小体积腔室中的高分辨率呼吸测定法

Elettra Leo; Lucie Rychtarova; Luiz F. Garcia-Souza; Eleonor Åsander Frostner; Eskil Elmér; Erich Gnaiger

doi:10.3791/67442

方法文章

小体积腔室中的高分辨率呼吸测定法

DOI：

10.3791/67442

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2025年7月25日

Elettra Leo¹ , Lucie Rychtarova¹^,² , Luiz F. Garcia-Souza¹^,³ , Eleonor Åsander Frostner⁴^,⁵ , Eskil Elmér⁴^,⁵ , Erich Gnaiger¹

¹Oroboros Instruments, ²Department of Pediatrics and Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University and General Hospital in Prague, ³Institute of Pathophysiology, Medical University of Innsbruck, ⁴Mitochondrial Medicine, Department of Clinical Sciences, Lund University, ⁵Abliva AB

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文表明，如果进行了适当的仪器O₂背景校正，0.5 mL高分辨率呼吸测量室所获得的结果与2.0 mL呼吸室的结果具有一致性。该方法所需样品量更少，对于样品来源有限或呼吸活性较低的研究具有优势。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

研究呼吸通量对于理解代谢过程之间复杂的相互作用至关重要。对于样本量有限且呼吸速率较低的细胞和组织研究，采用较小的实验体积可能更具优势。我们考察了在使用Oroboros进行高分辨率呼吸测定、样品浓度相同的情况下，0.5 mL反应室是否能获得与2.0 mL反应室一致的结果。背景氧₂ 在空气饱和条件下，0.5 mL chamber 中的通量比 2.0 mL chamber 高 4 倍，但结果可重复，允许进行准确的背景校正。0.5 mL chamber 的最佳搅拌速度为每分钟 550 至 750 转（rpm）。在 0.5 mL 和 2.0 mL chamber 中平行测定了活细胞、透化细胞和分离线粒体的呼吸通量。使用底物-解偶联剂-抑制剂滴定法，进行14至20次滴定。O₂ 不同条件下的通量在检测限范围内，腔室类型相同。0.5 mL 腔室所需样本量比2.0 mL腔室少近四倍，对于样本量有限或呼吸能力较低的研究具有显著优势。

引言

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研究线粒体呼吸途径对于揭示各种疾病、衰老或应激反应背后的代谢机制至关重要，从而为治疗干预提供潜在靶点，并提升诊断能力¹^,²^,³。高分辨率呼吸测定法（HRR）能够对多种样本类型和制备条件下氧化磷酸化（OXPHOS）中的线粒体通路控制和偶联控制进行详细分析⁴。实验腔室的体积是呼吸测定仪器的一项基本设计特征。Oroboros仪器先前确定的腔室体积为2.0 mL。该体积经过优化，可确保仪器背景氧（O₂）通量较低，并保证搅拌介质的均一性。这些是准确测量低氧条件和高氧条件下呼吸速率的关键质量标准，分别适用于线粒体氧动力学和透化肌纤维实验⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹。此外，多种多传感器插入装置¹⁰也需要占用2.0 mL腔室的空间（表 1）。

在本研究中，我们探讨了将高分辨率呼吸测定法（HRR）的腔室体积从2.0 mL减少至0.5 mL的可行性。在较小的腔室内进行呼吸测定实验时，是否可以使用较少的细胞数量或组织量，同时不降低检测的准确性？明确这一问题对于研究人体组织和液体活检样本、原代细胞以及生长缓慢的细胞培养物具有重要意义¹同样，对于研究线粒体功能缺陷且呼吸活性较低的样品，减小反应室体积可能具有优势。¹¹ 以及固有容量较低的线粒体通路，例如大脑中的脂肪酸氧化¹²然而，由于O的伪影随腔室尺寸减小而 disproportionately 增加，分辨率可能会降低₂ 倒扩散与不准确的体积校准¹³^,¹⁴因此，我们分析了Oroboros仪器的性能表现使用小体积室（sV) 校准至最小实验体积为 0.5 mL，相较于传统体积腔室（cV) 校准至2.0 mL。特别地，我们分析了仪器背景O₂流速与最佳搅拌速度。

底物-解偶联剂-抑制剂滴定（SUIT）方案用于评估氧化磷酸化（OXPHOS）分析中的呼吸速率和呼吸状态。SUIT方案在每次呼吸测定实验中包含14至20次滴定，涉及的氧通量（O₂）范围从每秒每毫升几皮摩尔（pmol∙s^-¹∙mL^-¹）到数百皮摩尔（pmol∙s^-¹∙mL^-¹）不等。偶联控制状态包括漏呼吸率 L，即呼吸中以耗散形式存在的组分，无法用于将腺苷-5'-二磷酸（ADP）磷酸化为腺苷-5'-三磷酸（ATP），其来源包括质子漏、质子滑移、阳离子循环和电子漏。OXPHOS容量 P 指在存在ADP的条件下，电子传递（以O₂消耗（氧化）来测量）与ATP合成（磷酸化）相偶联时线粒体的呼吸能力。解偶联状态下的电子传递容量 E 通过在存在线粒体底物的条件下滴加质子载体（protonophore）进行定量测定¹⁵。残余氧消耗 rox 则在加入复合体I和复合体III抑制剂鱼藤酮（rotenone）和抗霉素A（antimycin A）后测定。

我们在sV和cV室中测量了细胞和线粒体分离物的呼吸作用。血小板是巨核细胞的无核细胞质碎片，是易于获取的人类线粒体来源。因此，血小板被用作具有完整质膜的活细胞（或细胞颗粒）的模型。血细胞的呼吸作用可作为系统性线粒体疾病的生物标志物，并与代谢活跃器官的生物能量健康状况相关¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹，尽管这些发现尚不能普遍化²⁰^,²¹^,²²。人成纤维细胞被选为线粒体功能障碍的细胞模型¹^,²³^,²⁴^,²⁵。质膜的完整性对细胞存活至关重要，但其选择性通透化可允许细胞质与周围介质之间的分子交换。因此，化学法通透化质膜的成纤维细胞被作为通透化细胞的示例进行研究，而分离的线粒体则用于评估线粒体功能，并可用于分离不同的线粒体亚群²⁶^,²⁷。

方案

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在人类血小板研究中，八名志愿者签署了书面知情同意书，同意参与本研究，该研究已获得瑞典伦理审查局批准（编号：2013/181）。两株来自男性新生儿的人类皮肤成纤维细胞系购自ATCC，并根据捷克共和国卫生部的伦理批准（项目编号：AZV MZ CR NU22-07-00474）进行使用。涉及小鼠的实验操作均依照奥地利动物实验法以及《欧洲用于实验和其他科学目的的脊椎动物保护公约》进行（Tierversuchsgesetz 2012；指令 2010/63/EU；BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016）。实验中遵循3R原则，以尽量减少实验动物的使用数量。

