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建立猪模型以研究子宫动态保存与移植

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DOI：

10.3791/67357

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2024年12月20日

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1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Children's Boston, 3Plastic Surgery Research Laboratory, Department of plastic and reconstructive surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Department of Gynecology and Obstetrics, CHU de Rennes, University of Rennes, 5Division of Plastic Surgery Research, Vascularized Composite Allotransplantation Program Development, Cedars-Sinai Hospital, 6Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, CHU de Rennes, University of Rennes, 7SITI Laboratory, UMR1236 INSERM, Établissement Français du Sang, University of Rennes

本文内容

摘要

本文描述了一种详细且可重复的猪子宫模型，从手术获取到启动机器灌注的全过程，可用于研究移植中的子宫保存方法。

摘要

迄今为止，对于患有绝对性子宫不孕症（如罗基坦斯基综合征）的女性而言，子宫移植是唯一能够实现妊娠并分娩的选择。尽管近年来人们对子宫 移植的兴趣日益增加，但仍有一些问题需要进一步研究，包括缺血-再灌注损伤及其对移植物质量和排斥反应的影响。近期文献报道，子宫 移植术后血栓并发症的发生率高达20%。此类并发症可能由缺氧诱导的内皮细胞损伤引起，常导致子宫移植物排斥。缺氧主要发生在静态冷保存过程中，而静态冷保存目前仍是实体器官移植中移植物保存的金标准。近年来，采用机械灌注的动态保存方法已被证明可通过减少缺血和缺氧损伤，改善常规及边缘器官的长期保存效果。在本方案中，我们将详细描述基于双侧子宫蒂的猪子宫获取及动态保存的各个手术步骤，以实现与机械灌注方案的连接并启动灌注程序。

引言

在过去十年中，子宫移植（UTx）取得了显著进展，多个研究团队已启动临床研究项目。迄今为止，UTx 的主要适应证是由于子宫发育不全导致的绝对性子宫不孕，其中包括梅耶尔-罗基坦斯基-许斯特尔-奥尔病（Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser，MRKH）综合征。MRKH 综合征是一种先天性疾病，其发病率约为每 5,000 名女性活产婴儿中 1 例1。UTx 还可能适用于其他类型的不孕症，包括因恶性肿瘤、产后出血、子宫肌瘤、感染后遗症以及各种先天性畸形而行子宫切除术后的患者。这表明大约每 500 名女性中即有 1 人可能符合 UTx 的适应证。

首例临床子宫移植（UTx）于2000年在沙特阿拉伯进行2，但由于血管并发症，患者在三个月后接受了子宫切除术。自那以后，已开展了多例子宫移植手术，供体来源包括活体和死亡捐献者，已成功实现80多例活产3,4。与实体器官移植和血管化复合组织异体移植（VCA）类似，免疫排斥反应是子宫移植中面临的重要挑战5。多种因素可导致移植物排斥，包括微循环衰竭和静脉淤滞，二者均可引发血栓并发症。Kristek等人在最近一项关于移植中子宫血管化的综述中报道，动脉血栓发生率高达15%，静脉血栓发生率为5%6。此外，冷缺血和热缺血是影响移植成功的关键因素，因为缺血-再灌注损伤（IRI）可导致移植物功能障碍和急性排斥反应7,8。心肌细胞在缺血应激下可通过产生乳酸维持最多6小时9，此后肌肉细胞损伤将不可逆转。临床研究已记录了冷缺血对子宫肌层的影响，研究表明，在静态冷保存（SCS）期间使用细胞内液类似的威斯康星大学溶液（University of Wisconsin solution），相较于林格氏醋酸盐溶液，可改善器官保存效果，表现为对前列腺素的收缩反应更佳以及ATP浓度更高10。然而，热缺血与冷缺血对子宫移植的影响仍缺乏充分研究。

