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方法文章

使用互补金属氧化物半导体高密度微电极阵列系统从急性脑片中获取高质量的类癫痫样活动

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DOI：

10.3791/67065

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2024年9月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, Brigham Young University, 2Neuroscience Center, Brigham Young University, 3Department of Statistics, Brigham Young University, 4Department of Biology, Brigham Young University, 5Department of Physics and Astronomy, Brigham Young University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文概述了一种使用互补金属氧化物半导体高密度微电极阵列系统（CMOS-HD-MEAs）的实验方案 记录类似癫痫发作的活动 离体 脑切片

摘要

互补金属氧化物半导体高密度微电极阵列（CMOS-HD-MEA）系统可用于记录细胞培养物的神经生理活动 离体 以CMOS-HD-MEA系统对脑切片进行前所未有的高精度电生理记录。CMOS-HD-MEA最初被优化用于记录细胞培养物中的高质量神经元单位活动，但也已证明可从急性视网膜和小脑切片中获得优质数据。近期研究人员已利用CMOS-HD-MEA从急性啮齿类动物皮层脑切片中记录局部场电位（LFPs）。其中一种受关注的LFP为类癫痫样活动。尽管许多使用者已通过CMOS-HD-MEA记录到短暂的自发性癫痫样放电，但极少有人能稳定地诱导出高质量的类癫痫样活动。造成这一困难的因素可能包括电噪声、使用浸没式记录室时类癫痫样活动产生过程的不稳定性，以及二维CMOS-MEA芯片仅能记录脑切片表面信号的局限性。本方案详述的技术应可帮助使用者借助CMOS-HD-MEA系统在急性脑切片上稳定诱导并记录高质量的类癫痫样活动。此外，本方案还介绍了CMOS-HD-MEA芯片的正确处理方法、实验过程中溶液与脑切片的管理，以及设备的维护措施。

引言

市售高密度微电极阵列（HD-MEA）系统，包含具有数千个记录位点的MEA芯片1,2 以及用于放大和数字化数据的MEA平台，是电生理学研究中一种新兴工具。这些高密度MEA（HD-MEA）系统采用互补金属氧化物半导体（CMOS）技术，可从细胞培养物中高灵敏度地记录电生理数据 离体 脑片制备。这些MEA系统凭借高密度电极和优质的信噪比，为神经生理学研究提供了前所未有的空间和时间分辨率3该技术主要用于研究细胞外动作电位，但也可从多种神经元脑片制备样本中采集高质量的局部场电位（LFPs）4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15由于上述CMOS-HD-MEA系统具备高分辨率记录能力，用户能够以极高的空间精度追踪电生理活动16,17,18这一能力对于追踪网络局部场电位（LFPs）的传播模式尤为重要5,12,15,19,20,21因此，CMOS-HD-MEA 系统能够以前所未有的方式揭示来自多种细胞培养和脑片制备中生理及病理活动的传播模式。尤其值得注意的是，CMOS-HD-MEA 系统的这些能力使研究人员能够同时对比不同脑区的癫痫发作模式，并检测各种抗癫痫化合物对这些模式的影响。通过这种方式，该系统为研究癫痫发作的产生机制（ictogenesis）和发作期传播（ictal propagation），以及理解药理学如何干扰病理性的神经网络活动，提供了一种创新的方法。7,10,14因此，CMOS-HD-MEA 系统这些新功能可显著推动神经系统疾病的研究，并有助于药物发现研究5,7,11,22我们旨在提供使用CMOS-HD-MEA系统研究类癫痫样活动的详细方法。

在使用CMOS-HD-MEA系统研究局部场电位（LFP）时，例如在急性脑片中研究癫痫样活动，研究人员可能面临诸多挑战，包括严重的电噪声干扰、实验过程中维持脑片的健康状态，以及从仅记录脑片表面信号的二维（2D）CMOS-MEA芯片中检测到高质量信号。本方案描述了正确接地MEA平台及实验中所用其他设备的基本步骤，这是至关重要的一环，且可能需要根据每个实验室的具体配置进行个性化调整。此外，我们还讨论了在CMOS-HD-MEA系统所用浸没式记录舱中进行长时间记录时，维持脑片健康状态的相关操作步骤23,24,25。另外，与更常见的电生理记录方法（可记录脑片深层信号）不同，大多数CMOS-HD-MEA系统采用不穿透脑片的二维芯片。因此，这些系统依赖健康的神经元外层来产生大部分记录到的LFP信号。其他挑战还包括如何可视化由数千个电极产生的海量数据。为克服这些困难，我们推荐一种简单而有效的方案，以提高获得高质量、可在脑片中传播的网络性癫痫样活动的可能性。我们还简要介绍了一个公开可用的图形用户界面（GUI）以及相关资源，以辅助数据可视化10。

