建立猪模型以研究子宫动态保存与移植

摘要

本文描述了一种详细且可重复的猪子宫模型，从手术获取到启动机器灌注的全过程，可用于研究移植中的子宫保存方法。

摘要

迄今为止，对于患有绝对性子宫不孕症（如罗基坦斯基综合征）的女性而言，子宫移植是唯一能够实现妊娠并分娩的选择。尽管近年来人们对子宫 移植的兴趣日益增加，但仍有一些问题需要进一步研究，包括缺血-再灌注损伤及其对移植物质量和排斥反应的影响。近期文献报道，子宫 移植术后血栓并发症的发生率高达20%。此类并发症可能由缺氧诱导的内皮细胞损伤引起，常导致子宫移植物排斥。缺氧主要发生在静态冷保存过程中，而静态冷保存目前仍是实体器官移植中移植物保存的金标准。近年来，采用机械灌注的动态保存方法已被证明可通过减少缺血和缺氧损伤，改善常规及边缘器官的长期保存效果。在本方案中，我们将详细描述基于双侧子宫蒂的猪子宫获取及动态保存的各个手术步骤，以实现与机械灌注方案的连接并启动灌注程序。

引言

在过去十年中，子宫移植（UTx）取得了显著进展，多个研究团队已启动临床研究项目。迄今为止，UTx 的主要适应证是由于子宫发育不全导致的绝对性子宫不孕，其中包括梅耶尔-罗基坦斯基-许斯特尔-奥尔病（Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser，MRKH）综合征。MRKH 综合征是一种先天性疾病，其发病率约为每 5,000 名女性活产婴儿中 1 例¹。UTx 还可能适用于其他类型的不孕症，包括因恶性肿瘤、产后出血、子宫肌瘤、感染后遗症以及各种先天性畸形而行子宫切除术后的患者。这表明大约每 500 名女性中即有 1 人可能符合 UTx 的适应证。

首例临床子宫移植（UTx）于2000年在沙特阿拉伯进行²，但由于血管并发症，患者在三个月后接受了子宫切除术。自那以后，已开展了多例子宫移植手术，供体来源包括活体和死亡捐献者，已成功实现80多例活产^3,4。与实体器官移植和血管化复合组织异体移植（VCA）类似，免疫排斥反应是子宫移植中面临的重要挑战⁵。多种因素可导致移植物排斥，包括微循环衰竭和静脉淤滞，二者均可引发血栓并发症。Kristek等人在最近一项关于移植中子宫血管化的综述中报道，动脉血栓发生率高达15%，静脉血栓发生率为5%⁶。此外，冷缺血和热缺血是影响移植成功的关键因素，因为缺血-再灌注损伤（IRI）可导致移植物功能障碍和急性排斥反应^7,8。心肌细胞在缺血应激下可通过产生乳酸维持最多6小时⁹，此后肌肉细胞损伤将不可逆转。临床研究已记录了冷缺血对子宫肌层的影响，研究表明，在静态冷保存（SCS）期间使用细胞内液类似的威斯康星大学溶液（University of Wisconsin solution），相较于林格氏醋酸盐溶液，可改善器官保存效果，表现为对前列腺素的收缩反应更佳以及ATP浓度更高¹⁰。然而，热缺血与冷缺血对子宫移植的影响仍缺乏充分研究。

静态冷保存（SCS）仍是包括子宫在内的血管化复合组织移植（VCA）以及大多数实体器官移植的金标准。然而，近年来，机械灌注系统和保存液的显著进步引发了一场范式转变。目前已有充分证据表明，动态机械灌注能够改善并延长健康及边缘性实体器官的保存效果^{11,12,13,14,15}。该技术目前已在肺、心脏、肝脏和肾脏移植的临床实践中广泛应用^14,16,17,18。动态器官保存已显示出多种优势，包括通过持续供氧和营养供给以减少冷缺血和缺氧损伤、清除有毒代谢产物，并改善移植物的质量和活力参数^12,19。目前已开发出多种模式，涵盖从低温到常温机械灌注（无论是否含氧载体），并有多种灌注液可供选择，但仅有少数在子宫上进行过测试²⁰。为确保此类研究视角产生实质性贡献，建立相关的临床前外科模型至关重要。