静态冷保存（SCS）仍是包括子宫在内的血管化复合组织移植（VCA）以及大多数实体器官移植的金标准。然而，近年来，机械灌注系统和保存液的显著进步引发了一场范式转变。目前已有充分证据表明，动态机械灌注能够改善并延长健康及边缘性实体器官的保存效果11,12,13,14,15。该技术目前已在肺、心脏、肝脏和肾脏移植的临床实践中广泛应用14,16,17,18。动态器官保存已显示出多种优势，包括通过持续供氧和营养供给以减少冷缺血和缺氧损伤、清除有毒代谢产物，并改善移植物的质量和活力参数12,19。目前已开发出多种模式，涵盖从低温到常温机械灌注（无论是否含氧载体），并有多种灌注液可供选择，但仅有少数在子宫上进行过测试20。为确保此类研究视角产生实质性贡献，建立相关的临床前外科模型至关重要。

本研究采用亚常温机械灌注（SNMP）作为在室温（约 20 °C）下通过滚压泵和氧合器循环灌注液实现氧合的动态器官保存方法。选用猪模型，因其在解剖结构、生理特征及血管尺寸方面与人类生殖系统相似，适用于子宫移植（UTx）和器官保存的相关研究21,22。子宫在循环停止后获取，该模型与心脏死亡后捐献具有相关性，并提示在其他重要实体器官获取后可能存在延迟获取子宫的可能性23,24。此外，该模型有助于在已具备其他器官移植研究基础的移植实验室中开展子宫保存研究，同时遵循 "3Rs" 原则25。本研究旨在建立一种基于子宫血管蒂的新型保存模型，并评估其用于动态保存的可靠性。文中详细描述了从子宫切除到保存的全部操作步骤，重点突出了SNMP应用中的关键环节。

以下所述方案是在基于单个泵的预实验之前进行的 "Y型管" 双侧子宫动脉灌注系统（补充图1）。4小时SNMP灌注后，器官重量增加了超过初始重量的50%。流量、压力、阻力和重量变化如图所示。 补充图2单个灌注系统分为两个流入通道时，无法独立调节每侧的流量以匹配各自的压力。在这种情况下，SNMP导致器官一半出现显著水肿补充图3）。该系统被证明不适用于子宫模型，部分原因是子宫模型不应被视为完全对称的结构。因此，本方案中采用了两套机器灌注系统，分别用于两条子宫动脉。

方案

所有动物均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》接受人道护理，实验方案经麻省总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。本研究共使用6只体重30–40 kg的雌性尤卡坦小型猪用于子宫获取，其中4个子宫接受了SNMP处理。所有动物在安乐死前均接受全剂量肝素化（100 IU/kg）。器官获取在动物死亡后进行，热缺血时间少于60分钟。根据 "3Rs" 原理25。参见 材料表 有关本方案中使用的所有试剂和设备的详细信息。

1. 术前准备（手术前一天）

  1. 准备灌注液。对于亚常温机械灌注，使用一种为VCA优化的Steen+溶液 26,27。每个子宫使用1升溶液，其成分详见表1。
    注：向灌注液中加入大量氢氧化钠，旨在使pH达到约7.5–7.6。该pH值明显偏高，但有必要，因为在机器循环过程中使用碳合气（95%氧气；5%二氧化碳）进行氧合时，pH倾向于下降。
  2. 搭建机械灌注系统（图1）。在灌注液循环时检查是否存在泄漏和气泡。

2. 死后子宫采集

注意：为了模拟心脏死亡后捐献和/或死后器官获取，应根据当地实验动物护理和使用委员会（IACUC）指南对动物实施安乐死。应优先选择放血法而非静脉注射戊巴比妥钠，以避免可能干扰研究的毒性作用。