既往发表的文献已提供了MEA记录系统的相关实验方案26,27,28,29。然而，本研究旨在为使用CMOS-HD-MEA系统搭配二维芯片的研究人员提供支持，特别是针对希望从脑片中研究高质量癫痫样活动的研究者。此外，我们比较了两种最常用的诱发癫痫样活动的溶液干预方法，即无镁离子（0 Mg2+）和4-氨基吡啶（4-AP）模型，以帮助用户确定最适合其特定研究需求的致痫培养基。尽管本实验方案主要聚焦于癫痫样活动的诱导，但也可经适当修改后用于探索脑片中的其他电生理现象。

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方案

涉及小鼠的实验程序已获得杨百翰大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。实验中使用了雄性和雌性（n = 8）C57BL/6小鼠，年龄至少为P21。

组织制备和MEA装置、解剖、灌注、数据分析示意图。
图1：CMOS-HD-MEA实验的示意图。（A）通过研究者偏好的切片方法制备脑切片，并进行亚区解剖以适配MEA芯片。（B）准备所需溶液和CMOS-HD-MEA芯片。（C）将亚区解剖后的脑切片放置于电极阵列上，并浸没在适当的溶液中。（D）从采集的数据中选择相关通道，随后将数据导入用户偏好的分析软件进行处理。请点击此处查看该图的放大版本。

名称浓度 (mM)g/L
氯化钠 (NaCl)1267.36
氯化钾 (KCl)3.50.261
磷酸二氢钠 (NaH2PO4)1.260.151
碳酸氢钠 (NaHCO3)262.18
葡萄糖 (C6H12O6)101.80
氯化镁 (MgCl2)1 (来自 1 M 储液)1 mL
氯化钙 (CaCl2)2 (来自 1 M 储液)2 mL

表1：人工脑脊液（aCSF）溶液。

1. 溶液的配制

  1. 准备实验溶液。
    1. 制备1 L人工脑脊液（aCSF）（详见表1）。
    2. 制备1 L致惊厥溶液。
      注意：本实验方案中用于诱导类似癫痫活动的溶液，可选用含100 µM 4-氨基吡啶（4-AP）的aCSF，或无镁离子的aCSF。
    3. 使用多孔石对所有溶液进行碳合气饱和处理，至少持续10分钟，然后使用。
    4. 准备一个烧杯用于废弃溶液的收集。
    5. 将1 L aCSF、1 L致惊厥溶液以及废弃溶液用的烧杯放置在灌流系统附近的台面上。
  2. 准备切片和孵育室溶液
    1. 制备0.5 L aCSF，省略CaCl2，并将MgCl2浓度增加至3 mM（而非1 mM），以配制专用的切片溶液。将该溶液保存备用，并置于急性脑片制备区域附近。
    2. 制备0.5 L aCSF，并将其放入组织孵育室中，用于保存脑片以供后续实验使用。将多孔石插入孵育室中，并在将分离好的脑片放入之前，至少进行10分钟的碳合气饱和处理。

2. 制备啮齿类动物脑切片

  1. 按照上述方法制备所有溶液（参见第1节）。确保在制备过程中所有溶液均充分通入碳氧混合气体（carbogen）。
    注意：推荐使用切割溶液（参见第1.2节），但也可使用其他切割溶液以获得高质量的脑片，例如蔗糖切割溶液30。
  2. 使用振动切片机切割350 µm厚的啮齿类动物脑片。这些仪器的使用方案详见参考文献30,31,32,33。
  3. 将切割后的脑片修整至适合放置于MEA芯片记录电极区域的大小（参见图2）。如图1A和图2A所示，在振动切片机的切片室中，使用10号外科刀片轻轻来回滚动刀片对脑片进行二次修切。操作时需小心，避免损伤修切后的脑片。
  4. 将修切后的脑片置于盛有aCSF的组织保存室中。在放入修切脑片前，确保保存室中的溶液已通入碳氧混合气体至少10分钟。

