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一种用于胶质母细胞瘤激光间质热疗的免疫活性小鼠模型

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DOI：

10.3791/67381

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2024年11月15日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Human Anatomy and Cell Sciences, University of Manitoba, 2Department of Pathology, University of Manitoba, 3Department of Medical Microbiology & Infectious Diseases, University of Manitoba, 4CancerCare Manitoba

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

胶质母细胞瘤是一种破坏性极强的原发性脑癌，而激光间质热疗正逐渐成为无法手术切除的胶质母细胞瘤的一种有前景的替代传统手术切除的治疗方法。本方案描述了一种优化的临床前小鼠模型，可用于研究治疗效果或辅助治疗与联合治疗方案。

摘要

胶质母细胞瘤（GB）是原发性脑癌中最具有侵袭性的类型，约占成人所有高级别原发性脑肿瘤的50%，目前尚无治愈手段。激光间质热疗（LITT）是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗GB的方法，适用于不适合接受传统手术切除的患者。尽管LITT的临床疗效已得到证实，但除临床病例报告和病例系列研究之外的相关研究仍十分有限，主要受限于缺乏成熟的动物模型。本实验方案采用C57BL/6小鼠和同源CT2A胶质瘤细胞系，以高度模拟人类GB ，同时使用波长为1064 nm的掺钕钇铝石榴石（Nd:YAG）激光器——该激光器与目前两种FDA批准的LITT系统之一所用设备相同，因而具有良好的临床前相关性。成功建立该LITT小鼠模型将为深入研究LITT消融的独特特征及其对肿瘤微环境的影响提供一个有价值的平台，有望推动更优治疗策略的发展。

引言

癌症是加拿大死亡人数最多的首要死因。胶质母细胞瘤（GB）是最常见的侵袭性脑肿瘤，占成人所有高级别原发性脑肿瘤的48%至60%1GB的预后尤其严峻，5年净生存率仅为4.8% 与 常规治疗，包括手术切除、化疗和放疗1,2.

激光间质热疗（LITT）是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的治疗方法，利用激光对无法手术的脑肿瘤患者进行原位高温肿瘤消融，为传统手术切除提供了一种有吸引力的替代治疗方案3。然而，目前尚缺乏针对胶质母细胞瘤（GB）LITT治疗的详细且特征明确的小鼠模型，这阻碍了临床前研究的开展。

本方案旨在展示一种经优化的用于胶质母细胞瘤（GB）激光间质热疗（LITT）的临床前小鼠模型。我们选择使用C57BL/6小鼠及其同源胶质瘤细胞系CT2A，主要是因为CT2A在组织学特征、侵袭性、化疗和放疗耐药性以及具有自我更新能力和肿瘤再形成能力的干细胞样特性方面，能够很好地模拟人类高级别胶质母细胞瘤4。这些特性为涉及免疫反应或新型治疗策略的多种研究提供了优良的实验平台。此外，本LITT方案的技术细节也可轻松适用于其他同种异体移植和异种移植小鼠模型4,5,6，相关内容将在下文进一步讨论。

本方案的优势在于采用了一种简单而有效的激光间质热疗（LITT）治疗模式，可获得稳定一致的结果。所使用的1064 nm掺钕钇铝石榴石（Nd:YAG）激光器，与目前两种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的临床系统之一所用的设备相同，因而可使实验条件与LITT在高级别胶质瘤治疗中的临床应用高度一致。本方案的主要缺点是在肿瘤细胞植入和LITT治疗过程中必须极为谨慎，以确保结果的可重复性。此外，由于CT2A细胞系具有高度侵袭性，该方案对时间要求极为严格。大多数实验最长需在20天内完成，这可能限制对某些适应性免疫应答或其他在较长时间尺度上发生的细胞与分子机制的深入研究。

方案

本方案的动物伦理已获曼尼托巴大学动物护理委员会批准，符合加拿大动物护理委员会（CCAC）制定的伦理准则。本方案采用8至12周龄的C57BL/6免疫健全小鼠及同系胶质瘤细胞系CT2A，建立具有广泛应用前景的临床前模型，可用于组织学分析、免疫学变化或联合治疗干预等实验研究。根据实验需求，该方案可轻松适用于其他小鼠品系或细胞系。