  1. 将已处死的动物置于仰卧位。清洁腹部区域，并铺上无菌巾。
  2. 使用#20刀片在脐下正中做10 cm长的切口。
  3. 使用单极电刀切开皮下组织和腱膜。
    注意：打开腹腔时需注意避免损伤肠管。
  4. 用手术纱布将小肠移开，暴露子宫。
    注意：所用模型的子宫解剖结构见图2A。
  5. 对左侧和右侧操作步骤相同，具体如下：
    1. 辨认子宫血管。
      注意：子宫静脉位于子宫动脉的外侧（图3）。
    2. 使用直角钳在子宫静脉外侧的阔韧带处打开一个开口。
    3. 通过该开口，使用2-0丝线结扎缝合卵巢血管，并用电凝法分离子宫周围阔韧带中的结缔组织。
    4. 使用2-0丝线结扎子宫-卵巢血管，切除卵巢和输卵管。
    5. 游离子宫血管，并尽可能靠近髂内血管处将其切断。
      注意：应尽量保持血管蒂长度，以便于插管，并预防血管蒂切断后回缩。
    6. 在对侧重复步骤2.5.1–2.5.5。
  6. 使用单极电刀切断宫颈，取出子宫。
    注意：应延长接触时间，确保宫颈血管充分凝固，防止灌注过程中发生渗漏。

3. 灌注准备

  1. 在侧台上，使用显微外科扩张器扩张双侧子宫动脉，并插入套管针。用3-0丝线固定插管（图2B）。
    注意：此处所有动脉均使用18 G套管针。插入导管时需注意不要过深，以免发生选择性插管，因为分叉位置相对较近。不进行子宫静脉插管，因为静脉回流足以保持这些血管管腔开放，便于液体收集。此外，创伤性插管不仅耗时，还可能导致血管损伤，并可能影响静脉回流。
  2. 每侧缓慢手动冲洗双侧子宫动脉，各使用20 mL肝素溶液，直至所有血管冲洗干净，流出液澄清。
    注意：冲洗时必须避免高压，否则可能导致微血管损伤和灌注失败。
  3. 称量子宫重量。

4. 亚常温机械灌注

注意：对于子宫，需要两个独立的机器灌注系统。每条子宫动脉连接到一个由滚压泵、氧合器、气泡捕获装置和压力传感器组成的灌注系统。灌注液储存在储液器中，通过硅胶管在上述各组件间循环，随后经由每侧的子宫动脉流入子宫，再从子宫静脉流出，返回同一储液器中。

  1. 通过将子宫动脉插管连接到灌注系统的进液管路，将子宫连接至机器灌注系统（图1）。
  2. 使用滚轴泵将流速调节至较低水平（2.5–4.0 mL/min），以维持动脉压力在25–35 mmHg之间恒定。
  3. 在预设的每个时间点，使用1 mL注射器从进液端和出液端取样，并通过血气分析仪检测样本中的活力参数[例如：血气指标（pH、pCO2、pO2、乳酸、碱剩余、碳酸氢盐）、葡萄糖、钠、钾、钙、氯]。
    注意：本方案中灌注持续4小时，每30分钟从进液端和出液端各取一次样本。
  4. 灌注结束后称量子宫重量。

结果

灌流过程中，系统连接至一个压力传感器，用于记录实验期间的压力。首先记录无子宫状态下的系统压力，然后从子宫灌流时的压力记录中减去该值，以获得器官的实际压力。通过滚压泵调节流速，使压力维持在目标范围内。阻力通过公式 R = P / Q 计算（R：阻力（mmHg·mL·min-1）；P：压力（mmHg）；Q：流速（mL/min））。

灌注参数的演变如图4所示。两侧子宫的平均初始流速为5.2（最小值2.4，最大值10.0）mL/min，在实验过程中波动不大。根据文献及前期实验结果，目标压力设定为25–35 mmHg。子宫左侧的平均初始动脉压为26（最小值10，最大值36）mmHg，右侧为27（最小值16，最大值39）mmHg。由于流量和压力均略低且较为稳定，由此得出的动脉阻力曲线在整个实验过程中也呈现平坦趋势。两侧的平均初始血管阻力均为8.5（最小值1，最大值13.3）mmHg·mL·min-1（图4）。

