方法文章

基于流式细胞术的胰腺癌小鼠模型中肿瘤浸润淋巴细胞的分离和治疗评估

DOI：

10.3791/67413

⸱

2025年1月17日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pancreatic Cancer, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Key Laboratory of Digestive Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, 2Department of Immunology and Biotherapy, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, 3Research Core Facility, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 4Department of Public Laboratory, National Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy of Tianjin, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了一种通过流式细胞术利用小鼠肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL） 进行过继细胞转移的方法。该方案旨在验证 TILs 在同基因胰腺癌小鼠模型中对肿瘤的特异性细胞毒性，为胰腺癌过继细胞疗法的开发提供见解。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胰腺癌是一种侵袭性恶性肿瘤，预后不佳且治疗选择有限。过继细胞疗法涉及在重新输注之前分离和激活患者自身的免疫细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL），代表了一种很有前途的实验方法。然而，临床前胰腺癌模型中的过继细胞转移技术尚未完全确立。在这里，我们描述了使用来自同基因胰腺癌小鼠模型的 TIL 进行过继细胞治疗的详细方案。该程序包括将活的或辐照的小鼠胰腺癌细胞植入荧光标记的报告小鼠中以启动免疫细胞内流，然后通过流式细胞术分选和/或体外激活和扩增肿瘤反应性 T 细胞从原发性肿瘤中分离淋巴细胞，并将这些活化的 T 细胞过继地腹膜内转移到荷瘤小鼠中，然后进行白细胞介素 2 给药。生物发光肿瘤成像可以纵向监测原位肿瘤的生长和对治疗的反应，特别是评估肿瘤特异性细胞毒作用。这种方法概括了为胰腺癌患者开发过继细胞转移疗法所涉及的后勤工作。结果表明，与无关淋巴细胞对照相比，过继转移的肿瘤反应性 T 细胞的抗肿瘤疗效增强。这种多功能方法使胰腺癌过继免疫治疗的 体内 研究以及细胞加工参数和联合治疗方案的优化成为可能。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胰腺癌免疫疗法处于起步阶段，主要在小鼠模型中进行临床前探索和验证1。目前胰腺癌的治疗方法包括手术、化疗、放疗和靶向治疗。不幸的是，这些方法往往无法完全根除肿瘤病灶，导致复发和进展。传统治疗侧重于肿瘤细胞，但往往忽视肿瘤微环境 （TME），其中包括肿瘤细胞和由肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL）、成纤维细胞和细胞外基质组成的相关基质2。TIL 是 TME 中的免疫细胞，包括细胞毒性 T 细胞、辅助性 T 细胞、调节性 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、巨噬细胞和髓源性抑制细胞3。这些细胞参与影响肿瘤生长和治疗结果的免疫反应4。

过继细胞疗法 （ACT） 涉及收集患者的免疫细胞， 在体外对其进行修饰和扩增，然后重新引入它们以靶向和杀死肿瘤细胞。TIL 疗法是 ACT 的一种，正在研究用于治疗各种癌症，包括黑色素瘤、肺癌和宫颈癌。这个过程包括从肿瘤中分离淋巴细胞， 在体外用 IL-2 培养它们，然后将它们重新输注到患者体内，通常在淋巴细胞耗竭后进行化疗或放疗5。

自从 Rosenberg 1986 年的研究证明了 TILs 在小鼠中的疗效6 以来，过继细胞转移免疫疗法已成为研究热点，并在癌症治疗中显示出前景 7,8,9,10。我们的目标是从小鼠中提取 TIL，通过流式细胞术对它们进行特定 T 细胞分类，并通过过继转移验证它们的肿瘤杀伤作用。

在该协议中，我们描述了一种通过流式细胞术利用小鼠的 TIL 进行过继细胞转移的方法。目标是在同基因胰腺癌小鼠模型中验证 TILs 对肿瘤的特异性细胞毒性，为胰腺癌过继细胞疗法的开发提供见解。该方法包括将活的或辐照的小鼠胰腺癌细胞植入荧光标记的报告小鼠中以启动免疫细胞内流，通过流式细胞术分选从原发性肿瘤中分离淋巴细胞，或在 体外激活和扩增肿瘤反应性 T 细胞，并将这些活化的 T 细胞过继转移到荷瘤小鼠中。随后的白细胞介素 2 和生物发光肿瘤成像允许纵向监测原位肿瘤的生长和对治疗的反应，特别是评估肿瘤特异性细胞毒作用。这种方法概括了为胰腺癌患者开发过继细胞转移疗法所涉及的后勤工作。结果表明，与无关淋巴细胞对照相比，过继转移的肿瘤反应性 T 细胞的抗肿瘤疗效增强。这种多功能方法可用于胰腺癌过继免疫治疗的 体内 研究，以及细胞加工参数和联合治疗方案的优化。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