1. 体积校准

将小体积 chamber（sV）或经典体积 chamber（cV）安装到 Oroboros 上（图 1A、B；表 1）。
开启 Oroboros 并连接至 DatLab。
干燥 chamber。
用移液器向 sV 中加入 0.54 mL H₂O（0.50 mL 有效实验体积 + 0.04 mL 毛细管死体积），或向 cV 中加入 2.07 mL H₂O（2.00 mL 有效体积 + 0.07 mL 毛细管死体积）。
注意：为避免液体在玻璃筒顶部与聚甲醛（POM）chamber 支架之间流失，应将移液器吸头插入足够深度，使其接触玻璃 chamber 的壁面。
开启搅拌器。
在关闭 chamber 前，润湿密封塞的 O 型圈，同时保持其毛细管部分干燥。松开体积校准环，将密封塞向下插入，直至液体充满密封塞的毛细管，并在毛细管顶端的接收腔处出现一小滴液体（表 1）。
拧紧体积校准环以固定其位置，确保在后续多次插入密封塞时均可获得校准后的体积。

2. Oroboros 通用设置

开始 DatLab 软件
设置 实验温度 （37 °C）和 搅拌转速 在 550 转/分钟 （9.2 Hz 或每秒转数）在腔室中V 或 750 rpm (12.5 Hz) 在 Chamber c 中V. 设置 数据采样间隔 在 2 秒 与 平滑处理 结束 80 s （40 个数据点）在仪器 O 中₂ 背景测试或 40 s （20 个数据点）用于呼吸测定。
注意：磁力搅拌子（AlNiCo 表面包覆聚偏二氟乙烯 [PVDF]）；表1由腔室内搅拌器水平处强度为3.5 mT的脉冲旋转磁场驱动。
进行空气校准²⁸ 在MiR05或后续实验所用的相同孵育培养基中。
偶尔进行零氧校准，但切勿在开始实验前立即进行。
1. 通过溶解 O 制备新鲜的连二亚硫酸钠（Na-dithionite）储备液₂- 将Zero粉末溶于50 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.0）中，配制成2.5 mM或10 mM浓度，用于sV 或 cV 分别
2. 过量滴定连二亚硫酸钠，以获得在 O 点的原始信号 R0 或零电流 [µA]₂浓度 0 µM¹⁴^,²⁸.

3. 仪器 O₂ 背景测试

室V
1. 空气校准后，关闭腔室。监测氧气信号约60分钟，直至O₂₂浓度从空气饱和状态下降至约 150 µM。设置四个标记 J°₁ 到 J°₄在图 'O 上₂ 斜率负值
  注意：请执行此仪器操作₂ 每天开始实验前进行背景测试。
2. 可选：使用 Hamilton 注射器，滴加按步骤 2.4.1 制备的连二亚硫酸钠溶液，以达到所需的 O₂ 100 µM 浓度（图1C).
  注意：在另一项实验方案中，使用滴定注射微泵（TIP2k）将连二亚硫酸钠滴加到反应室中。 补充图1 和 补充图2）与标准方法测定仪器本底O进行比较₂ 通量²⁸.
腔室 cV
1. 空气校准后，关闭腔室，等待 O₂斜率，并设置 J°₁ 在图上标记“O2 斜率负值”²⁸使用 Hamilton 注射器，按照 2.4.1 步骤制备的 Na-连二亚硫酸盐，以 0.7 µL 为步长逐次滴定，以匹配 Chamber 的氧气环境V 并降低 O₂ 浓度至150 µM。
2. 再加入一步连二亚硫酸钠滴定（约 7 µL），以降低 O₂ 浓度至 100 µM（图1D).
仪器 O₂ 背景数据分析
1. 计算仪器的O₂ DatLab 中的背景斜率²⁸选择 通量/斜率 从顶部菜单。
2. 打开 O₂ 背景校正 窗口。选择 活动文件 作为O的来源₂背景并选择 J° 标记 用于线性回归的计算。应用 O₂ 背景校正。

使用0.5 mL和2.0 mL腔室的氧气测量装置。图表显示O₂斜率及浓度变化。
图1：小体积（sV）和经典体积（cV）腔室及仪器O₂本底测试。（A）sV腔室。（B）cV腔室。（C）斜率为负及J°₁标记的代表性曲线，sV（0.5 mL；绿色）和cV（2.0 mL；蓝色）。（D）相应的氧浓度及R1标记。三次手动滴加连二亚硫酸钠（约0.7 µL，10 mM母液；cV），以及最终分别向sV和cV腔室滴加7.0 µL的2.5 mM和10 mM母液。滴加引起的峰已消除。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 将样品加入 Oroboros 反应室

注意：样本可通过两种方法加入腔室：部分体积置换法（本研究中的血小板和成纤维细胞）或完全体积置换法（本研究中的分离线粒体）。

部分体积置换
1. 移除完全插入的塞子。用移液器吸出并弃去体积为 V_out 的 MiR05。对于血小板，V_out 为 60–70 µL；对于成纤维细胞，为 80–150 µL，具体数值根据储备细胞悬液中的细胞浓度计算确定。
2. 用移液器将等体积 V_J._i 的储备细胞悬液（已知细胞浓度）加入氧电极室中，该体积与 V_out 相等（图 2）。
3. 根据实际体积 V'（0.54 mL 和 2.07 mL）计算实验中的细胞浓度，该体积大于有效实验体积 V（0.5 mL 和 2.0 mL）。
  注：储备细胞悬液的浓度和实验细胞浓度应预先设计，以确保 V_J._i = V_out 的体积值可将滴定误差控制在较小范围内。在血小板实验中，sV 室使用了一种原型塞子，其毛细管死体积为 0.05 mL。
完全体积置换
1. 用虹吸法将室内的全部培养基吸出，并分别向 sV 或 cV 室中加入至少 0.54 mL 或 2.07 mL 含实验样品浓度的分离线粒体储备液。
2. 关闭反应室，再从塞子接收腔中虹吸除去多余的线粒体储备液。
  注：完全体积置换可避免通过 Hamilton 注射器经塞子毛细管向密闭室中滴加样品时可能引起的线粒体浓度变异。后一种方法适用于由高浓度储备悬液制备的小体积样品（例如分离的线粒体）；然而，该方法会使脆弱细胞暴露于 Hamilton 注射器长 51 mm、内径 0.41 mm 的针头所产生的剪切力下，可能导致细胞质膜受损。通过移除塞子并采用部分或完全体积置换的方式用移液器将样品加入反应室，可避免上述问题。本研究共分析了三种类型的线粒体制剂。样品制备方法详见 补充文件 1¹^,²⁶^,²⁹^,³⁰。
活细胞：人血小板
1. 将含有血小板的冻存管插入 37 °C 水浴中，缓慢融化至仅剩少量冰晶。
2. 打开冻存管，缓慢逐滴加入 1 mL 预热培养基（DPBS + 10 mM EGTA，37 °C）。
3. 轻轻混匀血小板，转移至 50 mL 离心管中，总体积为 10 mL 预热培养基（DPBS + 10 mM EGTA，37 °C）。使用摆动转子在室温（RT）下以 1000 g 离心 10 分钟（加速度 6，刹车 2）。
4. 将血小板重悬于 0.25 mL DPBS + 10 mM EGTA（室温）中，通过部分体积置换加入反应室，使 0.5-mL 室的初始实验细胞浓度范围为 157 × 10⁶ 至 210 × 10⁶ x·mL^-¹，2.0-mL 室的浓度范围为 164 × 10⁶ 至 220 × 10⁶ x·mL^-¹（有关基本单位 x 的详细信息参见³¹）。
  注：一台 Oroboros 仪器在 A 和 B 位置分别装配 sV 和 cV 室，与另一台在 B 和 A 位置分别装配 sV 和 cV 室的 Oroboros 仪器并行使用。
透化细胞：人成纤维细胞
1. 通过部分体积置换将细胞加入 Oroboros 反应室，名义细胞浓度为 0.75 × 10⁶ x·mL^-¹（两种反应室类型均适用），并计算实际浓度（步骤 4.1.3）。
  注：并行使用了多台不同的 Oroboros 仪器，每台仪器配备 sV 或 cV 反应室之一。
分离线粒体：小鼠心脏
1. 将 15 µL 线粒体悬液加入 5985 µL 线粒体呼吸介质（MiR05）中，得到线粒体蛋白储备浓度范围为 0.013–0.026 mg∙mL^-¹。
2. 通过完全体积置换将线粒体悬液加入 Oroboros 反应室中。
  注：一台 Oroboros 仪器在 A 和 B 位置分别装配 sV 和 cV 室，与另一台在 B 和 A 位置分别装配 sV 和 cV 室的 Oroboros 仪器并行使用。