根据多个代谢参数评估了 SNMP 保存效果（图5）：乳酸清除率（流出乳酸与流入乳酸之差）、重量变化、反映葡萄糖消耗的流入与流出葡萄糖差值，以及氧气消耗量。氧气消耗量通过以下公式计算：O2消耗量 = 0.0314 × Q × (pO2流入 - pO2流出) / W（其中 Q：流速（mL/min），pO2：氧分压（mmHg），W：重量（g），0.0314 为 20 °C 和 1 atm 条件下水中亨利常数）。灌注第一小时内乳酸水平的下降表明，机器灌注可清除在热缺血阶段积累的乳酸。重量变化显示所有子宫均未出现水肿。曲线表明，重量损失主要发生在前两小时内，之后趋于稳定。流入与流出之间的葡萄糖差值在灌注第一小时内下降，随后在较低水平保持稳定。灌注期间氧气消耗量保持恒定。

SNMP 4小时后，对每个子宫进行血管造影，缓慢向每侧子宫动脉灌注20 mL造影剂（图6），以评估保存阶段后的血管树情况。在所有器官中，宫颈、子宫体及子宫角的微血管结构均清晰可辨。

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图1: 外科手术模型与机械灌注系统 (A子宫SNMP用机器灌注系统的示意图。B猪子宫进行SNMP的代表性照片。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图 2： 人类（左）和猪（右）子宫解剖结构示意图，显示通过子宫动脉的主要血管分布。猪子宫的解剖特征主要表现为存在一个较小的子宫体，并分为两个较大的子宫角。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3： 术中及术后图像。（A）识别子宫血管后术中的子宫图像。（B）获取子宫并用肝素盐水冲洗后的术后图像。A：子宫体；B：子宫角；C：宫颈；D：子宫动脉；E：子宫静脉；F：输卵管；G：卵巢。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4： 子宫两侧在4小时机器灌注期间灌注参数的变化曲线。 （A）流速（mL/min）。（B）压力（mmHg）。（C）计算动脉阻力（mmHg·min·mL-1）。曲线表示子宫每侧的平均值，误差线表示均值的标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：机器灌注期间主要缺氧标志物的监测。 (A) 灌注前90分钟内乳酸清除情况，直至稳定。(B) 灌注过程中重量持续下降。(C) 灌流液流入与流出时葡萄糖浓度的差异。(D) 计算得到的O2消耗量。数据表示每个子宫双侧的平均值，误差线表示平均值的标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6： 子宫血管树在亚常温保存后的代表性血管造影。（A）注入造影剂前。（B）注入造影剂后。请点击此处查看该图的放大版本。

组分名称数量组分名称数量
去离子水1L低分子量右旋糖酐（~75 kDa）5 g
NaCl5.026 g牛血清白蛋白150 g
KCl0.343 g氢化可的松 [50 mg/mL]0.2 mL
CaCl2 · 2H2O0.221 g地塞米松 [1.6 g/100 mg]4 mL
NaH2PO40.187 g氢氧化钠 [1 mol/mL] 16 mL
NaHCO31.26 g低分子量肝素200 IU
MgCl2 · 6H2O0.244 g胰岛素200 IU
D-葡萄糖4.3 g万古霉素1.5 g
PEG (35 kDa)5 g

表1：Steen+ 溶液成分 NaCl：氯化钠；KCl：氯化钾；CaCl22H20：二水合氯化钙；NaH2PO4：磷酸二氢钠；NaHCO₃3：碳酸氢钠；MgCl2 · 6H₂O2O：六水合氯化镁；PEG；聚乙二醇。