3. 仪器设备准备

  1. 准备MEA芯片和系统（图2和图3）
    注意：硬质材料（如塑料和金属）若用力接触芯片孔底部，容易损坏MEA芯片。使用移液器向芯片中加入或移出溶液时，切勿让移液器接触芯片孔底部，尤其是芯片孔侧边的参比电极和芯片孔中心的记录电极（图2C）。应将溶液滴加至芯片孔底部上方悬空加入，或接触/靠近芯片孔的塑料边缘加入。为便于完全移除所有溶液，可将芯片略微倾斜，使溶液聚集于芯片孔一侧，然后从液面顶部吸出；也可使用防静电擦拭纸轻轻蘸取残留溶液的区域。切勿通过握持芯片孔或芯片引脚来搬运芯片（图2C）。芯片孔可容纳约4 mL溶液。后续步骤中，如无特殊说明，向芯片孔中加入约2 mL溶液。
    1. 在开始芯片准备前，为不同操作指定专用的转移移液器。分别标记一支移液器用于乙醇，一支用于废液，一支用于aCSF，其余移液器用于其他溶液，以防止意外混合。
    2. 向MEA芯片的孔中加入190-proof乙醇，使芯片孔底部完全被覆盖（图3）。静置30-60秒后，用废弃移液器移除乙醇。
    3. 向MEA芯片孔中加入aCSF，然后用废弃移液器移除，以冲洗残留的乙醇。使用预先指定的废液和aCSF移液器，重复向芯片孔中加入并移除aCSF三次。清洗三次后，再次加入aCSF并静置至少30秒。
      注意：在用乙醇和aCSF冲洗后，若aCSF在芯片腔室内保留至少45分钟，记录电极因疏水相互作用产生的噪声最小。
    4. 在将MEA芯片插入平台前，用190-proof乙醇润湿一块防静电擦拭纸，并用其擦拭芯片引脚（图2C）。
    5. 轻轻将MEA芯片滑入MEA平台，并启动对接机制以固定芯片。
    6. 检查记录电极和参比电极是否存在气泡（图2C）。若存在气泡，使用干净的画笔轻轻扫过电极表面以去除气泡。
    7. 使用CMOS-HD-MEA软件34检查芯片噪声，并目视观察伪彩色图中是否存在气泡、非生物振荡或由电干扰引起的尖峰。适当接地以消除所遇到的任何噪声。
      注意：接地设置将取决于记录环境。在本方案的实验中，MEA平台和灌流系统均已接地。

脑切片电生理实验装置与微电极阵列；示意图展示电极与系统细节。
图 2：配置与技术示意图。（A）本实验方案所用急性小鼠脑切片选取区域的示意图。（1）海马区；（2）新皮层区。（B）急性小鼠脑切片及固定丝网在微电极阵列（MEA）上的正确放置方式。（C）3Brain Accura CMOS-HD-MEA 芯片的结构解剖图。（D）灌流入口与出口的正确配置。输入管路应深入芯片孔底部，而输出管路应位于芯片孔顶部、与入口相对的一侧，以确保持续流入新鲜且含氧的 aCSF。 请点击此处查看该图的放大版本。

脑切片制备示意图；乙醇清洗、电极设置、切片放置、琴弦状固定网覆盖、干燥。
图3：脑切片实验中芯片制备与放置的示意图。（A）用乙醇冲洗芯片孔一次，再用 aCSF 冲洗三次。（B）使用防静电擦拭纸蘸取乙醇擦拭引脚。（C）将芯片固定到位。（D）将脑切片放置在电极上。（E）将琴弦状固定网置于脑切片上方（参见图2中的正确放置指南）。（F）用卷紧的防静电擦拭纸轻蘸靠近脑切片的记录电极孔的角落。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 实验