Oxygen transport process diagram with capillary system and volume equations for fluid dynamics study.
图2通过部分体积置换添加细胞悬液。 (A0.5 mL 反应室中的添加步骤V 和（B2.0 mL 室V. (1密闭腔室，内含呼吸介质体积 V 并填充带塞毛细管 V_stc，用于测量仪器本底O₂通量 J_O_₂°. (2移除塞子， V_stc 流入腔室，形成总体积 V'= V+V_stc. (3部分去除培养基 V_出 = -V_J_.i. 体积 V''= V'+V_出留在室内的。 (4移液取体积子样本 V_J_.i 将呼吸测定用储备细胞悬液注入腔室，最终达到总体积 V^# = V+V_stc 稀释后的细胞悬液。5) 带填充塞毛细管的密闭室（死体积） V_stc用于测定体积特异性氧消耗率₂ 通量 J_V_，O_₂ 在实验体积中 V此图已根据 图2A 细胞计数与HRR中的归一化⁴¹. 请点击此处以查看此图的放大版本。

5. SUIT 实验方案

使用 Hamilton 微量注射器将 补充表 1 中所列化学品的储备溶液滴加到腔室中，调整滴加体积，以在 sV 和 cV 腔室中获得相同的实验浓度（参见图 6、图 8 和图 10 的图注）。
选择实验方案 SUIT-003_D018³²^,³³（本研究中用于血小板）。
选择实验方案 SUIT-001_D004⁴^,¹⁵^,³⁴^,³⁵ 和 SUIT-002_D007⁴^,¹⁵^,³⁵^,³⁶（本研究中用于成纤维细胞）。
选择实验方案 SUIT-002_D005⁴^,¹⁵^,³⁵^,³⁷（本研究中用于分离的线粒体）。

6. SUIT 数据分析

在 DatLab 中设置标记，以定义所选图表的各个区段。
在顶部菜单中选择通量/斜率，打开通量/斜率窗口。应用滴定体积校正，以校正 SUIT 方案中每次滴定对悬浮样品造成的稀释效应。
从顶部菜单中选择标记，打开标记统计，显示经减去残余氧消耗（rox）进行基线校正后的标记数据点的中位数。
使用电子表格软件，通过反向回归分析²⁵^,²⁸，计算 sV 和 cV 腔室中成对结果之间的截距和斜率。
使用软件 jamovi 2.3.13³⁸ 对 sV 和 cV 腔室中 rox 状态（最低 O₂ 通量）下的呼吸速率进行配对样本 t 检验。
注意：由于 Oroboros 仪器中的两个腔室在功能上相互独立（温度和 DatLab 记录间隔除外），每个腔室的测量可视为独立进行，类似于使用不同的仪器。最终结果可报告为多个腔室结果的中位数或平均值，并附上其变异性的相关信息。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

氧传感器（POS）的原始信号 R1 [µA] 预期不受“开放”室中与气相空气处于平衡状态的水相体积的影响，这一点已得到证实 补充表格 2在密闭腔室中，仪器背景O₂ 接近空气饱和的通量 J°₁[pmol∙s^-¹·mL^-¹] 取决于体积 V (补充表格 2）。O₂ 传感器的消耗量 [pmol∙s^-¹] 可根据零点校正后的原始信号 R1-R0 [µA] 测得的电子流以及电荷数 4 e 预测^-/0₂ 以及法拉第常数 F = 96 485.33 C∙mol^-¹1 µA 相当于电子流（e^-) 10.36 pmol∙s^-¹. 除以电荷数可得到一个 O₂ 流¹⁵^,³⁹ 2.591 pmol∙s^-¹·µA^-¹.记录的R1-R0中位数在0.5 mL和2.0 mL室中分别为2.09 µA和1.98 µA（补充表格 2；R0 = 0.006 ± 0.007 µA 在 s 中V 且 c 中的 R0 = 0.004 ± 0.003 µAV 腔室），理论上对应于O₂5.41 pmol∙s 的消耗速率^-¹和 5.13 pmol∙s^-¹. O₂ 传感器的流速被转换为空气饱和条件下的预期体积特异性通量（J°_R₁) 为 5.41 pmol∙s^-¹/0.5 mL = 10.82 pmol∙s^-¹·mL^-¹ 和 5.13 pmol∙s^-¹/2.0 mL = 2.56 pmol∙s^-¹·mL^-¹ 在 sV 和 cV 室，分别。在2.0 mL和0.5 mL腔室中使用相同类型的极谱式氧传感器时，其体积特异性背景O₂₂ 通量 - 由电流 R1-R0 计算得出（J°_R₁）——理论上会因腔室体积的减小而成反比增加4倍。 J°_空气（在空气饱和条件下，此时反向扩散为零；比较表格 2 和 补充表格 3) 针对 O 进行了计算₂空气饱和浓度由实验背景测试的线性回归确定（图3). J°_空气接近理论预期值 J°_R₁两个腔室均需（表格 2）。该 J°_空气 / J°_R₁ 比值分别为0.85 ± 0.04和0.92 ± 0.12，在s中V 和 cV 腔室，分别与在2.0 mL腔室中进行的一组独立的52次测量结果一致，该比值为0.95 ± 0.12（补充表格 4). J°_空气在0.5 mL室中比在2.0 mL室中高出3.9倍。净O₂逆向扩散 J°₅₀，按50 µM O计算₂从实验背景测试的线性回归结果来看，在0.5 mL反应室中仅高出三倍表格 2）。仪器背景氧的变异性₂ 两种不同腔室体积中的通量几乎相同，标准差（SD）分别为0.5和0.3 pmol∙s^-¹·mL^-¹ 用于 J°_空气 0.9 和 0.8 pmol∙s^-¹·mL^-¹用于 J°₅₀ 在 sV 和 cV 室，分别（表格 2）。尽管仪器本底较高 O₂ 0.5 mL chamber 中的斜率，背景 O₂ 通量在 c_O_₂ 在两种培养室中均具有高度可重复性（图3D。这会导致残差值较低 <±1 pmol·s^-¹·mL^-¹两个腔室均（补充表格 5)，符合Oroboros检测限的要求²⁸.