CT2A 移植实验示意图，显示 MRI、LITT 治疗、组织采集和分析步骤。
图 1：实验设计的基本图示。 使用 BioRender.com 制作 请点击此处查看此图的放大版本。

1. 细胞制备简要步骤（第0天）

  1. 开始细胞培养前，确保使用紫外线和乙醇对超净台及所有所需移液器进行彻底灭菌。
  2. 将含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）和胰蛋白酶置于水浴中，恢复至室温（RT）。
  3. 用移液器吸出T25培养瓶中的培养基，用PBS短暂冲洗细胞。向细胞中加入1 mL胰蛋白酶，孵育30–60秒，直至细胞从培养瓶表面脱落。
  4. 在光学显微镜下确认细胞已脱落，然后加入4 mL培养基以终止胰蛋白酶的酶活性。
  5. 使用自动细胞计数仪进行细胞计数。
    1. 取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合，再取10 µL混合液加入细胞计数载片中。
    2. 将载片插入细胞计数仪，记录总细胞数、活细胞数及活细胞百分比。

注意：如果无法使用自动细胞计数仪，可使用血细胞计数板进行手动计数。

  1. 计算所有计划注射所需的细胞数量。
    注意：对于CT2A，建议每1.5 µL注射体积中含5000个细胞，每次制备总量至少为100 µL。
  2. 以134 × g 离心5分钟，使细胞沉淀，并尽可能吸除上清液。
  3. 在微量离心管中，用含5%基底膜提取物的PBS重悬细胞沉淀，体积根据需要确定。虽然较小的离心管更适合制备细胞悬液，但在手术过程中使用2 mL离心管更利于储存，因为细胞不易聚集在更圆润的管底，且通过轻弹管壁可使其迅速重新分散。
  4. 将细胞置于冰上以备注射，并根据需要每4-5小时新鲜制备一次细胞悬液。

