我们描述了一种利用流式细胞术从小鼠肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中分离细胞并进行过继性细胞转移的方法。该方案旨在验证TILs在同基因型胰腺癌小鼠模型中对肿瘤的特异性细胞毒性，为胰腺癌的过继性细胞治疗开发提供依据。
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摘要
摘要
胰腺癌是一种侵袭性强、预后极差且治疗选择有限的恶性肿瘤。过继性细胞治疗作为一种有前景的实验性方法，涉及分离并激活患者自身的免疫细胞（如肿瘤浸润性淋巴细胞，TILs），再将其回输至体内。然而，在临床前胰腺癌模型中，过继性细胞治疗的技术尚未得到良好建立。本文介绍了一种利用同源性胰腺癌小鼠模型中TILs进行过继性细胞治疗的详细方案。该操作包括将活体或经辐照的小鼠胰腺癌细胞植入荧光标记的报告基因小鼠体内，以诱导免疫细胞浸润；随后通过流式细胞术分选从原发肿瘤中分离淋巴细胞，并/或激活与扩增肿瘤反应性T细胞。 离体并将这些激活的T细胞过继性地腹腔转移至荷瘤小鼠体内，随后给予白细胞介素-2。 生物发光肿瘤成像技术可实现对原位肿瘤生长及其治疗反应的长期监测，尤其适用于评估肿瘤特异性的细胞毒性效应。该方法重现了开发针对胰腺癌患者过继性细胞转移疗法所涉及的技术流程。实验结果表明，与无关淋巴细胞对照组相比，过继转移的肿瘤反应性T细胞具有更强的抗肿瘤效果。这一多功能方法可实现对 体内 胰腺癌的过继性免疫治疗研究，以及细胞处理参数和联合治疗方案的优化。
引言
胰腺癌的免疫治疗尚处于初期阶段，目前主要在小鼠模型中进行持续的临床前探索与验证1。当前胰腺癌的治疗方法包括手术、化疗、放疗和靶向治疗。然而，这些方法往往无法彻底清除肿瘤病灶，导致肿瘤复发和进展。传统治疗主要针对肿瘤细胞，却常常忽视肿瘤微环境（TME），而TME不仅包含肿瘤细胞，还包括由肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）、成纤维细胞和细胞外基质组成的相关间质2。TILs是存在于TME中的免疫细胞，包括细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞以及髓源性抑制细胞3。这些细胞参与调控免疫反应，影响肿瘤的生长及治疗效果4。
过继性细胞治疗（ACT）涉及收集患者的免疫细胞，对其进行修饰和扩增 体外，然后重新引入体内以靶向并杀伤肿瘤细胞。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗是一种过继性细胞疗法（ACT），目前正被研究用于治疗多种癌症，包括黑色素瘤、肺癌和宫颈癌。该过程包括从肿瘤组织中分离淋巴细胞，并在体外用IL-2进行培养 体外，并在化疗或放疗进行淋巴细胞清除后，将其重新输注回患者体内5.
自从 Rosenberg 于 1986 年的....
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方案
小鼠群体饲养于经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC International）认证的设施中，严格遵守所有相关的美国农业部（USDA）、美国卫生与公共服务部（HHS）以及美国国立卫生研究院（NIH）的法规与标准。天津医科大学肿瘤研究所和医院动物护理与使用委员会已审查并批准了所有动物实验操作，包括品系选择的依据、实验分组安排，以及动物数量和随机化方案的统计学依据。
1. 肿瘤诱导
- 使用 KPC-Luc 细胞系11 在小鼠体内诱导原位胰腺肿瘤。
- 通过胰酶消化KPC-Luc细胞，用PBS洗涤两次，重悬于浓度为1 x 10⁶个/mL的细胞悬液6 细胞/mL，溶于含30%基底膜基质（BMM）的PBS中。
- 使用异氟烷以4%的诱导剂量对小鼠进行麻醉，随后切换至2%的维持剂量。使用加热垫提供保温，并根据需要进行监测。在两只眼睛上涂抹眼用软膏以防止干燥。
- 使用碘伏和酒精以环形方式多次消毒手术区域。术前给予5 mg/kg剂量的卡洛芬皮下注射以镇痛。使用无菌手术刀片，在小鼠左侧肋骨下方做一小型左腹部切口（0.5–1 cm），暴露胰腺。
- 用镊子夹住小鼠脾脏以暴露小鼠胰腺，将细胞混匀后注入小鼠胰腺，每只小鼠注射50,000个细胞。使用29 G针头将50 µL细胞悬液直接注射入胰腺。
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结果
为全面评估肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）转移的疗效，受体小鼠被分为七组：（a）生理盐水对照（空白对照）：接受生理盐水注射的小鼠，作为基线对照。（b）仅注射IL-2（空白对照）：接受IL-2注射的小鼠，用于评估该细胞因子单独作用的影响。（c）与供体治疗组小鼠相同的单一治疗（阳性对照）：接受与供体小鼠相同治疗的小鼠，用于比较直接治疗与TIL转移的效果。（d）来自对照组供体的TIL联合IL-2（阴性对照）：用于评估来自未经治疗肿瘤的TIL的作用效果。（e）来自对照组供体的外周血单个核细胞（PBMC）联合IL-2（阴性对照）：用于比较外周血细胞与TIL的作用差异。（f）来自治疗组供体的TIL联合IL-2（治疗有效组）：主要实验组，用于评估来自治疗组供体的TIL的疗效。（g）来自治疗组供体的PBMC联合IL-2（非特异性细胞毒性对照）：用于评估经治疗小鼠的全身免疫细胞是否具有抗肿瘤效应。
代表性结果表明，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）分离与过继转移技术具有显著疗效。在接.......