我们在腔室处于“开放”配置时，以100 rpm（1.7 Hz）为步长，在350 rpm（5.8 Hz）至950 rpm（15.8 Hz）范围内量化了搅拌速度对POS校准原始信号R1的影响。在此配置下，培养基中溶解的O₂与气相处于平衡状态；因此，原始信号（微安[µA]）随搅拌速度的变化并不反映c_O_₂的真实差异。无论腔室体积如何，氧传感器在默认转速750 rpm下对搅拌速度变化的响应均仅表现出对R1的微小偏差（图4）。在“开放”配置下，O₂斜率的噪声（定义为信号稳定后每一步的SD）在两种类型的腔室中均于850 rpm时最低，并在搅拌速度向任一方向偏离该值时增加（图5A）。当转速低于550 rpm时，O₂斜率的噪声超过±4 pmol∙s^-¹∙mL^-¹的阈值，因此定义了最低实用搅拌速度。由于技术限制，未能达到上限，因此将950 rpm确定为最大实用搅拌速度（图5A）。在此范围内，O₂信号相对于R1的偏差<2.5%。关闭腔室并未改变噪声与搅拌速度之间的关系（图5B）。在0.5-mL腔室中，指数时间常数τ在550 rpm时为2.53 ± 0.05 s，在750 rpm时为2.50 ± 0.05 s（补充图3）。

应用于血小板的 SUIT-003_D018 方案包含多达 14 步滴定操作。该方案旨在研究活细胞的耦合控制状态（ce）以及质膜通透性作为细胞活力的指标³²。在两种类型的测量 chamber 中测得的氧通量（图6）在所有呼吸状态下均高度一致（图7）。需要间歇性复氧以避免功能性缺氧，或将实验中的 O₂ 浓度限制在特定范围内。在鱼藤酮（Rot）滴定完成后，通过将 chamber 打开至“开放”位置实现复氧。关闭 chamber 后，2.0-mL chamber 内的 O₂ 通量在 4 分钟内即可稳定，而 0.5-mL chamber 则需约 10 分钟才能达到稳定并设定新的基准值（图6 和 补充图 4）。在 O₂ 通量较低的 rox 状态下进行复氧，可避免在达到稳定所需的时间内 O₂ 浓度进一步下降。在 sV 和 cV chamber 中，经鱼藤酮抑制后的 rox 值分别为 0.9 ± 0.6 和 2.0 ± 0.6 pmol∙s^-¹∙mL^-¹，对应的 O₂ 浓度分别为 98 ± 17 和 94 ± 17 µM（均值 ± 标准差）。在 sV 和 cV chamber 中，复氧至 O₂ 浓度分别为 159 ± 8 和 147 ± 11 µM 时，rox 分别上升了 3.1 ± 0.9 和 0.9 ± 0.4 pmol∙s^-¹∙mL^-¹。血小板中观察到的 rox 对氧浓度的依赖性与人成纤维细胞及脐静脉内皮细胞的研究结果一致⁴⁰。

在透化成纤维细胞的氧化磷酸化（OXPHOS）分析中，我们采用了两种SUIT方案，分别包含最多17步和20步的滴定步骤（SUIT-001和SUIT-002，分别³⁵；图8）；因此，滴定体积校正尤为重要，因为在SUIT-002结束时，sV和cV腔室的最大稀释度分别达到14%和10.5%。在0.5 mL和2.0 mL腔室中，成纤维细胞数量分别为0.35·10⁶ x和1.44·10⁶ x，最终获得相同的细胞浓度，即0.75·10⁶ x∙mL^-¹。SUIT-001与SUIT-002的联合应用共检测了20种呼吸状态，所有状态在两种腔室类型之间均表现出高度相关性（SUIT-001的r² = 0.950，SUIT-002的r² = 0.959）。在两种方案中，复合体IV（Complex IV）的数据均表现出相对较大的离散度（图9）。在SUIT-001中，起始时体积特异性O₂通量较低，为18.7 ± 7.0 pmol∙s^-¹∙mL^-¹（均值 ± 标准差），因此在整个实验过程中无需重新供氧，O₂浓度可自然下降至56 µM，直至实验方案中与CIV相关的阶段（图8A；8Ama）。然而，在SUIT-002中，需在解偶联剂滴定前进行重新供氧，将O₂浓度从100 µM提升至180 µM（图8B；6Gp）。考虑到重新供氧后通量稳定所需时间较长，应避免在解偶联剂滴定过程中进行重新供氧。

对分离的线粒体应用了简化的SUIT方案（图10）。线粒体蛋白浓度在呼吸测定实验后确定，因此无法预先定义反应腔室中样品的准确浓度。体积特异性呼吸通量随线粒体浓度变化而变化。因此，数据以体积特异性和蛋白质量特异性通量两种形式呈现（图11）。两种表示方式均显示出在0.5 mL和2.0 mL腔室中获得的测量结果之间存在高度相关性（图11）。

在使用抗霉素A抑制复合体III后测得的残余氧消耗量rox，可作为仪器在极低呼吸速率下性能的指标。在所有实验系列中，0.5 mL和2.0 mL检测腔之间的rox值具有可比性（血小板：t₍₅₎ = -0.34，p = 0.74；成纤维细胞：SUIT-001：t₍₁₀₎ = 20.00，p = 0.06；SUIT-002：t₍₁₀₎ = 11.00，p = 0.96；分离的线粒体：t₍₄₎ = -1.18，p = 0.27）。数据的离散程度主要对应于仪器的测量不确定度±1 pmol∙s^-¹∙mL^-¹ ¹³^,²⁸，如图12所示。原始数据文件可在Zenodo数据库中开放获取：10.5281/zenodo.11634408。

氧气浓度与速率斜率关系图；方程、符号、数据分析、光谱研究。
图 3：sV（0.5 mL；绿色和黑色）和 cV 室（2.0 mL；蓝色）的仪器本底 O₂通量。O₂ 浓度范围从空气饱和状态（约 180 μM）至约 50 µM。空心符号：未添加连二亚硫酸钠（Na-dithionite）时测得的 O₂ 浓度。实心符号：通过手动滴加连二亚硫酸钠控制的 O₂ 浓度。黑色圆圈：在 0.5 mL 反应室中使用 TIP2k 滴加连二亚硫酸钠控制的 O₂ 浓度（N = 8）。仪器本底测试结果汇总自以下系列：（A）系列 1（sV： N = 2；cV： N = 2），在使用活细胞（ce）之前；（B）系列 2（sV： N = 38；cV： N = 50），在使用透化细胞（pce）之前；（C）系列 3（sV： N = 10；cV： N = 10），在使用分离线粒体（imt）之前。（D）A–C 各图数据叠加结果。请点击此处查看该图的放大版本。

搅拌速度与变化关系图；数据分析；腔室编号对测量变异性的影响。
图 4：搅拌转速对0.5 mL腔室（绿色）和2.0 mL腔室（蓝色）在空气饱和状态（“开放”腔室）下POS信号的影响。 相对于750 rpm时经R0校正的空气校准信号R1-R0 [µA]的响应 [%]（sV：N = 4；cV：N = 4）。请点击此处查看此图的放大版本。

氧气消耗速率与搅拌速度关系图；Oroboros腔室的O₂斜率标准差分析。
图5：O₂斜率噪声随搅拌转速的变化。噪声以标准差表示，在（A）“开放”腔室中；（B）封闭腔室中（0.5 mL，绿色；2.0 mL，蓝色）。请点击此处查看该图的放大版本。

