睾丸扭转复位固定术：一种睾丸缺血-再灌注损伤的大鼠模型

摘要

本文介绍了一种建立睾丸缺血/再灌注模型的逐步操作流程，旨在研究睾丸缺血-再灌注损伤的病理机制时，构建可重复的睾丸扭转模型。

摘要

缺血-再灌注（IR）损伤与多种病理状态相关，包括睾丸损伤。以往的睾丸IR动物模型通过扭转精索来实现缺血，但存在诸多技术难题，导致模型难以稳定重复。因此，我们提出一种简单的方法，可在大鼠模型中诱导睾丸IR，且易于复制。

该方法包括将睾丸引带与睾丸分离，制作阴囊袋，将睾丸下极顺时针扭转720°，并将睾丸固定于阴囊底部。该模型可有效压迫睾丸血管，诱导睾丸缺血。缺血1小时后，移除固定缝线并解除睾丸扭转。检查精索及其伴行血管以确保通畅。缺血再灌注（IR）后，取睾丸组织进行切片，以供组织病理学评估。

通过检测睾丸组织学中是否存在局灶性出血病变、血管充血、间质增宽以及炎性细胞浸润来评估损伤情况。此外，还检测了氧化应激标志物（丙二醛、还原型谷胱甘肽、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶）、炎症标志物（髓过氧化物酶、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β）以及凋亡标志物（caspase 3 表达水平）。该方法提供了一种更简单且易于重复的模型，用于研究睾丸缺血-再灌注损伤的病理生理机制。更重要的是，该模型为探索治疗睾丸缺血-再灌注损伤的潜在治疗药物提供了窗口。

引言

睾丸扭转（TT）是一种急性泌尿外科急症，其特征是精索及其伴随血管发生扭转，导致睾丸缺血。临床表现为严重的腹痛、恶心和呕吐¹。若未能及时通过复位解除缺血，将导致受累睾丸发生坏死并丧失功能²。然而，即使通过及时手术解旋并恢复睾丸血流，也会引发缺血-再灌注损伤（IRI），从而造成睾丸组织学和生物化学结构的破坏及其功能障碍^3,4。

TT的动物模型已被广泛用于研究IRI的机制，IRI invariably 是由于试图阻止TT进展为坏死而引起的^5,6。TT有两种模型：精索夹闭和精索扭转。两种操作均需在无菌条件和充分麻醉下进行。常用的麻醉剂包括单独使用氯胺酮或与赛拉嗪联合使用⁷。其他常用的麻醉剂为尿烷和硫喷妥钠，通常通过腹腔注射给药⁷。然而，这两种模型均存在一定的局限性。

尽管使用显微血管夹直接夹闭睾丸动脉^8,9已被作为一种在特定时间段内（通常为1小时）诱导缺血、随后通过移除夹子诱导再灌注的方法，但该方法并不能准确模拟睾丸扭转的临床表现¹⁰。此外，虽然通过手术扭转精索以实现缺血^11,12更接近临床实际情况，但该方法存在诸多技术难题，而现有相关研究文章的方法部分所给出的简短描述并未解决这些问题。

一个常见的技术难题是，在缺血期间如何将睾丸复位并固定于阴囊底部，以防止其发生解旋。尽管一些研究者未提及将睾丸固定于阴囊壁的操作^13,14，但另一些研究者则建议通过缝合白膜与阴囊壁来实现睾丸的固定^15,16,17。然而，关于将睾丸固定于阴囊壁的具体操作描述，总体上非常简略且缺乏明确细节^7,18。因此，尝试重复先前文献方法部分所描述的操作时，常遇到严重的实际困难，例如因穿破白膜而造成睾丸损伤，或在不施加过度压力的情况下无法将睾丸顺利复位至阴囊内。此外，从实际操作角度看，在诱导扭转后将睾丸重新放回阴囊囊袋，一直是我们在尝试手术建立实验性睾丸扭转（TT）模型过程中的主要挑战。这些技术上的困难，导致不同研究者之间难以稳定地重复该动物模型。

因此，本研究中描述的建立大鼠TT模型的方法，识别了以往模型中遇到的技术难点，并提供了相应的解决方案。该模型提供了一种简单且易于重复的技术，能够模拟人类疾病情况。因此，该模型是研究由IRI引发的病理机制的一个可靠且可重复的起点。