本研究采用亚常温机械灌注（SNMP）作为在室温（约 20 °C）下通过滚压泵和氧合器循环灌注液实现氧合的动态器官保存方法。选用猪模型，因其在解剖结构、生理特征及血管尺寸方面与人类生殖系统相似，适用于子宫移植（UTx）和器官保存的相关研究^21,22。子宫在循环停止后获取，该模型与心脏死亡后捐献具有相关性，并提示在其他重要实体器官获取后可能存在延迟获取子宫的可能性^23,24。此外，该模型有助于在已具备其他器官移植研究基础的移植实验室中开展子宫保存研究，同时遵循 "3Rs" 原则²⁵。本研究旨在建立一种基于子宫血管蒂的新型保存模型，并评估其用于动态保存的可靠性。文中详细描述了从子宫切除到保存的全部操作步骤，重点突出了SNMP应用中的关键环节。

以下所述方案是在基于单个泵的预实验之前进行的 "Y型管" 双侧子宫动脉灌注系统（补充图1）。4小时SNMP灌注后，器官重量增加了超过初始重量的50%。流量、压力、阻力和重量变化如图所示。 补充图2单个灌注系统分为两个流入通道时，无法独立调节每侧的流量以匹配各自的压力。在这种情况下，SNMP导致器官一半出现显著水肿补充图3）。该系统被证明不适用于子宫模型，部分原因是子宫模型不应被视为完全对称的结构。因此，本方案中采用了两套机器灌注系统，分别用于两条子宫动脉。

方案

所有动物均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》接受人道护理，实验方案经麻省总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。本研究共使用6只体重30–40 kg的雌性尤卡坦小型猪用于子宫获取，其中4个子宫接受了SNMP处理。所有动物在安乐死前均接受全剂量肝素化（100 IU/kg）。器官获取在动物死亡后进行，热缺血时间少于60分钟。根据 "3Rs" 原理²⁵。参见 材料表 有关本方案中使用的所有试剂和设备的详细信息。

1. 术前准备（手术前一天）

1. 准备灌注液。对于亚常温机械灌注，使用一种为VCA优化的Steen+溶液 ^26,27。每个子宫使用1升溶液，其成分详见表1。
   注：向灌注液中加入大量氢氧化钠，旨在使pH达到约7.5–7.6。该pH值明显偏高，但有必要，因为在机器循环过程中使用碳合气（95%氧气；5%二氧化碳）进行氧合时，pH倾向于下降。
2. 搭建机械灌注系统（图1）。在灌注液循环时检查是否存在泄漏和气泡。

2. 死后子宫采集

注意：为了模拟心脏死亡后捐献和/或死后器官获取，应根据当地实验动物护理和使用委员会（IACUC）指南对动物实施安乐死。应优先选择放血法而非静脉注射戊巴比妥钠，以避免可能干扰研究的毒性作用。

1. 将已处死的动物置于仰卧位。清洁腹部区域，并铺上无菌巾。
2. 使用#20刀片在脐下正中做10 cm长的切口。
3. 使用单极电刀切开皮下组织和腱膜。
   注意：打开腹腔时需注意避免损伤肠管。
4. 用手术纱布将小肠移开，暴露子宫。
   注意：所用模型的子宫解剖结构见图2A。
5. 对左侧和右侧操作步骤相同，具体如下：
   1. 辨认子宫血管。
      注意：子宫静脉位于子宫动脉的外侧（图3）。
   2. 使用直角钳在子宫静脉外侧的阔韧带处打开一个开口。
   3. 通过该开口，使用2-0丝线结扎缝合卵巢血管，并用电凝法分离子宫周围阔韧带中的结缔组织。
   4. 使用2-0丝线结扎子宫-卵巢血管，切除卵巢和输卵管。
   5. 游离子宫血管，并尽可能靠近髂内血管处将其切断。
      注意：应尽量保持血管蒂长度，以便于插管，并预防血管蒂切断后回缩。
   6. 在对侧重复步骤2.5.1–2.5.5。
6. 使用单极电刀切断宫颈，取出子宫。
   注意：应延长接触时间，确保宫颈血管充分凝固，防止灌注过程中发生渗漏。

3. 灌注准备

1. 在侧台上，使用显微外科扩张器扩张双侧子宫动脉，并插入套管针。用3-0丝线固定插管（图2B）。
   注意：此处所有动脉均使用18 G套管针。插入导管时需注意不要过深，以免发生选择性插管，因为分叉位置相对较近。不进行子宫静脉插管，因为静脉回流足以保持这些血管管腔开放，便于液体收集。此外，创伤性插管不仅耗时，还可能导致血管损伤，并可能影响静脉回流。
2. 每侧缓慢手动冲洗双侧子宫动脉，各使用20 mL肝素溶液，直至所有血管冲洗干净，流出液澄清。
   注意：冲洗时必须避免高压，否则可能导致微血管损伤和灌注失败。
3. 称量子宫重量。