Oxygen concentration chart; O2 measurements in μM vs. time, respiratory analysis experiment results.
图6O₂ 0.5 mL腔室中冷冻保存的人类血小板的消耗 O的代表性轨迹₂浓度 [µM]（蓝色线条）和 O₂每细胞流量 [amol∙s^-¹·x^-¹] 计算为 O₂通量 [pmol∙s^-¹·mL^-¹] 除以细胞浓度 157∙10⁶x·mL^-¹（红色线条，已校正仪器背景O₂通量；由滴定引起的尖峰已被消除）。O_₂浓度通过间歇性重新充氧（空气，“开放” chamber，蓝色阴影区域）维持在50 µM以上。呼吸状态序列（滴定过程及速率；SUIT-003_D018方案）： ce1，常规呼吸作用 R 活细胞 ce1P，以5 mM丙酮酸作为外源底物。 ce2Omy10 （面板 A），Omy滴定以5 nM为步长；泄漏呼吸 L. ce3U0.3 （面板 A）和 ce3U0.1 （面板 B)，分别进行解偶联剂滴定至最佳CCCP浓度为0.3和0.1 µM；电子传递能力 E. ce3Glc，葡萄糖 11 mM； E 被解偶联剂逐渐抑制。 ce4旋转，0.5 µM 鱼藤酮抑制复合物 I；残余氧消耗 rox. ce5S，琥珀酸 10 mM；刺激 E 在细胞膜通透性细胞中。 1挖15 （面板 A）和 1挖10 （面板 B），5 µg·mL的毛地黄皂苷滴定^-¹15 和 10 µg·mL 的最佳浓度步骤^-¹，分别用于完全的质膜透化；琥珀酸盐途径电子传递能力 S_E. 1c细胞色素 c 10 µM；线粒体外膜完整性检测 2Ama，抗霉素A 2.5 µM 抑制复合体III； rox. 请点击此处以查看此图的放大版本。

Graph comparing O₂ flow per cell between chambers; includes linear fit equations and data points.
图7：0.5 mL和2.0 mL反应室中测定的冷冻保存人血小板呼吸的相关性 Rox校正的O₂流程在方案 SUIT-003_D018 中进行评估（图6); N = 6. (A) 使用寡霉素 Omy；(B) 无 Omy 时的平均斜率 Static equilibrium diagram with torque equation ΣM=0, illustrating forces and moments balance. 和截距 static equilibrium (ΣFx=0) on inclined plane with force components diagram for physics education 反向最小二乘回归及决定系数 r² 根据所有数据计算得出。黑色虚线表示恒等线。红色线表示计算得到的回归线。O₂ 添加葡萄糖后处于该状态下的流被排除（参见图6）。含寡霉素与不含寡霉素的实验方案分别展示于各图中 A 和 B 以避免数据点重叠。请点击此处以查看此图的放大版本。

氧气浓度随时间变化图；显示呼吸状态，使用呼吸测定数据分析。
图8：0.5 mL 检测室中成纤维细胞的 O₂ 消耗。 c_O₂（蓝色线 [μM]）和每细胞 O₂ 流速（计算为 O₂ 通量 [pmol∙s^-1∙mL^-1] 除以细胞浓度 (0.75·10⁶ x∙mL^-1)）的代表性曲线，已校正仪器本底 O₂ 通量（红色线，滴定引起的尖峰已被消除）。通过间歇性重新充氧（空气，“开放”检测室，蓝色阴影区域）使 O₂ 浓度保持在 50 μM 以上。呼吸状态序列（滴定步骤及速率）。(A) SUIT-001_D004 方案：ce1，常规呼吸 R。+Dig，加入 10 μg·mL^-1 皂苷（ce 转为 pce），残余内源性呼吸 ren。1PM，加入 5 mM 丙酮酸和 2 mM 苹果酸；N 通路漏呼吸 N_L。2D，加入 2.5 mM ADP；N 通路氧化磷酸化能力 N_P。2c，加入 10 μM 细胞色素 c；检测线粒体外膜完整性。3U1.5，逐步滴加解偶联剂至最适 CCCP 浓度 1.5 μM；NADH 连接的电子传递能力 N_E。4G，加入 10 mM 谷氨酸；N(PGM)_E。5S，加入 10 mM 琥珀酸；NS 通路电子传递能力 NS_E。6Rot，加入 0.5 μM 鱼藤酮；琥珀酸通路电子传递能力 S_E。7Gp，加入 10 mM 甘油磷酸；SGp_E。8Ama，加入 2.5 μM 抗霉素 A；残余氧消耗 rox。9AsTm，加入 2 mM 抗坏血酸和 0.5 mM TMPD；作为 CIV 激活底物；检测室保持开放 20 分钟，以实现氧化还原平衡而不消耗氧气⁴；关闭检测室后 O₂ 通量超出量程（205 amol·s^-1·x^-1）。10Azd，加入 100 mM 叠氮化钠；氧依赖性化学本底通量 chb。(B) SUIT-002_D007 方案：ce1，R。+Dig，ren。+D，刺激 ren。+M.1，加入 0.1 mM 苹果酸和 1Oct，加入 0.5 mM 辛酰肉碱；F 通路氧化磷酸化能力 F_P = J(1Oct) - J(+M.1)。1c。2M2，加入 2 mM 苹果酸以支持回补性 N 通路；F(N)_P。3P 和 4G，逐步激活至 FN_P。5S，FNS_P。6Gp，FNSGp_P。7U1.5，FNSGp_E。8Rot，SGp_E。9Ama，rox。10AsTm，O₂ 通量超出量程，为 207 amol·s^-1·x^-1。11Azd，chb。通常，复合体 IV 活性为在相近 O₂ 浓度下 J(AsTm) 与 J(Azd) 的速率差值。详见图6。请点击此处查看此图的放大版本。

氧气流相关性图、腔室中的细胞、线性回归、两种装置之间的数据比较
图9：0.5 mL与2.0 mL腔室中通透化成纤维细胞呼吸作用的相关性。经Rox校正的O₂流速在（A）SUIT-001_D004和（B）SUIT-002_D007中（N = 6）。平均斜率带有力矩方程ΣM=0的静力平衡示意图，用于说明力与力矩的平衡与截距斜面上的静力平衡（ΣFx=0），含分力示意图，用于物理教学由反向最小二乘回归得出，并基于全部数据计算决定系数r²。黑色虚线表示恒等线。红色线表示计算所得的回归线。请点击此处查看该图的放大版本。

氧气通量与浓度图；呼吸测定分析；反应室体积；实验进程。
图 10：0.5 mL（绿色）和 2.0 mL（蓝色）反应室中分离的小鼠心脏线粒体的 O₂ 消耗。代表性曲线显示（A）线粒体蛋白浓度为 0.023 mg∙mL^-1 时的单位质量 O₂ 通量（已校正仪器背景 O₂ 通量，滴定引起的尖峰已被消除）以及（B）O₂ 浓度 [μM]。按照 SUIT-002_D005 方案依次建立的呼吸状态（滴定步骤与速率）：imt，内源性残余呼吸 ren；+D，加入 ADP（2.5 mM），刺激 ren；+M.1，加入苹果酸（0.1 mM）和 1Oct，辛酰肉碱（0.5 mM）；F 通路氧化磷酸化能力 F_P = J(1Oct) - J(+M.1)；1c，细胞色素 c（10 μM）；检测线粒体外膜完整性；2M2，高浓度苹果酸（2 mM），支持补碳的 N 通路；F(N)_P；3P，丙酮酸（5 mM）；FN_P；4G，谷氨酸（10 mM）；FN_P；5S，琥珀酸（10 mM）；FNS_P；6Gp，甘油磷酸（10 mM）；FNSGp_P；7U0.5，逐步加入解偶联剂至最适 CCCP 浓度（0.5 μM）；FNSGp_E；8Rot，鱼藤酮（0.5 μM）抑制复合体 I（CI）；SGp_E；9Ama，抗霉素 A（2.5 μM）抑制复合体 III（CIII）；残余氧消耗 rox。请点击此处查看该图的放大版本。