2. 原位移植（第0天）

  1. 准备手术区域，并确保所有所需器械均已灭菌并处于可用状态。
  2. 使用异氟烷（3% 挥发于 1 L/min 氧气中）麻醉小鼠2) 在监测呼吸频率（目标 60 bpm）的同时置于密闭室中。
  3. 获取并记录动物体重，用于药物剂量计算。
  4. 小心剃除手术区域的毛发，避免触碰眼睛、耳朵和触须。
  5. 将动物转移至立体定位仪。
    1. 将门齿放入咬杆的孔中，调整鼻锥至贴合，拧紧固定螺钉以固定。
    2. 通过双侧后肢脚趾夹捏检查麻醉深度，必要时使用耳杆固定颅骨，并调整动物头部至中立、水平位置。
    3. 使用润滑的直肠温度探针监测动物核心体温，并提供辅助加温 37 °C 使用体下加热垫。
      警告：请小心不要过度拧紧鼻锥，因为即使对鼻骨施加中等程度的压力，也可能导致呼吸停止。如果使用电加热垫（例如用于饲养箱的加热垫），请确保温度设置准确，并保持设定温度恒定。
  6. 在双眼上充分涂抹眼用软膏以防止干燥。
  7. 给予预防性注射并检查麻醉深度。
    1. 根据当地动物设施指南，使用28 G × ½"注射器皮下注射美洛昔康或其他长效镇痛药物（例如，5.0 mg/kg 美洛昔康）。
    2. 在较长时间的操作过程中，为预防性补液支持，皮下注射20 mg/kg预热的生理盐水。
    3. 将麻醉剂异氟烷浓度降低至1.5%-2.0%，以维持目标呼吸频率。
  8. 使用无菌技术覆盖动物并准备手术区域。
    1. 使用无菌棉签，涂抹聚维酮碘或氯己定消毒液。从切口部位内侧开始，每次擦拭后旋转棉签，由内向外操作；然后使用另一根新的无菌棉签，以类似方式在该部位涂抹70%乙醇。
    2. 用碘伏擦拭后，再用70%乙醇擦拭，重复此步骤共3次（即总共进行3次，每次均包含碘伏和70%乙醇擦拭）。
  9. 在进行手术暴露前重新检查麻醉深度。在整个操作过程中密切监测呼吸频率，并根据需要调整麻醉剂用量。
  10. 从两眼后方中线位置开始，使用15号刀片沿中矢状面朝尾端做1-1.5 cm的切口。或者，可用虹膜剪延长较短的刀片切口。
    注意：切口应从正中线开始，但为单侧注射时，可略微向外侧倾斜，以便同时观察和准确定位前囟点及钻孔位置。
  11. 使用无菌棉签轻柔地推开伤口边缘以暴露颅骨，并轻轻擦拭去除该区域的任何结缔组织。
    1. 必要时，可使用浸有双氧水的无菌棉签清洁颅骨表面，以观察颅缝。
  12. 定位Bregma，即左右冠状缝在正中线与矢状缝交汇处（参见 图2).
    1. 使用无毒的彩色丙烯酸树脂和无菌木签或类似工具，在Bregma上方做一个非常小的标记。
      注意：在某些情况下，左右冠状缝并不对称；此时，应使用“最佳拟合线”来估算它们在正中矢状面上的相交位置。
  13. 确保动物头部位置没有倾斜或旋转（即处于水平平面）。
    1. 以颅骨前囟（Bregma）为立体定位零点。x 坐标表示内侧-外侧（ML）方向的位移，y 坐标表示前-后（AP）方向的位移，z 坐标表示背侧-腹侧（DV）方向的位移。
    2. 确保Lambda与Bregma处于相同的DV平面（即，这两个标志点的z坐标均为0）。同样，在Bregma外侧+2.0 mm（x = 2）和-2.0 mm（x = -2.0）处，确保颅骨处于同一平面，DV/z坐标大致相等。确认颅骨固定牢固，调整后无任何移动。
  14. 在前囟（Bregma）前方 +2.0 mm（ML）和 +0.5 mm（AP）处钻颅骨孔图3).
    1. 使用立体定位钻孔装置附件，小心降低钻头尖端，直至其接触前囟，将坐标归零。
    2. 略微抬起钻头，并将钻孔装置调整至相应前后（AP）和内外（ML）坐标位置。
    3. 缓慢降低钻头，注意仅磨除颅骨。
    4. 或者，使用立体定位仪中的微升注射器， lowering 针尖直至其接触前囟（Bregma），并将坐标归零。
    5. 略微抬起针头，并调整至相应的前后（AP）和左右（ML）坐标。
    6. 将尖端 lowered 至接触颅骨，并记录确切位置。
    7. 将针头略微抬起，用外科标记笔在目标位置做一个小标记。
    8. 抬起或旋转持针器以避开操作区域，使用手钻在颅骨上磨孔，注意避免损伤下方的脑组织。注意：通常情况下，雄性小鼠年龄越大，颅骨相对较厚，需要更长时间的钻孔。手钻操作时应谨慎进行，施加最小压力，因为颅骨突然破裂可能导致下方脑膜和/或脑组织受损。
      注意：在激光间质热疗（LITT）过程中，需扩大颅骨钻孔以容纳热电偶探头。此步骤可在初次注射手术期间完成，有利于后续LITT手术更快、更顺利地进行。 Alternatively，也可在LITT手术过程中以相同方式扩大钻孔，这可能降低颅外肿瘤生长的风险。
  15. 在注射位点外侧1.0 mm处（即+3.0 mm ML，+0.5 mm AP）为热电偶制作第二个颅骨钻孔。
    1. 按照前一步骤中所述的钻孔程序进行操作。
    2. 为避免骨再生带来的困难，需去除两个孔之间的骨组织。
      注意：建议以颅骨缝（Bregma）为参考点，采用 +2.0 mm ML、+0.5 mm AP 和 -2.5 mm DV 作为肿瘤植入的坐标。该位置位于尾状壳核上部，可实现稳定的肿瘤生长，且动物耐受性良好；然而，本方案也可根据需要调整至其他位置。
  16. 在微量注射器中制备CT2A小鼠胶质瘤细胞悬液（5000个细胞） 1.5 µL).
    1. 从冰上取出预先准备好的细胞微量离心管，用指尖轻轻弹击管底以重悬细胞。
    2. 轻柔吸取 2 µL 到一个 5 µL 或 10 µL 注射器，注意避免产生气泡。
    3. 表达 0.5 µL 以排除所有空气，确保针头已预充并正常工作。
    4. 用酒精棉片擦拭针轴，以去除渗出的液体及针体外表面的细胞（这些细胞可能引起软脑膜肿瘤生长）。
  17. 将注射器装入微量注射泵（或手动立体定位装置）中，缓慢降低针头。
    1. 将针头缓慢降至指定深度（z = -3.0 mm），并暂停 1 分钟。
    2. 缓慢回撤针头0.5 mm（z = -2.50 mm），并注射细胞（≤ 0.5 µL/min用显微外科海绵棒保持注射器周围区域干燥，注意不要扰动针头。
    3. 注射完成后至少等待 2 min，然后在 3–4 min 内缓慢撤出注射器。确保前 4–5 个撤出间隔的 100 µm 为防止细胞从其原始注射部位脱落，需缓慢回撤。
    4. 使用酒精棉片轻轻擦拭针头外部，去除任何血液或液体，并根据制造商的说明冲洗和清洁注射器。在每次注射之间使用磷酸盐缓冲液（PBS）和蒸馏水，以确保针头不堵塞。注射完成后，用70%乙醇充分冲洗针头，以清除针头中残留的任何细胞。
      警告：每次注射后未冲洗针头可能导致堵塞。若需注射多种细胞类型，应为每种细胞类型使用单独的针头，以避免可能的交叉污染。
  18. 重新对合切口，注意使切口边缘稍外翻，以便下方真皮层相互接触。使用伤口夹或5-0缝线进行3针间断缝合关闭伤口。在闭合后的伤口处涂抹聚维酮碘溶液。
  19. 将动物从立体定位仪中取出，放入垫有纸张的恢复笼内，并置于设定温度的加热垫上 37 °C确保动物呈胸卧位后，将其转移回饲养笼，笼底放置一小盘湿饲料。
  20. 术后当天开始，至少每天两次监测动物状态，持续2天。分别在术后24小时、48小时和72小时重新给予美洛昔康，或根据机构指南执行。