  1. 放置脑片
    1. 将铂金丝网置于称量皿（或其他洁净表面）上，靠近MEA平台。用约3 mL aCSF覆盖丝网，以降低其疏水性。
    2. 使用剪刀剪去移液管尖端的细小部分。剪掉约三分之一（约1.5英寸）的移液管尖端。
      注意：此改造后的移液管在收集和转移过程中不会挤压或损伤脑片。
    3. 用改造后的移液管从切片保存室中取出一片脑片。轻柔地将脑片及移液管中的溶液排入芯片孔中。为正确放置脑片，可轻轻从另一移液管释放更多aCSF以调节脑片位置，或使用软毛画笔在溶液中制造液流，推动脑片至记录电极上。尽量减少与记录电极或脑片的接触，以最小化损伤。
    4. 使用镊子将丝网轻轻放置在脑片上方，丝线朝下，以将脑片压向记录电极。避免丝网接触电极阵列。调整丝网方向，使其无框的一侧朝向进液针，且丝网框架不接触任何记录电极（图2C，D）。
    5. 取一支废弃移液管，吸除多余的aCSF。取一块防静电擦拭布，将其一角拧成尖端，用于吸除记录电极周围残留的aCSF，注意不要触碰记录电极、脑片或丝网（图2）。
    6. 使用专用的aCSF移液管，迅速加入足量的碳合aCSF以覆盖脑片，约2 mL。
    7. 重复步骤4.1.5和4.1.6两次。
    8. 用碳合aCSF填充孔洞，直至孔洞约¾满，约3 mL。
    9. 使用显微镜或相机拍摄MEA芯片上的脑片图像。确保照片具有足够高的分辨率，能够清晰显示记录电极阵列的边界及脑片的解剖结构。
  2. 运行实验
    1. 操作灌流系统
      1. 将进液管和出液管插入装有aCSF的烧杯中，并将进液针和出液针插入芯片孔内。将进液针置于芯片孔底部附近，位于记录电极外侧。将出液针置于芯片孔顶部边缘附近，使液体上升至接近孔口边缘，约4 mL，确保整个实验过程中脑片始终浸没在液体中（图2D）。
      2. 设置灌流系统的进液速率为5 mL/min，出液速率为7 mL/min。
        注意：建议出液速率高于进液速率，以避免溶液从芯片孔溢出，并在脑片表面形成液流。
      3. 打开进液和出液。将进液针从芯片孔中取出，直到针头开始排出液体而非空气，然后将其重新放回步骤4.2.1.1所述位置。
      4. 使用溶液加热器将溶液维持在生理温度或接近生理温度，约为34–37 °C。
      5. 让aCSF持续灌流脑片10分钟，使脑片适应记录环境。
      6. 10分钟后，将出液管移至废弃烧杯中，再将进液管移至含有致痫溶液的烧杯中。让非致痫性aCSF在10分钟内被冲洗出灌流系统并进入废弃烧杯。
      7. 将出液管转移至含有致痫溶液的烧杯中。
      8. 让致痫溶液持续循环，直至实验结束。
      9. 如果脑片记录时间超过2小时，建议准备另一份致痫溶液，以补偿活跃脑片对葡萄糖的消耗。
    2. 更换脑片
      1. 关闭进液。10–15秒后关闭出液。
      2. 使用镊子取下丝网，并将其放置在称量皿或其他表面上。
      3. 使用改造后的移液管取出并丢弃脑片。切勿触碰参考电极或记录电极阵列（图2C）。
      4. 将进液管放回装有非致痫性aCSF溶液的烧杯中，出液管放入废弃烧杯中。进液针和出液针保留在芯片孔内。运行灌流系统10分钟，以彻底清除芯片孔和灌流系统中残留的致痫溶液。使用新的脑片重新开始实验流程（从步骤4.1开始）。
  3. 结束实验
    1. 清洗设备
      1. 依次从孔中移除丝网、脑片和溶液。
      2. 卸下MEA芯片，将其放置在洁净表面上，并用去离子水填充芯片孔。
      3. 倒掉去离子水，以清除aCSF溶液残留的盐分。
      4. 使用移液管将洗涤剂溶液注入芯片孔中。将移液管尖端悬于孔内，对准记录电极。快速反复挤压和释放移液管，使洗涤剂剧烈冲洗记录电极1分钟。静置洗涤剂5–10分钟。
      5. 吸除洗涤剂，然后用去离子水冲洗芯片孔4–6次，以彻底去除洗涤剂及任何残留溶质。
      6. 吸干芯片孔中的所有水分，然后将一块防静电擦拭布覆盖在MEA芯片上，过夜干燥。
      7. 在MEA记录平台原先放置MEA芯片的位置，放置一个称量皿或其它防水托盘。将丝网置于托盘中央，并将进液针和出液针分别置于丝网两侧。
      8. 通过管路向废弃烧杯中依次灌注50 mL水、50 mL 140-proof乙醇和200 mL水，以清洗灌流系统和丝网。
        注意：此时可提高灌流速度以缩短清洗时间，但出液速度必须始终高于进液速度，以防溢流。
      9. 清洗碳合石：将其置于盛有蒸馏水的烧杯中，并通过管路通入碳合气5分钟。随后将其取出，放置在干燥洁净的表面上过夜，并加以覆盖以防灰尘积聚。