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讨论
针对胰腺癌的潜在免疫疗法可能通过增强免疫系统来靶向并清除肿瘤细胞，包括过继性免疫疗法、免疫检查点抑制剂和肿瘤疫苗12。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法从肿瘤组织中提取淋巴细胞并进行扩增，随后将其回输给患者。与其他过继性细胞疗法相比，TIL疗法具有多样化的T细胞受体克隆性、更强的肿瘤归巢能力以及较低的脱靶毒性，因此在治疗实体瘤方面具有优势13。
Rosenberg6 和同事从小鼠中分离出肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs），并用IL-2进行扩增 体外，并将其回输至转移性黑色素瘤患者体内，显示出显著的抗肿瘤反应。这一成功推动了TIL相关临床试验在多种实体瘤中的进一步开展。然而，多项临床试验表明，TIL疗法在实体瘤中的疗效和稳定性仍需提高。9,13研究人员正在不断改进TIL治疗效果。本研究聚焦于胰腺癌，旨在通过小鼠实验为.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。在使用 ChatGPT 和 Claude-3 进行语言润色时，作者在将 ChatGPT 或 Claude-3 生成的词句纳入文章之前，已对其内容进行了仔细审阅和验证。
致谢
本研究由国家自然科学基金（NSFC）资助，资助编号为82272767和82072691，授予Y.M.。作者感谢团队成员的讨论与合作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物发光成像系统 | PerkinElmer | IVIS Spectrum | 用于监测肿瘤生长 |
| 牛血清白蛋白 V | Solarbio | A8020 | 用于细胞重悬 |
| 细胞筛（40 μm 或 70 μm） | Jet | CSS013040 | 用于过滤细胞悬液 |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R | 用于细胞收集与制备 |
| CO2 安乐死舱 | 天津利良 | N/A | 用于小鼠安乐死 |
| 胶原酶 | Sigma-Aldrich | C5138 | 用于消化液配制 |
| CD3-APC 抗体 | Biolegend | 100236 | 用于流式细胞术染色 |
| CD45-APC/Fire750 抗体 | Biolegend | 100154 | 用于流式细胞术染色 |
| C57BL/6 白化小鼠 | Jackson Laboratory | 58 | 供体与受体小鼠 |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | 用于消化液配制 |
| DNase I | SparkJade | AC1711 | 用于消化液配制 |
| D-荧光素钾盐 | 碧云天 | ST198-10g | 用于活体成像 |
| 乙醇（75%） | N/A | 用于消毒灭菌 | |
| Fc 阻断剂 | BD Biosciences | 553142 | 用于流式细胞术染色 |
| 胎牛血清 | Gibco | A5669701 | 用于细胞培养 |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | FACSAria III | 用于细胞分选 |
| IL-2（白细胞介素-2） | PeproTech | 200-02 | 用于细胞回输后给药 |
| 异氟烷 | 山东安特 | N/A | 用于麻醉 |
| KPC-Luc 细胞系 | PI 实验室构建 | N/A | 用于诱导原位胰腺肿瘤 |
| Matrigel 基质胶 | Corning | 356234 | 用于原位移植 |
| PBS（磷酸盐缓冲液） | Servicebio | G4207-500ML | 用于洗涤和重悬细胞 |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | 11875093 | 用于配制消化液 |
| 无菌操作台 | ESCO | N/A | 用于无菌肿瘤提取与处理 |
| 无菌剪刀和镊子 | N/A | 用于肿瘤取出 | |
| 缝合线（4-0，PGA 可吸收缝线） | 金环医疗 | R413 | 用于伤口闭合 |
| 注射器 | 江西丰林 | 1 mL 0.45 × 16RWLB | 用于注射 |
| 12 孔组织培养板 | Jet | TCP001012 | 用于肿瘤消化 |
参考文献
- Ma, Y., et al. Combination of PD-1 inhibitor and OX40 agonist induces tumor rejection and immune memory in mouse models of pancreatic cancer. Gastroenterology. 159 (1), 306-319.e12 (2020).
- Pitt, J. M., et al.
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重印与许可