显示冠状缝、矢状缝、人字缝、前囟和人字点解剖位置的颅骨示意图。
图 2：小鼠颅骨及立体定位手术重要解剖标志的示意图。 使用 BioRender.com 创建 请点击此处查看此图的放大版本。

颅骨手术设置示意图，显示热电偶和激光光纤在前囟附近的位置。
图3：颅骨钻孔与激光装置位置的示意图。 本图展示了前囟（Bregma）解剖标志、(A) 用于插入(A') 激光光纤的初始钻孔，以及(B) 用于插入(B') 热电偶探针的第二个（或延伸）钻孔之间的相对位置。右侧为激光光纤与热电偶探针的剖切示意图，显示探针如何通过一个带有预钻孔的立体定位末端足架进行固定，预钻孔的尺寸和间距均符合实验需求。图片使用 BioRender.com 制作。请点击此处查看该图的放大版本。

3. LITT 前肿瘤负荷监测（第 9 天）

  1. 根据机构指南进行T2加权磁共振成像（MRI），以评估激光间质热疗（LITT）前一日的肿瘤生长情况。
    注意：肿瘤直径应约为 1.5–2.0 mm。
    1. 使用以下参数获取小鼠全脑的合适冠状面扫描图像：快速自旋回波序列，TR = 5000 ms，TE = 45 ms，回波链数 = 7，视野（FOV）= 30 × 30 mm2矩阵大小 = 250 × 256，总层数 = 18，层厚 = 0.3 mm，信号平均次数 = 2。
      注意：建议从移植后约第6天开始定期进行MRI检查，以确认异体移植是否成功并监测肿瘤生长情况——尤其是在初始实验阶段，因为操作步骤的细微变化都可能影响时间进程。CT2A具有高度侵袭性，需对动物进行密切观察。T2加权冠状位扫描对此目的效果良好。可联合使用荧光标记或荧光素标记的CT2A细胞与 体内 成像系统（IVIS）在无法获得小动物MRI设备时也可作为替代方案。然而，肿瘤的生长动力学及其他特征可能与本实验方案存在差异。