5. 数据分析

注意：用于分析CMOS-HD-MEA产生的电生理数据的分析软件包有多种，包括3Brain公司的BrainWave、Yet Another Spike Sorter（YASS）以及自定义的Python工具34,35,36,37. 我们从 BrainWave 数据文件格式中提取数据，用于 Xenon LFP 分析平台，以生成文中所示结果 图4 和 图5. 采用定制的 Matlab 代码对数据进行分析 图6氙气LFP分析平台的实验方案可公开获取10以下实验步骤专用于使用 Brainwave 4 进行的记录38；对于其他系统，请参阅与这些系统相关的支持性文档34,35,36,37以下概述了使用本方案生成数据所涉及的分析步骤。有关数据导出、可视化和分析的完整说明，包括教程视频及所有相关代码文件，请参见39.

  1. 导出记录文件以进行分析。
    1. 为将要降采样的数据记录文件创建一个文件夹。
    2. 裁剪在步骤 4.1.9 中拍摄的图像，仅保留包含脑切片的记录阵列部分。
    3. 打开 ExportToHDF5-ChannelSelection.py 文件（该代码文件可在 GitHub 的 xenon-lfp-analysis/code-files/3Brain-processing40 目录下获取），并将窗口顶部列出的 URL 复制粘贴到网络浏览器中。
    4. 输入数据记录文件的文件路径，并上传与该记录相关联的阵列裁剪图像。
    5. 在 选择导出通道 下，使用套索选择工具在阵列的裁剪图像上选中海马区和新皮层区域。
    6. 将跳过的行数和跳过的列数均设置为 2。
      注意：记录文件通常较大；如果适合所需的分析，可对导出的数据进行降采样。软件支持空间降采样（通过跳过记录电极的行和列）和时间降采样（通过降低采样频率）。在本分析中，每隔 2 行和 2 列进行采样；这可在空间上实现数据降采样，同时避免对特定通道产生偏差。各通道之间距离足够远，其活动差异可能具有显著性；因此，不进行通道信号平均处理。当跳过电极的行和列时，未选中通道的数据不会包含在输出文件中。
    7. 将降采样频率设置为 300 Hz。
    8. 点击 导出通道 按钮以生成通道选择文件。
      注意：软件将自动将通道选择文件保存至数据记录文件所在的文件夹。
    9. 打开 ExportToHDF5-ExtractDownsample.py 文件（同样可在 GitHub 的 xenon-lfp-analysis/code-files/3brain-processing40 目录下找到），粘贴包含通道选择文件和数据记录文件的文件夹路径，然后按键盘上的回车键，生成数据记录文件的降采样版本。
  2. 使用分析平台
    1. 在计算机的命令提示符中输入 run_lfp_analysis，然后按回车键以打开分析平台。
    2. 输入图像和降采样后记录文件的文件路径，然后点击提交。
    3. 在 选择分析时间范围 下，选择整个记录时段。
    4. 在 选择绘图通道 下，将海马区设为第 1 组，新皮层设为第 2 组。
    5. 在 通道点阵图 下，将 阈值 设置为 0.06 mV，将 时间持续时间 设置为 0.02 s。
    6. 点击 应用设置并生成点阵图。
    7. 利用点阵图探索显示感兴趣活动模式的不同通道。
      ​注意：高质的类癫痫样活动示例与次优活动示例分别见 图 4（高质量活动见 图 4A-D，次优活动见 图 4E-F）。