鼠群饲养在 AAALAC International 认可的设施中，符合所有相关的 USDA、HHS 和 NIH 法规和标准。天津医科大学肿瘤研究所和医院动物护理与使用委员会审查并批准了所有动物程序，包括菌株选择的基本原理、实验组分配以及动物数量和随机化的统计理由。

1. 肿瘤诱导

  1. 使用 KPC-Luc 细胞系11 诱导小鼠原位胰腺肿瘤。
  2. 通过胰蛋白酶消化 KPC-Luc 细胞，用 PBS 洗涤它们两次，然后以 1 x 106 个细胞/mL 的浓度在含有 30% 基底膜基质 （BMM） 的 PBS 中重悬它们来制备细胞悬液。
  3. 用 4% 的诱导剂量的异氟醚麻醉小鼠，然后改用 2% 的维持剂量。根据需要使用加热垫和监视器提供热支持。将眼药膏涂抹在双眼上以防止干燥。
  4. 使用碘基磨砂膏和酒精以圆周运动对手术区域进行多次消毒。手术前皮下注射卡洛芬 5 mg/kg 作为镇痛剂。使用无菌手术刀刀片，在小鼠左肋骨下方做一个小左腹切口 （0.5-1 cm） 以暴露胰腺。
  5. 用镊子夹住小鼠脾脏，露出小鼠胰腺，混合细胞后以每只小鼠 50,000 个细胞注入小鼠胰腺。使用 29 G 针头将 50 μL 细胞悬液直接注入胰腺。
  6. 返回小鼠胰腺并依次用缝合线缝合腹膜和皮肤。
  7. 让鼠标在温暖的垫子上恢复，直到完全唤醒。手术后每天皮下注射 5 mg/kg 卡洛芬作为镇痛剂，持续 3 天。
  8. 注射后 7 天进行实时成像以监测肿瘤生长。
    注意:可以在此步骤进行治疗。
    1. 腹膜内注射小鼠 D-荧光素钾盐（PBS 中 150 μg/mL，每只小鼠 60 μL）。
    2. 异氟醚麻醉后，将鼠标置于 体内 成像系统中进行生物发光检测。成像后，将鼠标从系统中取出，让它自然地从麻醉中恢复。

2. 收获肿瘤

  1. 使用 CO2 室对供体小鼠实施安乐死。用 75% 乙醇对全身消毒。
  2. 将鼠标放在无菌罩中。使用无菌剪刀和镊子打开腹腔。
  3. 取出肿瘤并将它们置于冰上的 PBS 中。用游标卡尺测量肿瘤大小，并使用公式 （π x 长度 × 宽度 × 宽度）/6 计算肿瘤体积。

3. 肿瘤消化

  1. 通过在 RPMI 1640 中制备 0.125 mg/ml 胶原酶、0.125 mg/ml 分散酶 II 和 10 ug/ml DNase I 作为 1x 浓度来制备消化溶液。在 12 孔板中每孔加入 1-2 mL 消化液。
  2. 用无菌剪刀将肿瘤切成小块。在 37°C 下消化肿瘤块，以 70 rpm 振荡 30 分钟。

4. 细胞采集

  1. 通过添加 2-4 mL 10% 胎牛血清终止消化。将所有细胞转移到收集管中。
  2. 用 PBS 洗涤孔两次以收集任何剩余的细胞。通过 40 μm 或 70 μm 细胞过滤器过滤细胞悬液。
  3. 通过在 4 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟来收集细胞。 将细胞重悬于 5% BSA 中用于流式细胞术染色。

5. 流式细胞术制备

  1. 从非荷瘤小鼠制备脾脏或外周血单核细胞 （PBMC） 作为对照。
    注:可选:来自荷瘤小鼠的 PBMC 也可用作对照。
  2. 用 Fc 阻滞剂（每百万个细胞 <1 μg）和流式抗体（CD3-APC、CD45-APC/Fire750，稀释度为 1:100）对细胞进行染色。
  3. 在黑暗中在冰上孵育 30 分钟。用冷 PBS 洗涤两次，并将细胞重悬于 PBS 中的 1% BSA 中。

6. 细胞分选

  1. 使用流式细胞仪对 CD45 + CD3 + 细胞进行分选。基于 FSC-A 和 SSC-A （P1） 的设门活细胞。然后，基于 FSC-A 和 FSC-H （P2） 从 P1 中设门单细胞。
  2. 最后，使用 CD45 和 CD3 门控从 P2 中分选 CD45+CD3+，并将它们收集到收集管中。确保在分选过程中正确重悬和维持细胞活力。