4. 激光间质热疗手术（第10天）

  1. 同第2节所述，重复步骤2.1–2.13，准备动物以进行激光间质热疗（LITT）。
    注意：由于物种差异及实验时间线的不同，前次手术后的伤口愈合可能处于不同阶段。再次制作切口时，需注意组织可能更薄或更脆弱。
  2. 使用无菌棉签轻轻清洁颅骨，清除遮挡前囟点（Bregma）或先前钻孔部位的任何组织。如有必要，可重新钻孔；但由于CT2A肿瘤形成速度较快，骨组织再生极少或几乎没有。
  3. 将LITT装置固定于立体定位仪框架后，以前囟点（Bregma）为基准，将激光光纤尖端的坐标归零。
    警告：激光光纤极为脆弱，弯曲时易破裂。当光纤尖端接触颅骨时，应立即停止操作，避免过度下压。
  4. 将光纤尖端略微上提，移动至目标的内-外（ML）和前-后（AP）坐标位置，然后缓慢将探针下降至目标背-腹（DV）坐标（2.0 mm ML，0.5 mm AP，-2.0 mm DV）。
  5. 设定LITT治疗参数：模式：连续；功率：1 W
  6. 通过脚踏开关将激光由待机切换至激活状态，并启动激光照射60秒。若温度超过46 °C，应短暂暂停，随后重新启动，尽量使温度维持在接近46 °C的水平。
  7. 缓慢回撤激光组件，使用酒精棉签轻轻擦拭激光光纤和热电偶以清洁表面。将组件旋转移开时，注意避免探针与框架发生接触。
  8. 按照上述肿瘤植入后所述的步骤2.18–2.20，缝合伤口并恢复动物。

5. 激光间质热疗后评估（第11天）

  1. 在 LITT 治疗后的次日进行 LITT 术后 T2 加权 MRI 扫描，使用上述第 3.1 步中的序列和参数评估 LITT 肿瘤消融是否成功。
    注：此外，液体衰减反转恢复（FLAIR）序列也可用于评估术后水肿。
  2. 在研究结束前进行随访扫描，以监测治疗后的变化或肿瘤再生长情况。

6. 研究结束时（第11天/第15天/第20天）

  1. 根据机构指南，在选定的实验终点处死动物。
    注意：对于CT2A模型，即使接种细胞数量极低，超过第20天的实验终点也无法实现，因为对照组动物（即假手术或无治疗）以及部分治疗组动物可能已处于濒死状态，需要实施安乐死。如需进行更长时间的实验，建议考虑其他小鼠胶质瘤细胞模型。
  2. 采集组织用于固定和后续处理。
    1. 使用4%多聚甲醛（PFA）进行心脏灌注，并采集目标组织。
    2. 将脑组织在4% PFA中4 °C下浸泡固定过夜。
    3. 按照标准流程对样本进行福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或固定后冷冻分析处理。

7. 分析

  1. 使用 T2 加权 MRI 验证 LITT 消融是否成功，并通过苏木精-伊红染色等基本组织学技术进行验证。
  2. 根据实验需要进行其他附加分析（例如，免疫组织化学、免疫荧光）。

结果

成功的CT2A肿瘤植入和LITT治疗可通过T2加权MRI进行表征，如图4、图5和图6所示。MR图像使用一台7T无液氦超导磁体（17 cm孔径）配合四通道小鼠头部线圈获取，成像序列参数遵循上述方案中的描述。严格遵循本方法可实现接近100%的成瘤率、稳定的肿瘤定位以及大致呈球形的肿瘤形态，如图4所示。这些特征为后续的LITT治疗及进一步分析提供了理想的基础。同样，如图5所示，LITT消融灶在大小和位置上也应保持一致。消融组织的中心区域由凝固性坏死和液化性坏死构成，在T2加权MRI上表现为低信号（即黑色），易于识别。在LITT治疗后的短期内，根据具体治疗参数的不同，病灶内部及周围通常还会出现高信号（即白色）区域，对应于术周水肿。图6展示了一例不良结果，突显了执行本方案时可能遇到的一些潜在问题。

突出显示肿瘤生长的脑部 MRI 扫描序列，诊断成像分析阶段 A-C。
图 4：理想的 CT2A 肿瘤形成的 T2 加权冠状位磁共振成像。形成。 三只 C57BL/6 小鼠在植入后第 12 天肿瘤形成的代表性图像（A、B、C）。白色箭头指示肿瘤边界。请注意肿瘤位置的一致性以及大致呈球形的结构。请点击此处查看该图的放大版本。