方案

本研究经尼日利亚奥约州奥格博莫绍拉多克·阿金托拉科技大学基础医学科学学院伦理审查委员会批准（ERCFBMSLAUTECH:033/05/2024）。实验选用20只雄性白化Wistar大鼠，年龄为10–12周，体重为180 ± 10 g。大鼠适应环境2周后，随机分为假手术组（SO）和扭转/去扭转组（T/D）（每组n = 10只）。SO组大鼠接受与T/D组相同的操作手术，但不进行睾丸扭转或固定以诱导T/D。

1. 术前准备与麻醉

1. 术前对动物（SO组和T/D组）进行12小时过夜禁食。
2. 手术当天，通过腹腔注射给予动物（SO组和T/D组）氯胺酮50 mg/kg和赛拉嗪10 mg/kg进行麻醉，并通过观察动物对足垫压迫及胡须轻触刺激无反应来确认麻醉深度和效果。
3. 剃除动物（SO组和T/D组）左侧阴囊、会阴及腹股沟区域的毛发，随后使用甲基化酒精和聚维酮碘消毒液清洁该区域，或遵循当地机构关于消毒的指导原则。

2. 诱导睾丸缺血

1. 睾丸的游离
   1. 轻轻向下按压腹部，将左侧睾丸（SO组和T/D组均适用）推入阴囊内。
   2. 牢固抓住左侧睾丸（SO组和T/D组均适用），做高位阴囊切口，长约1.5 cm，以暴露位于阴囊鞘膜（TV）内的睾丸。
   3. 定位睾丸下极（SO组和T/D组均适用），即附睾尾部，用小型解剖剪在覆盖其上的TV上剪开一个小口。
   4. 将剪刀置于TV下方，稍微张开以显露TV的两个边缘，然后用弯头蚊式动脉钳夹住两侧边缘。此步骤适用于SO组和T/D组。
      注意：此步骤非常重要，因其建立了一个组织平面，便于在诱导扭转后将睾丸顺利复位至阴囊内。
   5. 将TV上的切口（SO组和T/D组均适用）向近端延长约0.5 cm。
   6. 轻压下腹部，使睾丸（SO组和T/D组均适用）外置。
   7. 仅对T/D组，游离睾丸并识别睾丸引带，随后将其切断，使睾丸与阴囊底部分离。
      注意：此步骤至关重要，因其使睾丸能够发生扭转。睾丸引带可识别为从睾丸尾端延伸至腹股沟管并在末端呈结节状膨大的韧带^19,20。
   8. 抓住T/D组动物睾丸的下极（即附睾尾所在位置），顺时针扭转720°，并记录时间（标记缺血开始）。
2. 固定缺血睾丸
   1. 通过固定扭转后的睾丸（T/D组动物），并将长解剖剪沿TV下方的组织平面向下推入阴囊，形成一个阴囊袋，从而创建阴囊 pouch。
   2. 仅对T/D组动物，固定缝线时保持剪刀位置不变，使用铬制肠线2-0从先前创建的阴囊袋最低点外侧进针，穿过下极睾丸的结缔组织，再从袋内穿出，回到初始进针点旁的外部位置。
   3. 通过将扭转的睾丸（T/D组动物）拉入阴囊，并轻轻向下牵拉缝线两端，将睾丸固定在阴囊基底部，然后将缝线两端牢固地结扎于阴囊皮肤上。
   4. 使用铬制肠线2-0行连续荷包缝合关闭阴囊切口（SO组和T/D组动物均适用）。
      注意：建议采用此方法，以便在需要进行再灌注时易于拆除缝线。