神经活动图；无镁离子、4-氨基吡啶实验范式；多通道脑电图；新皮层、海马分析。
图4：0 Mg²⁺条件下癫痫样电活动演化的示例2+ 和4-AP范式。 (A) 应用0 Mg aCSF后的典型点阵图2+ 约40分钟内。B) 从新皮层（蓝色）和海马（红色）记录的电生理示例轨迹，显示0 Mg²⁺条件下产生的癫痫样活动2+ 范式。C) 应用100 mM 4-AP约40分钟后的典型点阵图示例。D) 使用4-AP后记录的新皮层（紫色）和海马（绿色）的示例电生理痕迹，显示癫痫样活动。E) 应用0 Mg aCSF后的典型点阵图2+ 约40分钟内表现出簇状放电活动，而非其他代表性记录中所见的类似癫痫发作的活动。F) 从新皮层（深紫色）和海马体（铁锈色）记录的示例电生理信号，显示0 Mg²⁺条件下出现亚最优活动2+ 用于与 B 和 D 中出现的类似癫痫发作活动的质量进行比较的范式 请点击此处以查看此图的放大版本。

神经频谱分析；频率与时间图；脑区：新皮层、海马体；实验。
图 5：0 Mg2+ 和 4-AP 模型诱导的癫痫样放电的代表性结果。（A）0 Mg2+ 模型诱导的典型新皮层类癫痫发作事件示例图，包括（Ai）类癫痫发作事件的频谱图，（Aii）相应的电生理记录轨迹，（Aiii）对 Aii 轨迹应用的 80 Hz 高通滤波结果，（Aiiii）Aii 轨迹的放大区段。（B）0 Mg2+ 模型诱导的典型海马体癫痫样爆发放电示例图，包括（Bi）癫痫样爆发的频谱图，（Bii）相应的电生理记录轨迹，（Biii）对 Bii 轨迹应用的 80 Hz 高通滤波结果，（Biiii）Bii 轨迹的放大区段。（C）4-AP 模型诱导的典型新皮层类癫痫发作事件示例图，包括（Ci）癫痫样活动的频谱图，（Cii）相应的电生理记录轨迹，（Ciii）对 Cii 轨迹应用的 80 Hz 高通滤波结果，（Ciiii）Cii 轨迹的放大区段。（D）4-AP 模型下海马体癫痫样爆发放电的示例图，包括（Di）癫痫样活动的频谱图，（Dii）相应的电生理记录轨迹，（Diii）对 Dii 轨迹应用的 80 Hz 高通滤波结果，（Diiii）Dii 轨迹的放大区段。请点击此处查看该图的放大版本。

脑振荡分析；功率频带的箱形图/图表比较；海马和新皮层数据。
图6：在刻板样癫痫样放电期间，不同范式和脑区各频段功率占基线百分比的比较。（A）在大多数频段中，癫痫样放电期间的功率在不同范式和脑区之间存在显著差异（双因素方差分析，Tukey 检验，*P < 0.05，**P < 0.001，***P < 0.0001）。每个箱图中的中线代表均值，箱子的边界为均值±1个标准误（SEM），最外侧线条为均值±2个标准误。（B）两种范式和脑区在150 Hz以上的高频活动相关频段中均表现出有限的功率。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

在对来自多个通道的活动进行可视化时，通常的做法是1,4,5,10，我们发现首先生成使用CMOS-HD-MEA系统所获取数据的点阵图是有益的（图4A、C、E）。该图通过在y轴上显示每个通道、在x轴上显示时间，可提供每片脑切片中所有记录通道活动的鸟瞰视图。在此点阵图中，每个信号点代表一个超过设定的LFP电压阈值的通道（见步骤5.2.6及先前发表的研究10）。此类点阵图可指示电生理活动在时空上的发生位置与时间（图4A、C、E）。以这种方式可视化数据，可使用户充分利CMOS-HD-MEA系统的...