MRI脑部扫描显示肿瘤进展的三个阶段；示意图用箭头标出肿瘤区域。
图5：理想LITT消融术后1天的T2加权冠状位MR图像。 三只C57BL/6小鼠在植入后第13天接受LITT肿瘤消融的代表性图像（A，B，C）。可见坏死病灶核心的大小和位置具有一致性。若在LITT术前稍早进行MRI扫描并实施消融，将更有利于在激光靶向所需的最佳肿瘤大小与获取较晚治疗后终点数据的能力之间达到更好平衡。请点击此处查看该图的放大版本。

显示肿瘤的脑部MRI扫描图像；矢状面；医学影像分析；诊断工具。
图6：优化前LITT治疗的T2加权冠状面磁共振图像。三只C57BL/6小鼠（A，B，C）接受相同的激光参数和立体定位靶点治疗，此为非理想结果的示例，图像采集于方案优化之前。白色箭头指示肿瘤边界。带边区域显示水肿范围。可见显著的变异性，包括肿瘤生长不均以及激光消融靶向性差，导致组织损伤不一致。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

关于激光间质热疗（LITT）的文献正在迅速增长；然而，这些研究主要局限于人类临床病例报告或病例系列。事实上，已有若干研究表明LITT具有潜在优势，包括术后并发症发生率和治疗成本较低，同时可实现相当的无进展生存期7,8,9,10,11。此外，LITT治疗后局部复发减少，并提高了全身药物治疗的效果，尽管其机制尚不完全清楚12。LITT在胶质母细胞瘤以外的其他临床应用也展现出良好前景，包括治疗转移性肿瘤及其他肿瘤类型3,12、放射性坏死13、难治性癫痫14、血管畸形15，甚至强迫症16。然而，目前基于小鼠模型的研究仍极为有限，仅有少数例外，且这些研究可能难以重复。例如，一项近期关于LITT治疗后血脑屏障通透性变化的研究使用了在欧洲用于临床的激光发生器，但该设备未获北美地区批准17。尽管该系统似乎适用于相关研究，但大多数研究人员难以负担其成本，且其专有或高度工程化的设计特征难以复制。因此，建立一套可及且优化的临床前动物模型详细操作方案，将为相关研究提供宝贵的机会。

本方案中的关键步骤包括准确定位前囟，以确保在同种异体移植及后续的激光间质热疗（LITT）消融手术中实现可重复的靶向操作。此外，细胞注射步骤中的递送速度和暂停操作尤为关键，对成功移植肿瘤细胞至关重要；若操作不当，将显著增加颅外肿瘤生长和肿瘤异质性升高的风险。还需特别强调，LITT手术应在肿瘤仍相对较小（即直径约1.5–2.0 mm）时进行规划。根据我们的经验，CT2A肿瘤在体积较大时形态往往更加不规则，而过大的肿瘤也会增加脑组织取出的难度，尤其是当肿瘤 已生长穿透皮质表面时。此外，值得注意的是，即使仅间隔24小时（例如治疗前MRI与LITT手术之间），也足以发生显著的CT2A胶质瘤持续生长。

本方案可根据其他实验设计轻松进行多种修改。特别是，本方案重点介绍了在C57BL/6小鼠中成功实施原位移植和激光间质热疗（LITT）手术所需的技术步骤。 同源CT2A小鼠模型。然而，所描述的模型可根据不同的实验目标轻松替换。对于需要较长时间点的实验，例如涉及先天性和适应性免疫应答的研究，可采用侵袭性较低的同源癌细胞系（如K1491）。此外，对于不侧重于适应性肿瘤-宿主反应的实验，可在免疫缺陷小鼠模型中使用患者来源的细胞系或其他异种移植模型作为可行替代方案。对于感兴趣的读者，Haddad等（2021）对几种常用同种异体移植和异种移植胶质瘤小鼠模型的优势与局限性进行了全面综述。4另一种简单的修改方式是根据机构的可用资源和指南，将吸入式麻醉剂替换为注射类替代物，例如氯胺酮与赛拉嗪的组合 ± acepromazine。然而，当可使用吸入性麻醉剂及相关设备（即立体定位鼻罩）时，我们出于多个原因推荐使用后者。首先，我们认为吸入性麻醉剂更为安全，因其无需腹腔注射，无需在手术时间较长或操作较复杂时重复给药，且可在较宽的安全范围内轻松调节剂量18此外，吸入性麻醉剂无需使用管制药品，且在手术后可实现快速苏醒和恢复。