3. 生物化学与组织病理学检测

注意：进行生化检测和组织病理学检查的研究人员须对研究方案设盲。

1.  实验周期结束时，动物应在过夜禁食12小时后，通过腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）实施安乐死，随后摘取睾丸。
2. 去除左侧睾丸附着的组织并进行分离。
3. 将每组10份睾丸组织中的5份在匀浆缓冲液（0.25 M蔗糖、0.5 mM EDTA、5 mM组氨酸及溶于PBS的蛋白酶抑制剂，pH 7.4）中匀浆处理，其余5份睾丸组织用Bouin液固定，用于组织学评估。
4. 将匀浆在10,000 × g 在4 °C的冷冻离心机中离心15分钟，以获取上清液用于生化分析。
5. 采用标准实验室试剂盒，按照制造商说明书，通过酶法比色测定法检测睾丸黄嘌呤氧化酶（XO）活性。
6. 比色法测定睾丸丙二醛（MDA）含量²¹.
   1. 利用脂质过氧化过程中产生的硫代巴比妥酸反应物（TBARS）测定脂质过氧化物浓度
      注意：该方法基于2-硫代巴比妥酸（TBA）与脂质过氧化终产物丙二醛之间的反应。在酸性pH条件下加热可生成一种粉红色的显色复合物（TBS-丙二醛加合物），通过测定其在532 nm处的吸光度进行定量。
      1. 用500 µL三氯乙酸（TCA）对200 µL样品进行去蛋白处理，3,000 rpm离心10 min。
      2. 向0.1 mL上清液中加入1 mL 0.75% TBA，于100 ˚C水浴中煮沸20 min，然后用冰水冷却。
      3. 使用分光光度计在532 nm波长下测定样品/标准品相对于空白样的吸光度。根据标准曲线外推法确定生成的TBARS浓度。
7. 检测睾丸中超氧化物歧化酶（SOD）的活性²²过氧化氢酶²³，以及谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）²⁴ 采用先前报道的既定方案。
   1. SOD 测定
      1. 将1 mL样品加入9 mL蒸馏水中稀释，制成1:10的稀释液。取0.2 mL该稀释后的样品，加入2.5 mL 0.05 M碳酸盐缓冲液（pH 10.2）中，用于分光光度计平衡。
      2. 通过加入0.3 mL新配制的0.3 mM肾上腺素启动反应，并立即倒置混合均匀。
      3. 向对照比色皿中加入 2.5 mL 缓冲液、0.3 mL 底物（肾上腺素）和 0.2 mL 水。
      4. 每30秒监测一次在480 nm处的吸光度增加，持续150秒。
   2. 过氧化氢酶测定
      1. 将1 mL睾丸匀浆上清液与19 mL稀释用水混合，得到样品1:29的稀释液。
      2. 取4 mL H₂O₂ 800 µmoles 溶液和 5 mL 磷酸盐缓冲液加入 10 mL 平底烧瓶中。
      3. 将1 mL适当稀释的酶液（步骤4.6.3.1）与反应混合液（步骤4.6.3.2）在37 ˚C下轻轻旋涡混匀。每隔60秒取出1 mL反应混合液，加入2 mL重铬酸/乙酸试剂中。
      4. 通过将样品在653 nm处的吸光度与经认证的过氧化氢酶标准品进行比较，测定样品中的过氧化氢酶含量。
   3. GPx 检测
      1. 将含有样品的反应混合物在37 ˚C孵育3分钟，加入0.5 mL 10%三氯乙酸（TCA），在3,000 rpm下离心5分钟。
      2. 向1 mL上清液中加入2 mL磷酸盐缓冲液和1 mL 5'-5'-二硫代双(2-二硝基苯甲酸)(DTNB)溶液，以空白对照调零，在412 nm处测定吸光度。
      3. 通过绘制标准曲线并根据曲线推算剩余GSH的浓度，测定谷胱甘肽过氧化物酶活性。
8. MPO 和肿瘤坏死因子-α（TNFα）检测
   注意：该实验涉及在过氧化氢存在下将愈创木酚氧化为氧化态愈创木酚。氧化态的愈创木酚呈棕色，可在470 nm波长下通过光度法测定。
   1. 使用标准ELISA试剂盒测定睾丸髓过氧化物酶（MPO）活性^21,25 以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。
9. 使用苏木精和伊红（H&E) 染色^26,27 以及用于检测caspase 3表达的免疫组织化学
   1. 将睾丸组织置于Bouin液中固定；用甲苯洗涤组织，浸入石蜡中，并在60 °C下孵育过夜。
   2. 取约5 µm厚的切片，脱蜡并水化，用预热的柠檬酸缓冲液进行抗原修复，然后冷却30分钟。
   3. 用实验室擦拭纸清洁载玻片，使用疏水性标记笔标记组织区域，并将载玻片置于湿化孵育盒中。
   4. 孵育切片10分钟，使用过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性后，用PBS冲洗切片一次，加入蛋白阻断剂，孵育10分钟。
   5. 用 PBS 冲洗载玻片 2 次，加入相应的初级抗体（caspase 3），孵育 45 分钟，再用 PBS 冲洗 2 次。
   6. 加入二抗，孵育25分钟，用PBS冲洗2次，然后加入HRP聚合物。重复孵育25分钟和用PBS冲洗2次的循环。
   7. 将切片在二氨基联苯胺（DAB）底物中孵育5分钟，用PBS冲洗2次，苏木精复染，再用蒸馏水冲洗。
   8. 将蓝化液作用于切片，冲洗，脱水，透明，封片，进行定性观察。
   9. 在光学显微镜下观察组织，并使用连接显微镜的数码相机在100倍和400倍放大倍数下拍摄显微照片。

