够详细揭示单个细胞在网络活动中的行为；然而，膜片钳的一个局限性在于，记录仅来自单个细胞，默认情况下也仅来自单一位置。尽管膜片钳可用于研究网络活动，但它对网络活动的空间描绘仍较为有限41,56。某些成像技术确实能够提供神经元活动的广泛空间细节，例如基因编码的荧光生物传感器；但其代价是时间分辨率的降低57,58,59。多模态方法，如单通道或多通道电极记录，可与钙成像结合使用，以实现更高的时空分辨率；然而，电生理记录的空间分辨率仍然局限于少数几个位置60,61。当正确使用时，CMOS-HD-MEA 技术可通过高空间密度（电极间距通常为 20–200 µm）同时记录多个脑区的活动，从而帮助用户克服上述局限性（图4）。CMOS-HD-MEA 数据可使研究人员比使用大多数其他记录技术更详细地区分和表征脑切片中传播的活动模式10,62,63。尽管 CMOS-HD-MEA 技术在具备高时间分辨率的同时表现出优异的空间映射能力64，但仍存在一些局限性，例如由于使用非穿透性二维阵列，难以在皮层切片上稳定记录单个细胞的活动，以及无法用于in vivo 实验。CMOS-HD-MEA 系统通常仅记录皮层切片的局部场电位；然而，在切片制备质量较高的情况下，某些通道可能捕捉到细胞外动作电位，尽管该能力可能不稳定。可通过使用高通滤波器（约 50 Hz 高通）结合峰电位分类软件，在 CMOS-HD-MEA 系统记录的通道上分析单细胞单位活动65,66,67。值得指出的是，有可能将微电极记录与 CMOS-HD-MEA 系统结合，从而在少数位置获取单细胞信息，并与丰富的 CMOS-HD-MEA 数据进行整合5。当前基于非穿透性二维芯片的方法受限于检测皮层脑区高频活动（150–500 Hz）的困难。这可能是由于产生活动的神经元与记录电极之间的距离所致（图6B）。这一挑战可通过使用新型穿透性 3D-CMOS-HD-MEA 芯片来克服，此类芯片可从脑切片内部而非仅在其表面进行记录68。

通过上述方案，我们获得了示例数据，以展示使用这些仪器可实现的高质量局部场电位（LFP）信号，这些信号表现为类似癫痫发作的活动（图4 和 图5）。我们证明了尽管不同记录范式之间存在特异性差异，但在CMOS-HD-MEA系统中仍可观察到类似癫痫发作的活动（特别是使用4-AP和无镁离子（0 Mg2+）条件下的记录范式）。

综上所述，本研究中采用CMOS-HD-MEA所展示的实验方案及示例数据为高保真度的空间和时间分辨局部场电位（LFP）数据的采集提供了可行路径。该技术的未来应用包括将本方案拓展至其他可诱导癫痫样活动的实验范式，并将CMOS-HD-MEA与成像等互补技术相结合。这些研究无疑将借助简单的脑片模型，增进我们对人类癫痫类疾病的理解69。例如，通过改进本方案，可实现对多种癫痫动物模型中电生理行为与临床相关基因突变位点的遗传图谱进行深入的交叉分析70。尽管本文聚焦于癫痫样活动，但其他重要的神经网络活动（如长时程增强效应）亦可利用CMOS-HD-MEA系统以前所未有的空间分辨率进行研究。我们希望本实验方案及相关技术能够被广泛应用，帮助领域内研究者克服数据采集中的挑战，发展更为精确的研究方法，以深入理解包括癫痫在内的多种神经系统疾病。

披露

作者声明本研究不存在任何利益冲突。

致谢

作者感谢Parrish实验室已离任和现任成员对本文稿的修改建议。我们还要感谢3Brain公司的Alessandro Maccione对本研究提出的反馈意见。本研究由AES/EF青年研究者奖以及杨百翰大学生命科学学院、物理与数学科学学院共同资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2D 工作台CloudrayLM04CLLD26B
4-氨基吡啶Sigma-Aldrich275875
Accura 芯片3BrainAccura HD-MEACMOS-HD-MEA 芯片
琼脂糖Thermo Fisher ScientificBP160-100
隔振台Kinetic Systems91010124
切片孵育室用烧杯，270 mLVWR10754-772
BioCam3BrainBioCAM DupleXCMOS-HD-MEA 平台
Brainwave 软件3BrainVersion 4CMOS-HD-MEA 软件
氯化钙Thermo Fisher ScientificBP510-500
碳酰气AirgasX02OX95C2003102
碳酰气Airgas12005
碳酰气石Supelco59277
切片机（Compresstome）PrecissionaryVF-300-0Z
计算机DellPrecission3650
鳄鱼夹接地线缆JWQIDIB06WGZG17W
清洗剂Metrex10-4100-0000
D-葡萄糖Macron Fine Chemicals4912-12
磷酸二氢钠Thermo Fisher ScientificBP329-500
DinoCamDino-LiteAM73915MZTL
乙醇Thermo Fisher ScientificA407P-4
镊子Fine Science Tools11980-13
加热板Thermo Fisher ScientificSP88857200
制冰机HoshizakiF801MWH
灌流进出液针头Jensen GlobalJG 18-3.0X
在线溶液加热器Warner InstrumentsSH-27B
异氟烷Dechra08PB-STE22002-0122
Kim Wipes 擦拭纸Thermo Fisher Scientific06-666
氯化镁Thermo Fisher ScientificFLM33500
微量移液器GilsonF144069
Mili-Q 水过滤系统Mili-QZR0Q008WW
画笔Daler RowneyAF85 Round: 0
滤纸WhatmanEW-06648-24
Parafilm 封口膜American National CanPM996
灌流系统Multi Channel SystemPPS2
移液器Thermo Fisher ScientificFB14955202
铂金压片3Brain3Brain
氯化钾Thermo Fisher ScientificP330-3
刀片PersonnaBP9020
天平Metter ToledoAB204
剪刀Solingen92008
切片孵育室定制定制定制 3D 打印设计，可根据要求提供
碳酸氢钠Macron Fine Chemicals7412-06
氯化钠Thermo Fisher ScientificS271-3
温度控制箱Warner InstrumentsTC344B
移液管Genesee Scientific30-200
管路TygonB-44-3 TPE
振动切片机 VZ-300PrecissionaryVF-00-VM-NC
称量舟Electron Microscopy Sciences70040

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CMOS MEA

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