本方案的故障排除应较为简单，大多数问题源于注射技术不佳，导致肿瘤形成不规则或颅外生长。激光间质热疗（LITT）的靶向问题可通过准确定位解剖标志、妥善固定激光光纤，以及在插入过程中仔细观察激光光纤位置以确保其未触碰钻孔侧壁而发生偏移，从而予以纠正。

该方法的局限性包括：操作过程需要具备中等到高级别的外科及技术熟练度，需使用小动物磁共振成像仪等专用设备，以及正位移植流程耗时较长，这些因素均限制了单日内可完成的注射次数。由于本方案旨在建立高级别胶质瘤的临床前模型，因此也存在某些固有局限，例如某些胶质瘤细胞系（如CT2A）具有更强的侵袭性。通过采用低细胞数接种、在纹状体内进行深部注射、精细的注射技术以及早期治疗，有助于减轻这些问题，但仍可能出现偶发的颅外生长或不规则肿瘤生长，因此建议采用较短周期的实验设计。如前所述，使用侵袭性较低的细胞系对本方案进行修改也较为简便。

据我们所知，本实验方案是目前唯一一份关于胶质母细胞瘤激光间质热疗（LITT）的临床前小鼠模型的详细描述，对于建立完善的模型以推动未来基础科学研究具有重要意义。

披露

我们感谢Monteris Medical提供的支持，包括激光设备的实物捐赠。

致谢

本项目 funding 来源包括加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）-Alliance、Mitacs-Accelerate、曼尼托巴研究计划-IPOC、加拿大卫生研究院（CIHR）CGS-M 以及曼尼托巴大学研究生奖学金。CT2A 胶质瘤细胞系由美国北卡罗来纳州达勒姆市杜克大学的 Peter Fecci 博士慷慨提供。我们还要感谢曼尼托巴大学组织学服务实验室以及小型动物与材料成像核心设施在本项目中提供的出色技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
吸收性海绵棒FST18105-01止血海绵。
阿德森组织镊FST11006-12
C57BL/6 小鼠杰克逊实验室品系 #0006646 至 12 周龄的雄性和雌性
棉签（6"）电子显微镜科学公司72308
CT2A 胶质瘤细胞系由杜克大学 Peter Fecci 博士慷慨捐赠。
Cultrex 低生长因子基底膜提取物，PathClearBiotechne, R&D systems3433-010-01
DMEM/F-12，HEPESGibco, ThermoFisher Scientific11330032
双腔载玻片 BIO-RAD1450003
Eppendorf Safe-Lock 管（2.0 mL）Eppendorf22363352
无水乙醇Greenfield GlobalP016EAAN用 ddH2O 稀释至 70%
胎牛血清，经鉴定，加拿大来源Gibco, ThermoFisher Scientific12483020
Glad Press-n-Seal 塑料保鲜膜Amazon.ca12587704417
高速钻机Kopf Instruments型号 1474
K & J 热电偶温度计OmegaHH509R
美沙酮（美洛昔康）WDDC114424
微量注射泵WPIUMP3T-1
微升注射器（700 系列）Hamilton87908可提供定制针头。针尖斜面较陡有助于精确给药，较短的针头长度有助于提高稳定性。
持针器FST12500-12由于操作空间受限，细尖头最为合适，但也可根据手柄偏好选择多种类型。
Opixcare Plus 眼科软膏WDDC135941
磷酸盐缓冲液（10x）Fisher bioreagentsBP399-4用 ddH2O 稀释至 1x
聚维酮碘ThermoFisher Scientific3955-16分装至小管中，便于与带棉头的涂抹棒配合使用。
生理盐水（正常）WDDC126588
手术刀，一次性使用（#15 刀片）FeatherFeather NO15
精细手术剪FST91460-11精细学生剪、虹膜剪或 Bonn 剪均适用。
立体定位仪Kopf Instruments型号 940配备数字显示控制台、小鼠鼻锥和耳杆。
立体定位注射器固定架Kopf Instruments型号 1772-F若不使用注射泵时使用。
缝合线（5-0 单股）EthiconMCP463G紫色单股 Monocryl 缝线，带反向切割针尖
注射器，28 G （0.5 mL） BDBD 329461BD Lo-Dose U-100 胰岛素注射器
TC20 自动细胞计数仪BIO-RAD1450102
热电偶探头，细直径（K 型）OmegaTJM-CA316-IM025G-150
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红Gibco, ThermoFisher Scientific25200072
3M Vetbond 兽用组织胶 WDDC126125
Wahl Peanut 毛发修剪器WDDC/Wahl100963也可直接从制造商处购买。
加热垫Bensen Medical70308/121873任何类似产品均可使用。
Webcol 酒精消毒片电子显微镜科学公司71005-20酒精消毒擦拭片，双层，中等尺寸。