7. 用于转移的细胞制备

  1. 将分选的细胞在 4 °C 下以 400 x g 离心 5 分钟。 将细胞重悬于小鼠血清中，终浓度为 1 x 106 个细胞/mL。将细胞放在冰上。
    注:可以进行分选细胞的 离体 培养或活化。

8. 收养转移

  1. 在转移日前 7 天对受体小鼠进行肿瘤诱导。
  2. 使用 29 G x 1/2" 胰岛素注射器将每只小鼠腹膜内注射 2 x 105 个细胞到受体小鼠中。连续三天腹膜内给药 IL-2 （每只小鼠 50 IU）。

9. 肿瘤监测

  1. 在转移后第 4 天和第 7 天进行实时成像以评估肿瘤生长，并按照步骤 1.8 中描述的相同程序每周进行额外的实时成像。
  2. 跟进受体小鼠的存活情况。在实验结束时，如上所述对小鼠实施安乐死。使用眼用剪刀和镊子去除肿瘤，然后将它们放在冰上的 PBS 中以快速测量肿瘤大小，并可以根据需要继续后续实验。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

将受体小鼠分为七组以彻底评估TIL转移的功效:（a）盐水对照（空白对照）:接受盐水注射的小鼠作为基线。（b） 仅 IL-2（空白对照）:接受 IL-2 注射以解释单独细胞因子的任何影响的小鼠。（c） 与治疗过的供体小鼠相同的单一处理（阳性对照）:接受与供体小鼠相同的治疗的小鼠，以比较直接治疗与 TIL 转移。（d） 来自 IL-2 对照供体的 TIL（阴性对照）:评估来自未经治疗的肿瘤的 TIL 的效果。（e） 来自 IL-2 对照供体的 PBMC（阴性对照）:比较外周血细胞与 TIL 的效果。（f） 来自 IL-2 处理过的供体的 TIL（治疗有效）:评估来自处理过的供体的 TIL 疗效的主要实验组。（g） 来自用 IL-2 处理的供体的 PBMC（非特异性细胞毒性的对照）:评估来自处理小鼠的全身免疫细胞是否具有抗肿瘤作用。

代表性结果证明了 TIL 分离和转移技术的有效性。在 F 组中观察到肿瘤生长显着减少和荷瘤宿主存活率增加，小鼠接受来自 IL-...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胰腺癌的潜在免疫疗法可以增强免疫系统以靶向和消除肿瘤细胞，包括过继免疫疗法、免疫检查点抑制剂和肿瘤疫苗12。TIL 疗法从肿瘤中提取和扩增淋巴细胞，然后将其重新输注到患者体内。与其他过继细胞疗法相比，TIL 疗法具有多样化的 TCR 克隆性、卓越的肿瘤归巢能力和低脱靶毒性，使其有利于治疗实体瘤13。

Rosenberg6 及其同事从小鼠中分离出 TIL，在体外用 IL-2 扩增它们，并将它们重新输注到转移性黑色素瘤宿主中，显示出显着的抗肿瘤反应。这一成功刺激了针对各种实体瘤的进一步 TIL 相关临床试验。然而，TIL 疗法在实体瘤中的疗效和稳定性需要提高，如多项临床试验所示 9,13。研究人员继续提高 TIL 的治疗效果。这里演示的研究侧重...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者已声明他们没有利益冲突。在使用 ChatGPT 和 Claude-3 进行语言编辑的同时，作者仔细审查和验证了 ChatGPT 或 Claude-3 生成的单词和句子，然后再将它们包含在文章中。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究由中国国家自然科学基金 （NSFC） 资助，资助号为 82272767 和 Y.M.82072691。作者感谢团队成员的讨论与合作。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物发光成像系统PerkinElmerIVIS Spectrum用于监测肿瘤生长
血清 白蛋白 VSolarbioA8020用于细胞重悬
细胞过滤器（40 &μ;m 或 70 μm）JetCSS013040用于过滤细胞悬液
离心机Eppendorf5810R用于细胞收集和制备
CO2 室天津立良N/A用于安乐死小鼠
胶原酶Sigma-AldrichC5138用于消化液
CD3-APC 抗体Biolegend100236用于流式细胞术染色
CD45-APC/Fire750 抗体Biolegend100154用于流式细胞术染色
C57BL/6 白化小鼠Jackson Laboratory58供体和受体小鼠
Dispase IIGibco17105-041用于消化液
DNase ISparkJadeAC1711用于消化液
D-荧光素钾盐BeyotimeST198-10g用于实时成像
乙醇 （75%）N/A用于灭菌
Fc 阻滞剂BD Biosciences 553142用于流式细胞术染色
胎牛血清GibcoA5669701用于细胞培养
流式细胞仪BD BiosciencesFACSAria III用于细胞分选
IL-2（白细胞介素-2）PeproTech200-02用于转移后给药
氟醚山东Ante N/A用于麻醉
KPC-Luc 细胞系PI 实验室生成N/A用于诱导原位胰腺肿瘤
Matrigel 基质康宁356234用于原位植入
PBS（磷酸盐缓冲盐水）ServicebioG4207-500ML用于洗涤和重悬细胞
RPMI 1640 培养基Gibco11875093用于制备消化液
无菌罩ESCON/A用于无菌肿瘤提取和处理
无菌剪刀和镊子N/A用于肿瘤提取
缝合线（4-0，PGA 可吸收缝合线）金环医疗R413用于伤口闭合
注射器江西枫林1 mL 0.45 & 次 16RWLB注射
用 组织培养板 12 孔喷射TCP001012用于肿瘤消化
牛异