氧气通量比较图；线性回归分析；腔室测量；科学研究。
图11：在0.5 mL和2.0 mL腔室中测得的分离小鼠心脏线粒体呼吸的相关性。采用如图10所示方案测得的O₂通量（N = 4）。(A) 体积特异性O₂通量。(B) 经Rox校正后的O₂通量除以线粒体蛋白浓度（0.013 - 0.026 mg∙mL^-1）。均值斜率带有扭矩方程ΣM=0的静力平衡示意图，用于说明力与力矩的平衡。与截距斜面上静力平衡（ΣFx=0）的受力分量示意图，用于物理教学。由反向最小二乘回归计算得出，并基于所有数据计算决定系数r²。黑色虚线表示恒等线。红色线表示计算所得的回归线。请点击此处查看该图的放大版本。

氧气通量比较图；两种腔室体积下的线性回归分析，显示数据点。
图12：0.5 mL 和 2.0 mL 腔室中的残余氧消耗 rox。 在加入抗霉素A后测得的单位体积通量，数据综合自活细胞（ce，方块）、透化细胞（pce，圆形）和分离线粒体（imt，三角形）的实验结果。反向最小二乘回归的平均斜率带有力矩方程 ΣM=0 的静力平衡示意图，说明力与力矩的平衡。与截距斜面上的静力平衡（ΣFx=0），用于物理教学的力分量示意图。虚线：恒等线。红线：计算得到的回归线。阴影区域：仪器分辨率范围。请点击此处查看该图的放大版本。

模块	sV	cV
实验腔室体积 V	0.5 mL	2.0 mL
玻璃圆筒内径	12.0 mm	16.0 mm
玻璃圆筒外径	24.0 mm	24.0 mm
玻璃壁厚度	6.0 mm	4.0 mm
PVDF涂层搅拌子	11.5 x 6.2 mm	15.0 x 6.0 mm
塞子毛细管直径	1.00 mm	1.30 mm
塞子毛细管横截面积	0.79 mm²	1.33 mm²
塞子毛细管长度	50.64 mm	48.86 mm
塞子毛细管体积	39.8 µL	64.9 µL
塞子毛细管死体积 V_stc（包含一小滴液体）^a	0.04 mL	0.07 mL
体积校准用体积 V´	0.54 mL	2.07 mL

^a液滴体积应为 5 µL，以适配带聚醚醚酮（PEEK）密封垫的 cV 室，而 sV 室则接近 0 µL。
表1：带聚醚醚酮（PEEK）密封垫的小体积（sV）模块与经典体积（cV）模块的尺寸。

	J°_air / [pmol∙s^-1∙mL^-1]		J°₅₀ / [pmol∙s^-1∙mL^-1]
实验腔室体积 V	0.5 mL	2.0 mL	0.5 mL	2.0 mL
平均值	9.22	2.37	-3.17	-1.17
中位数	9.25	2.36	-3.08	-1.04
标准差	0.49	0.34	0.93	0.83
最小值	8.20	1.79	-5.11	-3.72
最大值	10.41	3.42	-0.82	0.67

表2：外推至空气饱和状态的J°_air以及在50 μM O₂浓度下计算的J°₅₀。 第2组（pce）和第3组（imt）仪器本底测试的汇总数据，以及TIP2k滴定前的数据（0.5 mL：N = 48；TIP2k：N = 8；2.0 mL：N = 60）。

补充文件1：样品制备。人血小板、人成纤维细胞以及从小鼠心脏中分离的线粒体。请点击此处下载该文件。

补充图1：使用TIP2k进行仪器O₂背景测试。 使用TIP2k在0.5 mL样品室中滴定连二亚硫酸钠（2.5 mM）的代表性曲线。介质：MiR05，温度：37 °C，搅拌速度：750 rpm。滴定引起的峰已消除。请点击此处下载该文件。

补充图2：仪器背景O₂ 通量 J°₁ 作为 O 的函数₂ 浓度 腔室 sV （0.5 mL；绿色， N = 48）和 Chamber cV （2.0 mL；蓝色， N 系列2（pce，圆圈）和系列3（imt，三角形）中 n = 60，以及在0.5 mL样品池中进行TIP2k滴定前（黑圈， N = 8）。红线：中位数 ± 标准差。请点击此处下载此文件。

补充图3：指数时间常数τ随搅拌转速的变化关系。 在37 °C条件下，0.5 mL样品室的各个τ值（N = 2）。在0.5 mL样品室中，550 rpm时τ为2.53 ± 0.05 s，750 rpm时为2.50 ± 0.05 s，850 rpm时为2.47 ± 0.04 s。请点击此处下载该文件。

补充图 4：2.0 mL 室中冻存人血小板的 O₂ 消耗。 协议 SUIT-003_D018 的代表性轨迹，包括寡霉素滴定（Omy）。通量 [pmol∙s^-1∙mL^-1] 已校正仪器背景 O₂ 通量，并除以细胞浓度（164×10⁶ 个∙mL^-1）。由滴定引起的尖峰已被消除。c_O₂ 通过间歇性复氧（空气，“开放”室，蓝色区域）维持在 60 µM 以上。呼吸状态序列（滴定及速率）：ce1，活细胞的常规呼吸 R。ce1P，外源性底物丙酮酸。ce2Omy10，以 5 nM 步长进行寡霉素滴定；漏呼吸 L。ce3U2.0，解偶联剂滴定至最适浓度 2 µM；电子传递通量能力 E。ce3Glc，葡萄糖 11 mM；解偶联剂逐步抑制 E。ce4Rot，鱼藤酮 0.5 µM 抑制复合体 I（CI）；残余氧消耗 rox。ce5S，琥珀酸 10 mM；在质膜通透性细胞中刺激 E。1Dig20，毛地黄皂苷滴定至最适浓度 20 µg·mL^-1，实现完全质膜通透化；琥珀酸途径电子传递能力 S_E。1c，细胞色素 c 10 µM；检测线粒体外膜完整性。2Ama，抗霉素 A 2.5 µM 抑制复合体 III（CIII）；rox。请点击此处下载该文件。