4. 统计分析

1. 使用选定的软件进行统计分析。采用Anderson-Darling检验、D'Agostino与Pearson检验以及Shapiro-Wilk检验来评估数据的正态性。
2. 采用非配对t检验分析两组之间是否存在显著差异：SO组与T/D组。
3. 数据以均值±均值标准误表示。显著性水平设定为p < 0.05、p < 0.01 和 p < 0.001（如图注中所示）。

结果

睾丸中黄嘌呤氧化酶（XO）活性、丙二醛（MDA）水平以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性被用作氧化应激的指标。与假手术组大鼠相比，扭转/复位（T/D）显著提高了XO活性和MDA水平，同时降低了T/D大鼠睾丸中SOD、过氧化氢酶和GPx的活性（图1），表明氧化应激在T/D所致损伤中发挥了重要作用。

此外，炎症介质 TNF-α 和中性粒细胞浸润指标 MPO 被用作炎症的标志物。与假手术组大鼠相比，睾丸扭转/复位（T/D）导致 T/D 大鼠睾丸组织中 TNF-α 浓度显著升高（图 2A）。睾丸 T/D 还使睾丸组织中髓过氧化物酶（myeloperoxidase）活性较假手术动物显著上升（图 2B）。这些结果提示，TNF-α 和 MPO 作为促...

讨论

本文及配套视频详细逐步描述了采用固定法进行睾丸扭转（TT）手术诱导的操作过程，用于研究睾丸缺血-再灌注损伤（IRI）。该方法具有显著优势：一方面避免了钳夹技术导致的睾丸长时间体外暴露⁷，另一方面更贴近人类睾丸扭转的临床表现^10,12。

当缺血达到规定时间后，通过移除荷包缝线以暴露睾丸，移除阴囊上的固定缝线，将睾丸游离并逆时针旋转720°以解除扭转，随后将睾丸复位至阴囊内，并使用2-0铬制肠线连续缝合关闭阴囊切口。在切口处涂抹普鲁卡因青霉素粉末以预防感染。在将睾丸复位至阴囊前，必须评估精索及其伴行血管是否已解除扭转并保持通畅。铬制肠线是关闭阴囊伤口的首选，因其可被机体吸收，无需在伤口愈合后拆除²⁸。

已有研究证实，睾丸扭转（TT）会损害睾丸血流，导致静脉充血、动脉阻塞、缺血及坏死^7<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 cc 注射器	不适用	不适用	用于麻醉
2-0 慢性肠线缝合线	不适用	不适用	用于手术
Bard Parker 手术刀柄	不适用	不适用	用于手术
弯蚊式动脉钳	不适用	不适用	用于手术
解剖剪	不适用	不适用	用于手术
GraphPad Prism（版本 8.0.2）
氯胺酮注射液	Swiss Parenterals LTD Gujarat India	2321154	麻醉剂
对乙酰氨基酚注射液	山西中宝制药有限公司，中国	220637	镇痛剂
聚维酮碘	JAWA International limited Nigeria	135S	消毒冲洗液
普鲁卡因青霉素粉剂	安徽诚世制药有限公司，中国	201906	用于手术
手术刀片	不适用	不适用	用于手术
外科手套	镇江华阳乳胶制品有限公司，中国	210325
拆线剪	不适用	不适用	用于手术
有齿解剖镊	不适用	不适用	用于手术
赛拉嗪注射液	Bioveta 捷克共和国	396228A	麻醉剂
光学显微镜	Novel Microscope，中国	不适用	用于组织病理学评估
数码相机	Hayear，中国	不适用	用于组织病理学评估
TNF-α 检测试剂盒	Elabscience，美国	E-EL-H0109	用于检测
Thermo Fischer 试剂盒（用于检测半胱天冬酶-3 表达的小鼠抗半胱天冬酶-3 单克隆抗体）	Thermo Fischer Scientific Inc.，美国	不适用	用于免疫组织化学（半胱天冬酶-3）