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讨论

本方案包含针对急性脑片管理的具体指南，旨在解决CMOS-HD-MEA使用者常遇到的两个问题：脑片下方产生噪声，以及维持脑片的健康环境。当脑片未能充分贴附于电极阵列时，会在其下方形成气泡，从而导致噪声的产生；这种噪声将导致无法获取有效数据。为缓解这些问题，本方案强调两个关键步骤：第一，在放置脑片时确保弓形丝装置方向正确，以避免灌流液流入时扰动脑片（步骤4.1.4）；第二，使用防静电擦拭布清除电极周围多余的aCSF，以促进脑片有效贴附（步骤4.1.5–4.1.7）。方案中另一个重点问题是芯片表面的疏水性，这可能导致气泡形成并在记录过程中引入噪声。推荐通过乙醇处理后用去离子水冲洗的方法来缓解该问题（步骤3.1.2、3.1.3和3.1.6）。然而，若问题仍然存在，还可采取额外措施：用140-proof乙醇充满芯片孔，再用画笔轻轻刷洗电极阵列30至60秒，随后吸除乙醇，并用去离子水冲洗芯片孔三次。之后，向孔中加入aCSF，并从步骤4继续执行后续操作。

维持脑片的健康环境至关重要，需通过合理放置进液和出液针头以及调节灌流系统的流速来实现（步骤 4.2.1）。必须对脑片进行充分的氧合，并找到最有...

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披露

作者声明本研究不存在任何利益冲突。

致谢

作者感谢Parrish实验室已离任和现任成员对本文稿的修改建议。我们还要感谢3Brain公司的Alessandro Maccione对本研究提出的反馈意见。本研究由AES/EF青年研究者奖以及杨百翰大学生命科学学院、物理与数学科学学院共同资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2D 工作台CloudrayLM04CLLD26B
4-氨基吡啶Sigma-Aldrich275875
Accura 芯片3BrainAccura HD-MEACMOS-HD-MEA 芯片
琼脂糖Thermo Fisher ScientificBP160-100
隔振台Kinetic Systems91010124
切片孵育室用烧杯，270 mLVWR10754-772
BioCam3BrainBioCAM DupleXCMOS-HD-MEA 平台
Brainwave 软件3BrainVersion 4CMOS-HD-MEA 软件
氯化钙Thermo Fisher ScientificBP510-500
碳酰气AirgasX02OX95C2003102
碳酰气Airgas12005
碳酰气石Supelco59277
切片机（Compresstome）PrecissionaryVF-300-0Z
计算机DellPrecission3650
鳄鱼夹接地线缆JWQIDIB06WGZG17W
清洗剂Metrex10-4100-0000
D-葡萄糖Macron Fine Chemicals4912-12
磷酸二氢钠Thermo Fisher ScientificBP329-500
DinoCamDino-LiteAM73915MZTL
乙醇Thermo Fisher ScientificA407P-4
镊子Fine Science Tools11980-13
加热板Thermo Fisher ScientificSP88857200
制冰机HoshizakiF801MWH
灌流进出液针头Jensen GlobalJG 18-3.0X
在线溶液加热器Warner InstrumentsSH-27B
异氟烷Dechra08PB-STE22002-0122
Kim Wipes 擦拭纸Thermo Fisher Scientific06-666
氯化镁Thermo Fisher ScientificFLM33500
微量移液器GilsonF144069
Mili-Q 水过滤系统Mili-QZR0Q008WW
画笔Daler RowneyAF85 Round: 0
滤纸WhatmanEW-06648-24
Parafilm 封口膜American National CanPM996
灌流系统Multi Channel SystemPPS2
移液器Thermo Fisher ScientificFB14955202
铂金压片3Brain3Brain
氯化钾Thermo Fisher ScientificP330-3
刀片PersonnaBP9020
天平Metter ToledoAB204
剪刀Solingen92008
切片孵育室定制定制定制 3D 打印设计，可根据要求提供
碳酸氢钠Macron Fine Chemicals7412-06
氯化钠Thermo Fisher ScientificS271-3
温度控制箱Warner InstrumentsTC344B
移液管Genesee Scientific30-200
管路TygonB-44-3 TPE
振动切片机 VZ-300PrecissionaryVF-00-VM-NC
称量舟Electron Microscopy Sciences70040

参考文献

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