补充表 1：底物-抑制剂-解偶联剂滴定（SUIT）方案中使用的化学试剂。 sV 和 cV 腔室所用试剂的缩写及储备液浓度。请点击此处下载该文件。

补充表 2：0.5 mL 和 2.0 mL 检测室中 R1-R0 与 J°₁ 的比较。 汇总了第 2 系列（pce）和第 3 系列（imt）的仪器本底测试数据以及 TIP2k 滴定前的数据（0.5 mL：N = 48；TIP2k：N = 8；2.0 mL：N = 60）。数据仅来自在平均大气压为 94.9 kPa（奥地利因斯布鲁克）条件下进行的第 2 系列（pce）和第 3 系列（imt）实验，不包括在海平面条件下获得的第 1 系列（ce）数据。0.5 mL 和 2.0 mL 检测室使用了相同类型但不同个体的 POS 传感器。因此，在比较 sV 和 cV 检测室时，必须考虑传感器之间的变异性。尽管实验测得 2.0 mL 检测室的 J°₁ = 2.26 ± 0.41 pmol∙s^-1∙mL^-1 与计算值非常接近，但 0.5 mL 检测室测得的 J°₁ = 8.48 ± 0.53 pmol∙s^-1∙mL^-1 却低于预期。这可通过以下观察结果加以解释：关闭检测室后，0.5 mL 检测室中较高的本底 O₂ 通量导致在设定为相同时段的 J°₁ 标记处 O₂ 浓度降低（图 1）。0.5 mL 和 2.0 mL 检测室中 J°₁ 处的氧浓度分别平均低于空气饱和浓度 4.06% 和 1.72%（补充图 2，补充表 2）。在较低 c_O₂ 条件下，传感器的 O₂ 消耗减少以及部分 O₂ 反向扩散会降低实验测定的 J°₁ 值。请点击此处下载该文件。

补充表3：获得校准值（R1）和J°₁时的氧气浓度[µM]及其百分比差异。 系列2（pce）和系列3（imt）的仪器本底测试汇总数据，以及TIP2k滴定前的数据（0.5 mL：N = 48；TIP2k：N = 8；2.0 mL：N = 60）。请点击此处下载该文件。

补充表 4：测量值与预期值 J°₁ 在2.0 mL反应室中。 使用O2k系列A（带钛制塞子）进行的独立仪器本底测试系列¹³), V = 2.0 mL（37 °C，含O的NaCl溶液）₂ 溶解度因子 0.92； N = 52). n_O₂/Q_e = 10⁶/(96485.33·4) = 2.591 pmol∙µC^-1 = 2.591 pmol·s^-1∙µA^-1. 基于以下假设：O₂ 反向扩散可忽略不计 c_O₂,1，这只在 c_O₂,1 ~ c_O₂*. 请点击此处下载此文件。

补充表5：线性回归残差（绝对值 [pmol O₂·s^-1·mL^-1]) 针对每种仪器的 O 计算得出₂ 背景测试第2组（pce）和第3组（imt）仪器本底测试的汇总数据，以及TIP2k滴定前的测试结果。请点击此处下载此文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

呼吸测定实验中可获取的样品量通常有限，例如在活检组织、原代细胞或细胞数量较少的慢速生长细胞培养物的研究中¹此外，由于线粒体损伤，呼吸活性受到抑制¹¹ 或在研究呼吸容量较低的线粒体通路时，例如脂肪酸氧化¹². 在这些情况下，较低的呼吸测量室体积有助于提高 O₂ 流量检测的分辨率₂通量。然而，仪器的背景氧通量₂在较低的腔室体积下，通量会增加，若未能可靠测量并针对氧浓度进行适当校正，则可能引发误差₂浓度。仪器氧₂背景测试与背景校正对于小体积实验腔室尤为重要。理论值（J°_R₁）和实验（J°_空气) O₂通量为使用4 e的极谱法测量的准确性提供了证据^-/₂在的阴极 POS 反应。两者之间的差异 J°_R₁以及 J°_空气为1.64 ± 0.43 和 0.22 ± 0.31 pmol∙s^-1∙mL^-1 在 sV 和 cV 分别表明测量的精确度处于2.0-mL chamber的检测限范围内±1 pmol∙s^-1∙毫升^-1)²⁸. 在 2.0-mL 和 0.5-mL 实验 chamber 中使用相同类型的极谱氧传感器时，单位体积的背景 O₂ 通量₂通量随腔室体积成反比增加4倍，两种腔室体积下的变异程度几乎相同，标准差分别为0.5和0.3 pmol∙s^-1∙mL^-1 用于 J°_空气和 0.9 与 0.8 pmol∙s^-1∙毫升^-1 用于 J°₅₀在 sV 和 cV 室，分别（Table 2）。在最低呼吸活性（小体积 chamber 的设计目标）条件下，即使微小的背景效应也变得显著（补充 Table 3; 补充图 2）。因此，对仪器背景氧通量进行常规评估是必要的₂通量图1) 是进行适当校正所必需的²⁸.

为了维持体系的均一性并保证稳定的氧信号，需要对介质进行高速且持续的搅拌。2.0 mL 搅拌腔的搅拌速度设定为 750 转/分钟（rpm），但 0.5 mL 搅拌腔的最佳搅拌速度尚不明确。由于玻璃腔室与搅拌子在几何结构上的差异（表 2），需对 0.5 mL 腔室的最佳搅拌速度进行独立评估。氧传感器对 550 rpm 至 950 rpm 之间的搅拌速度变化有响应，在 750 rpm 时，O₂信号 R1 仅有微小偏离，且不受腔室体积影响。在相同搅拌速度下，对 Chamber sV 计算得到的指数时间常数 τ 与 2.0 mL 腔室报道的 τ 值一致¹³。这些结果表明，两种腔室几何结构下的搅拌效率相当，因此 2.0 mL 腔室默认的 750 rpm 搅拌速度可直接应用于 0.5 mL 腔室。在“开放”和“封闭”两种腔室构型下，0.5 mL 腔室均表现出更高的信噪比，提示其具有更高的检测精度，这是 0.5 mL 腔室的一项优势（图 5），尽管个体间 POS 的差异影响尚不能排除。由于将搅拌速度从 750 rpm 降低至 550 rpm 时噪声并未增加，因此在 0.5 mL 腔室中将搅拌速度降至 550 rpm 可能有助于减小剪切应力，同时不损害信噪比。

几乎相同的O₂通量₂在应用适当的背景校正后，于三种实验模型中分别在 0.5-mL 和 2.0-mL 检测室中测定了耗氧速率。使用少量血小板所得的结果 µ直径为 m⁴²，活细胞和透化纤维细胞以及分离的线粒体结果表明，在0.5-mL和2.0-mL chamber中可获得一致的呼吸速率多种细胞类型和线粒体制备样品中均适用。然而，本研究尚未测试透化肌纤维。准确测量 rox 需要控制氧水平⁴⁰ 且具有高仪器分辨率¹. 体积特异性氧₂通量 rox 可能低至检测限。当实验中使用较少的细胞数量或通常较少的样品量时，无需重新氧合。然而，如有必要，建议在氧通量较低的呼吸状态下进行重新氧合₂通量，以避免氧气的快速下降₂稳定 O₂ 所需时间段内的浓度₂通量。氧气₂复氧后的通量在0.5 mL chamber中恢复所需时间更长。

作为质量控制的一部分，在部分换液过程中对悬浮液中样品的稀释需特别注意。在完全插入的塞子被取出后，总体积 V' 呼吸介质在腔室中的体积由实验体积决定 V 以及封口毛细管体积 V_stc (Table 2）。因此，储备体积 V_J_{. i} 在实际体积中被稀释 V'，大于 V，导致稀释倍数 V/V' 0.5/0.54 = 0.926 和 2.0/2.07 = 0.966，分别对应 0.5 mL 和 2.0 mL 气室（图2）。在血小板实验中，使用了 Chamber 的原型塞子 sV 毛细管死体积为0.05 mL，对应的稀释因子为0.909。