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, Y., et al. Combination of PD-1 inhibitor and OX40 agonist induces tumor rejection and immune memory in mouse models of pancreatic cancer. Gastroenterology. 159 (1), 306-319.e12 (2020).
  2. Pitt, J. M., et al. Targeting the tumor microenvironment: Removing obstruction to anticancer immune responses and immunotherapy. Ann Oncol. 27 (8), 1482-1492 (2016).
  3. Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: Understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell Mol Immunol. 17 (8), 807-821 (2020).
  4. Tay, C., Tanaka, A., Sakaguchi, S. Tumor-infiltrating regulatory t cells as targets of cancer immunotherapy. Cancer Cell. 41 (3), 450-465 (2023).
  5. Betof Warner, A., et al. Expert consensus guidelines on management and best practices for tumor-infiltrating lymphocyte cell therapy. J Immunother Cancer. 2 (2), e008735(2024).
  6. Rosenberg, S. A., Spiess, P., Lafreniere, R. A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science. 233 (4770), 1318-1321 (1986).
  7. Leidner, R., et al. Neoantigen t-cell receptor gene therapy in pancreatic cancer. N Engl J Med. 386 (22), 2112-2119 (2022).
  8. Lowery, F. J., et al. Molecular signatures of antitumor neoantigen-reactive t cells from metastatic human cancers. Science (New York, N.Y.). 375 (6583), 877-884 (2022).
  9. Rosenberg, S. A., Parkhurst, M. R., Robbins, P. F. Adoptive cell transfer immunotherapy for patients with solid epithelial cancers. Cancer Cell. 41 (4), 646-648 (2023).
  10. Yossef, R., et al. Phenotypic signatures of circulating neoantigen-reactive cd8+ t cells in patients with metastatic cancers. Cancer Cell. 41 (12), 2154-2165.e5 (2023).
  11. Ma, Y., Hwang, R. F., Logsdon, C. D., Ullrich, S. E. Dynamic mast cell-stromal cell interactions promote growth of pancreatic cancer. Cancer Res. 73 (13), 3927-3937 (2013).
  12. Mahadevan, K. K., et al. Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer. Science. 384 (6703), eadh4567(2024).
  13. Mullard, A. FDA approves first tumour-infiltrating lymphocyte (til) therapy, bolstering hopes for cell therapies in solid cancers. Nat Rev Drug Discov. 23 (4), 238(2024).
  14. Morotti, M., et al. PGE2 inhibits til expansion by disrupting IL-2 signalling and mitochondrial function. Nature. 629 (8011), 426-434 (2024).
  15. Chupp, D. P., et al. A humanized mouse that mounts mature class-switched, hypermutated and neutralizing antibody responses. Nat Immunol. 25 (8), 1489-1506 (2024).
  16. Stress response in tumor-infiltrating T cells is linked to immunotherapy resistance. Nat Med. 29 (6), 1336-1337 (2023).
  17. Wang, A. Z., et al. Glioblastoma-infiltrating CD8+ T cells are predominantly a clonally expanded GZMK+ effector population. Cancer Discov. 14 (6), 1106-1131 (2024).
  18. Chen, Y., et al. A transformable supramolecular bispecific cell engager for augmenting natural killer and t cell-based cancer immunotherapy. Adv Mater. 36 (3), e2306736(2024).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Adoptive Cell TherapyPancreatic Cancer ModelTIL IsolationTumor Reactive T CellsBioluminescent ImagingCell SortingInterleukin 2 AdministrationOrthotopic Tumor

相关文章