参考文献

  1. Canadian Cancer Society. Cancer Statistics 2023. , Canadian Cancer Statistics Advisory Committee in collaboration with the Canadian Cancer Society, Statistics Canada and the Public Health Agency of Canada. Toronto, ON. http://cancer.ca/Canadian-Cancer-Statistics-2023-EN (2023).
  2. Glioblastoma Research Organization. Glioblastoma Research Organization. , https://www.gbmresearch.org (2024).
  3. Carpentier, A., et al. Laser thermal therapy: Real-time MRI-guided and computer-controlled procedures for metastatic brain tumors. Lasers Surg Med. 43 (10), 943-950 (2011).
  4. Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neurooncol Adv. 3 (1), vdab100(2021).
  5. Chokshi, C. R., Savage, N., Venugopal, C., Singh, S. K. A patient-derived xenograft model of glioblastoma. STAR Protoc. 1 (3), 100179(2020).
  6. Alcaniz, J., et al. Clinically relevant glioblastoma patient-derived xenograft models to guide drug development and identify molecular signatures. Front Oncol. 13, 1129627(2023).
  7. Muir, M., et al. Laser interstitial thermal therapy for newly diagnosed glioblastoma. Lasers Med Sci. 37 (3), 1811-1820 (2022).
  8. Muir, M., Traylor, J. I., Gadot, R., Patel, R., Prabhu, S. S. Repeat laser interstitial thermal therapy for recurrent primary and metastatic intracranial tumors. Surg Neurol Int. 13, 311(2022).
  9. De Groot, J. F., et al. Efficacy of laser interstitial thermal therapy (LITT) for newly diagnosed and recurrent IDH wild-type glioblastoma. Neurooncol Adv. 4 (1), vdac040(2022).
  10. Holste, K. G., Orringer, D. A. Laser interstitial thermal therapy. Neurooncol Adv. 2 (1), vdz035(2020).
  11. Leuthardt, E. C., Voigt, J., Kim, A. H., Sylvester, P. A single-center cost analysis of treating primary and metastatic brain cancers with either brain laser interstitial thermal therapy (LITT) or craniotomy. Pharmacoecon Open. 1 (1), 53-63 (2017).
  12. Bastos, D. C. D. A., et al. Predictors of local control of brain metastasis treated with laser interstitial thermal therapy. Neurosurgery. 87 (1), 112-122 (2020).
  13. Darbinyan, A., Leelatian, N., Fomchenko, E. I. Histological changes associated with laser interstitial thermal therapy for radiation necrosis: illustrative cases. J Neurosurg Case Lessons. 4 (1), CASE21373(2022).
  14. Grant, G. A., Porter, B. E., Li, D., Barros Guinle, M. I., Kaur, H. Approach, complications, and outcomes for 37 consecutive pediatric patients undergoing laser ablation for medically refractory epilepsy at Stanford Children's Health. J Neurosurg Pediatr. 33 (1), 1-11 (2023).
  15. Ogasawara, C., et al. Laser interstitial thermal therapy for cerebral cavernous malformations: A systematic review of indications, safety, and outcomes. World Neurosurg. 166, 279-287.e1 (2022).
  16. Satzer, D., Mahavadi, A., Lacy, M., Grant, J. E., Warnke, P. Interstitial laser anterior capsulotomy for obsessive-compulsive disorder: lesion size and tractography correlate with outcome. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 93 (3), 317-323 (2022).
  17. Salehi, A., et al. Therapeutic enhancement of blood-brain and blood-tumor barriers permeability by laser interstitial thermal therapy. Neurooncol Adv. 2 (1), vdaa071(2020).
  18. Navarro, K. L., Huss, M., Smith, J. C., Sharp, P., Marx, J. O., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).

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