补充图1：基于单泵的灌注系统。（A）用于初步实验的机器灌注“Y型系统”示意图。（B）初步实验装置的代表性照片。请点击此处下载该文件。

补充图 2： 初步实验中 4.5 小时 SNMP 期间灌注参数的概况。 （A）流速（mL/min）。（B）压力（mmHg）。（C）计算的动脉阻力（mmHg·min·mL-1）。（D）灌注过程中重量的增加。 请点击此处下载该文件。

补充图3： 初步实验结束时（4.5 h-SNMP）子宫的摄影图像。 水肿呈不对称分布，主要位于右侧角（图像右侧）。请点击此处下载该文件。

讨论

子宫移植通常被视为血管化复合组织移植（VCA）的一部分，近年来发展迅速。与此同时，由于机械灌注在改善实体器官保存方面已展现出充分的证据支持，其在VCA领域的应用也开始受到关注。低温和亚常温机械灌注技术已在包含肌肉皮肤和骨骼的猪VCA模型中实现长达24小时的保存效果26,27,28。由于子宫在保存方面面临的挑战与含骨骼和皮肤的VCA相似，因此探索类似技术以提升子宫移植（UTx）的保存质量和长期预后至关重要29。除了改善器官质量外，机械灌注实现动态保存的另一潜在优势是扩大供体来源30。从活体供体获取子宫存在较大风险，例如在分离子宫蒂过程中可能发生输尿管损伤，同时可能引起激素紊乱，以及因可能实施的卵巢切除术而导致早发性绝经的相关风险31,32。通过提升死亡供体器官的质量，有望避免在活体供体采集过程中实施此类手术。最终目标是实现无论活体或死亡供体均可进行子宫采集，以满足绝对性子宫不孕女性的临床需求33。

本文提供了一种可重复的猪子宫获取与机器灌注保存模型。通过使脑死亡供体成为可靠的子宫来源，改进保存质量和延长保存时间对于扩大供体池具有重要意义。临床上，大多数子宫移植（UTx）基于活体供体进行，供体多为家庭成员或亲密朋友。缺血时间是影响最终器官存活能力的关键因素，尤其在脑死亡供体中更为显著。 缺血-再灌注损伤（IRI）是指由于缺血（器官血管系统内血液循环中断）和再灌注（氧气供应恢复）相继发生所导致的细胞损伤，常伴随温度升高，从而加剧细胞损伤。这一系列事件会产生大量活性氧物质，最终引发慢性炎症、细胞凋亡、抗原释放以及移植物排斥7,8,34。热缺血时间（WIT）和冷缺血时间是IRI过程中的关键因素，但目前仅有少数研究针对子宫开展相关探讨。在一项关于小鼠UTx中长期静态冷保存（SCS）效果的研究中，经过24小时SCS后进行移植，六只动物中有五只成功妊娠；然而，在经历48小时SCS后，所有移植物均出现坏死35。另一项研究比较了14只母羊在3小时SCS（n = 7）与24小时SCS（n = 7）后的UTx结果，移植后第8天仅存7只动物存活，根据水肿和坏死情况评估，仅有35%的子宫被认为具有活性，其中3小时SCS组有2例子宫，24小时SCS组有3例子宫36。有趣的是，具有活性的子宫仍保持肌层收缩功能，但该评估方法未被明确说明。这突显出一个重要观点：成功的子宫移植不仅需要移植物存活，还需实现正常月经功能及成功妊娠。因此，减少IRI及其负面影响至关重要，是提升移植物质量与提高活产率的前提。为确保实验一致性，我们确保所有器官均在相近的WIT后获取。在阔韧带内的所有血管均被凝固或结扎，以保证准确的压力测量及充分的毛细血管灌注至整个器官。导管插入是另一个关键步骤，需特别注意固定导管的同时避免损伤血管。