在相同样品浓度（单位体积内的量）下，0.5-mL 比 2.0-mL 气室所需的活细胞、透化细胞和分离线粒体的用量少近四倍，经细胞数量或蛋白质量归一化后的呼吸性 O₂消耗量测定结果具有可比性。这表明 Chamber sV 是样品量有限的研究中一种有价值的工具。另一方面，在 Chamber sV 中使用相同量的样品可提高体积特异性 O₂通量，从而在呼吸活性较低时降低测量的不确定性。

本研究中的氧环境仅限于从空气饱和至30 µM的O₂范围。在该范围之外的氧水平下的适用性尚需进一步评估，以研究组织常氧或低氧状态下的线粒体功能⁴³，以及高氧条件下的透化组织⁹。Oroboros NADH和Q- 模块的多种多传感器配置，以及pH、NO和TPP⁺-电极¹⁰^,⁴⁴，无法适配于sV腔室，仍需使用2.0-mL腔室。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EL 是 Oroboros Instruments 的员工。EG 是 Oroboros Instruments 的创始人兼首席执行官。

在本项目中，Oroboros Instruments 使用了 LFGS。EÅF 和 EE 是位于瑞典隆德的 Abliva AB 公司的员工，该公司与 Oroboros Instruments 持有商业协议。

LR 声明不存在利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Manuela Passrugger 在分离线粒体数据收集方面的贡献，Patrizia Guerth 在搅拌转速测试方面的技术支持，以及 Mateus Grings 对搅拌器测试时间常数的分析。我们感谢我们的合作伙伴奥地利 Kolsass 的 WGT Elektronik GmbH & Co KG 提供玻璃腔室、密封塞和磁场强度的技术参数信息。我们感谢 Luiza HD Cardoso、Alejandra Romero-Martinez、Ondrej Sobotka、Alba Timon-Gomez 和 Jaime Willis 提出的宝贵意见。本研究部分由欧盟“地平线2020”研究与创新计划资助，资助号为 859770（NextGen-O2k 项目）。同时感谢 COST 行动 CA15203 MitoEAGLE 项目提供的短期科学访问计划（LFGS、LR）的财政支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
Anaconda3	Anaconda Software Distribution	https://www.anaconda.com/	软件
ADP	Merck, Germany	117105
抗生素-抗真菌素 100倍浓缩液	Biosera, France	XC-A4110	警告 H317 可能引起过敏性皮肤反应
抗霉素 A	Sigma-Aldrich, USA	A8674	警告 H300 吞咽致命，H400 短期（急性）对水生环境有害
抗坏血酸	Sigma-Aldrich, USA	A7631
ATP	Sigma-Aldrich, USA	A 2383
无脂肪酸牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich, USA	A 6003	bovine serum albumin
CaCO₃	Sigma-Aldrich, USA	C 4830
CCCP	Sigma-Aldrich, USA	C2759	羰基氰化物间氯苯腙警告 H301 + H311 + H331 吞咽、皮肤接触或吸入有毒
Countess 自动细胞计数仪	Thermo Fisher Scientific, USA	AMQAX100
细胞色素 c	Sigma-Aldrich, USA	C7752
DatLab	Oroboros Instruments, Austria	Version 7.4	用于数据采集与分析的软件
DatLab	Oroboros Instruments, Austria	Version 8.1	用于数据采集与分析的软件
DC 蛋白检测试剂盒	Bio-Rad, USA	5000112	蛋白检测试剂盒；警告 H314 可引起严重皮肤灼伤和眼睛损伤
皂苷	Sigma-Aldrich, USA	D5628	警告 H301 吞咽有毒
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich, USA	D 0632	警告 H318 可引起严重眼睛损伤
DMEM	Pan Biotech, Germany	P04-05551	Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基
DMSO	Sigma-Aldrich, USA	D2650	二甲基亚砜
DPBS	Lonza Bioscience, Switzerland	LONBE17-512F	无钙 Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液
EGTA	Sigma-Aldrich, USA	E 4378
FBS	Thermo Fisher Scientific, USA	A5256701	胎牛血清
葡萄糖	Sigma-Aldrich, USA	G7528
谷氨酸	Sigma-Aldrich, USA	G1626
甘油磷酸	Santa Cruz Biotechnology	sc-215789
Heraeus Multifuge 3s Large	Thermo Fisher Scientific, USA	HM3S	离心机
Hettich Rotina 380R	Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Germany	1701	离心机
咪唑	Honeywell Fluka, Austria	56750	警告 H302 吞咽有害，H314 可引起严重皮肤灼伤和眼睛损伤，H360D 可能损害未出生婴儿
jamovi	The jamovi project	Version 2.3.13	软件
K⁺-MES	Sigma-Aldrich, USA	M 8250
Leucosep 管	Greiner Bio-One GmbH, Austria	Z642843-300EA	带聚乙烯屏障的离心管
苹果酸	Sigma-Aldrich, USA	M1000	警告 H319 可引起严重眼睛刺激。
甘露醇	Sigma-Aldrich, USA	M 4125
MgCl₂	Scharlau, Spain	MA 0036
MiR05-试剂盒	Oroboros Instruments, Austria	60101-01	线粒体呼吸介质
Mixer	Swelab Instruments, Sweden	440S	摇床
Mr. Frosty 冷冻容器	Thermo Fisher Scientific, USA	5100-0001	冷冻容器
Oroboros	Oroboros Instruments, Austria		NextGen-O2k 和 O2k 统称为 ‘Oroboros’
Oroboros Chamber cV	Oroboros Instruments, Austria	23100-01	经典体积腔室
Oroboros Chamber sV	Oroboros Instruments, Austria	33100-01	小体积腔室
Oroboros TIP2k-模块	Oroboros Instruments, Austria	11100-03	滴定-注射微泵
O₂-Zero 粉末	Oroboros Instruments, Austria	26600-02	Na-连二亚硫酸盐警告 H251 自热：可能起火，H302 吞咽有害，H319 可引起严重眼睛刺激
辛酰肉碱	Biotrend - APExBIO Technology, Germany	B6371
寡霉素	Sigma-Aldrich, USA	O4876
磷酸肌酸	Sigma-Aldrich, USA	P 7936
丙酮酸	Sigma-Aldrich, USA	P2256	警告 H317 可能引起过敏性皮肤反应
鱼藤酮	Sigma-Aldrich, USA	R8875	警告 H300 吞咽致命
皮肤成纤维细胞系	ATCC, USA
叠氮化钠	Sigma-Aldrich, USA	S2002	警告 H300 + H310 + H330 吞咽、皮肤接触或吸入致命
枯草杆菌蛋白酶 A	Sigma-Aldrich, USA	P 5380	警告 H318 - 可引起严重眼睛损伤，H334 - 吸入可能引起过敏或哮喘症状或呼吸困难
琥珀酸	Sigma-Aldrich, USA	S2378
蔗糖	Sigma-Aldrich, USA	S 7903
Swelab Alfa 血细胞计数仪	Boule Diagnostics AB, Sweden	1420041
牛磺酸	Sigma-Aldrich, USA	T 0625
Tecan Infinite TM F200	Tecan, Switzerland		分光光度计
TMPD	Sigma-Aldrich, USA	T3134	N,N,N',N'-四甲基对苯二胺二盐酸盐警告 H315 可引起皮肤刺激，H319 可引起严重眼睛刺激
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich, USA	T4799	警告 H334 吸入可能引起过敏或哮喘症状或呼吸困难
Vacuette	Greiner Bio-One GmbH, Austria	15452520

参考文献

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