4. 亚常温机械灌注

注意：对于子宫，需要两个独立的机器灌注系统。每条子宫动脉连接到一个由滚压泵、氧合器、气泡捕获装置和压力传感器组成的灌注系统。灌注液储存在储液器中，通过硅胶管在上述各组件间循环，随后经由每侧的子宫动脉流入子宫，再从子宫静脉流出，返回同一储液器中。

1. 通过将子宫动脉插管连接到灌注系统的进液管路，将子宫连接至机器灌注系统（图1）。
2. 使用滚轴泵将流速调节至较低水平（2.5–4.0 mL/min），以维持动脉压力在25–35 mmHg之间恒定。
3. 在预设的每个时间点，使用1 mL注射器从进液端和出液端取样，并通过血气分析仪检测样本中的活力参数[例如：血气指标（pH、pCO₂、pO₂、乳酸、碱剩余、碳酸氢盐）、葡萄糖、钠、钾、钙、氯]。
   注意：本方案中灌注持续4小时，每30分钟从进液端和出液端各取一次样本。
4. 灌注结束后称量子宫重量。

结果

灌流过程中，系统连接至一个压力传感器，用于记录实验期间的压力。首先记录无子宫状态下的系统压力，之后从子宫灌流时的压力记录中减去该值，以获得器官的真实压力。通过滚柱泵调节流速，使压力维持在设定范围内。阻力根据公式 R = P / Q 计算（R：阻力（mmHg·mL·min^-1）；P：压力（mmHg）；Q：流速（mL/min））。

灌注参数的演变如图4所示。两侧子宫的平均初始流速为5.2（最小值2.4，最大值10.0）mL/min，在整个实验过程中波动不大。根据文献及前期实验结果，目标压力设定为25–35 mmHg。子宫左侧的平均初始动脉压为26（最小值10，最大值36）mmHg，右侧为27（最小值16，最大值39）mmHg。由于流量和压力均略低且较为稳定，由此得出的动脉阻力曲线在整个实验期间也呈平坦趋势。两侧的平均初始血管阻力均为8.5（最小值1，最大值13.3）mmHg·mL·min^-1（图4）。

讨论

子宫移植通常被视为血管化复合组织移植（VCA）的一部分，近年来发展迅速。与此同时，由于机械灌注在改善实体器官保存方面已展现出充分的证据支持，其在VCA领域的应用也开始受到关注。低温和亚常温机械灌注技术已在包含肌肉皮肤和骨骼的猪VCA模型中实现长达24小时的保存效果^26,27,28。由于子宫在保存方面面临的挑战与含骨骼和皮肤的VCA相似，因此探索类似技术以提升子宫移植（UTx）的保存质量和长期预后至关重要²⁹。除了改善器官质量外，机械灌注实现动态保存的另一潜在优势是扩大供体来源³⁰。从活体供体获取子宫存在较大风险，例如在分离子宫蒂过程中可能发生输尿管损伤，同时可能引起激素紊乱，以及因可能实施的卵巢切除术而导致早发性绝经的相关风险^31,32。通过...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Affinity Pixie 氧合系统	Medtronic	BBP241	氧合器
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647	灌注液组分
氯化钙二水合物	Sigma-Aldrich	223506	灌注液组分
二氧化碳氧气混合气	Airgas	UN3156	二氧化碳氧气混合 气体
D-(+)-葡萄糖一水合物	Sigma-Aldrich	49159	灌注液组分
地塞米松	Sigma-Aldrich	D2915	灌注液组分
右旋糖酐	Thermo scientific	406271000	灌注液组分
肝素钠注射液	Eugia Pharma	63739-953-25	灌注液组分
Humulin 正规胰岛素（人源）	Lilly	0002-8215-01	灌注液组分
氢化可的松琥珀酸钠	Pfizer	0009-0011-03	灌注液组分
氯化镁六水合物	Sigma-Aldrich	M9272	灌注液组分
MasterFlex L/S	Cole-Parmer	77200-32	蠕动泵
聚乙二醇 35000	Sigma-Aldrich	25322-68-3	灌注液组分
氯化钾	Sigma-Aldrich	7447-40-7	灌注液组分
便携式压力监测仪，PM-P-1	Living Systems Instrumentation	PM-P-1	压力传感器
Radnoti 气泡捕获器顺应性腔室	Radnoti	130149	气泡捕获器
RAPIDPoint500	Siemens	500	血气分析系统
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761	灌注液组分
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888	灌注液组分
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	72068	灌注液组分
磷酸二氢钠二水合物	Sigma-Aldrich	71505	灌注液组分
1 mL 注射器	BD	309659	样本采集
盐酸万古霉素	Slate run pharmaceuticals	70436-021-82	灌注液组分