采用"Y型系统"进行的初步实验，优化了两个独立的灌注系统，可分别对每侧子宫动脉进行灌注。事实上，灌注流速和灌注压力是关键参数之一26,27，需根据器官整体血管阻力调整流速。优化后的双侧流入使器官每侧的乳酸得以清除，如本研究结果所示（图5），同时也实现了所有代谢参数的连续动静脉差值测量。在亚常温条件下，机械灌注可实现细胞再氧合，清除在获取及插管过程中因缺氧和低灌注导致的无氧代谢阶段所积累的乳酸，同时维持较低的代谢活性，避免乳酸反弹。类似结果在大鼠后肢模型中亦有报道19。在另一解剖模型中，Dion 等人在其低温灌注研究中采用包含腹主动脉的子宫获取方式，提出了不同的方法37。未来研究中，将基于腹主动脉的单通路灌注与本方案所建立的模型进行系统比较，将具有重要意义。

尽管本文描述了一种可重复的猪子宫机械灌注模型，但一个主要问题是该模型是否适用于后续的移植。为了验证保存方案的有效性，移植至关重要，因为其能够模拟临床环境。这需要进行动脉和静脉的显微外科吻合。已有若干研究表明，在子宫静脉管径不足以致无法保证静脉引流的情况下，临床子宫移植（UTx）中可使用子宫-卵巢静脉38,39。本模型的一个局限性在于未能保留子宫-卵巢静脉。然而，在所有纳入的重复实验中，经过4小时的常温机械灌注（SNMP）后均未记录到明显水肿，且所有子宫静脉均持续有静脉流出。这提示猪与人类模型之间可能存在差异，在尤卡坦微型猪中，UTx手术或可得到潜在简化。未来的研究应考虑将灌注时间延长至4小时以上，以确定动态保存的极限。综上所述，本文描述了一种可用于研究基于机械灌注保存方法的可重复猪子宫模型，并为靶向减轻缺血-再灌注损伤（IRI）、增加可用于UTx的器官总数提供了有价值的资源。

披露

所有作者均无财务利益需要申报。

致谢

这项工作部分由美国国立卫生研究院资助 美国健康研究所资助项目编号R01AR082825（BEU）以及Shriners儿童医院资助项目编号84308（YB）。HO和YB获得Fondation des Gueules Cassées基金会的资助。特此感谢法国整形、重建与美容外科学会（SOFCPRE，法国）以及雷恩大学医院（CHU de Rennes，法国）对YB提供的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Affinity Pixie 氧合系统MedtronicBBP241氧合器
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA9647灌注液组分
氯化钙二水合物Sigma-Aldrich223506灌注液组分
二氧化碳氧气混合气AirgasUN3156二氧化碳氧气混合 气体 
D-(+)-葡萄糖一水合物Sigma-Aldrich49159灌注液组分
地塞米松Sigma-AldrichD2915灌注液组分
右旋糖酐Thermo scientific406271000灌注液组分
肝素钠注射液Eugia Pharma63739-953-25灌注液组分
Humulin 正规胰岛素（人源）Lilly0002-8215-01灌注液组分
氢化可的松琥珀酸钠Pfizer0009-0011-03灌注液组分
氯化镁六水合物Sigma-AldrichM9272灌注液组分
MasterFlex L/SCole-Parmer77200-32蠕动泵
聚乙二醇 35000Sigma-Aldrich25322-68-3灌注液组分
氯化钾Sigma-Aldrich7447-40-7灌注液组分
便携式压力监测仪，PM-P-1Living Systems InstrumentationPM-P-1压力传感器
Radnoti 气泡捕获器顺应性腔室Radnoti130149气泡捕获器
RAPIDPoint500Siemens500血气分析系统
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761灌注液组分
氯化钠Sigma-AldrichS9888灌注液组分
氢氧化钠Sigma-Aldrich72068灌注液组分
磷酸二氢钠二水合物 Sigma-Aldrich71505灌注液组分
1 mL 注射器BD309659样本采集
盐酸万古霉素Slate run pharmaceuticals70436-021-82灌注液组分

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