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小体积腔室中的高分辨率呼吸测定法

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DOI：

10.3791/67442

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2025年7月25日

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1Oroboros Instruments, 2Department of Pediatrics and Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University and General Hospital in Prague, 3Institute of Pathophysiology, Medical University of Innsbruck, 4Mitochondrial Medicine, Department of Clinical Sciences, Lund University, 5Abliva AB

本文内容

摘要

本文表明，如果进行了适当的仪器O2 背景校正，0.5 mL高分辨率呼吸测量室所获得的结果与2.0 mL呼吸室的结果具有一致性。该方法所需样品量更少，对于样品来源有限或呼吸活性较低的研究具有优势。

摘要

研究呼吸通量对于理解代谢过程之间复杂的相互作用至关重要。对于样本量有限且呼吸速率较低的细胞和组织研究，采用较小的实验体积可能更具优势。我们考察了在使用Oroboros进行高分辨率呼吸测定、样品浓度相同的情况下，0.5 mL反应室是否能获得与2.0 mL反应室一致的结果。背景氧2 在空气饱和条件下，0.5 mL chamber 中的通量比 2.0 mL chamber 高 4 倍，但结果可重复，允许进行准确的背景校正。0.5 mL chamber 的最佳搅拌速度为每分钟 550 至 750 转（rpm）。在 0.5 mL 和 2.0 mL chamber 中平行测定了活细胞、透化细胞和分离线粒体的呼吸通量。 使用底物-解偶联剂-抑制剂滴定法，进行14至20次滴定。O2 不同条件下的通量 在检测限范围内，腔室类型相同。0.5 mL 腔室所需样本量比2.0 mL腔室少近四倍，对于样本量有限或呼吸能力较低的研究具有显著优势。

引言

研究线粒体呼吸途径对于揭示各种疾病、衰老或应激反应背后的代谢机制至关重要，从而为治疗干预提供潜在靶点，并提升诊断能力1,2,3。高分辨率呼吸测定法（HRR）能够对多种样本类型和制备条件下氧化磷酸化（OXPHOS）中的线粒体通路控制和偶联控制进行详细分析4。实验腔室的体积是呼吸测定仪器的一项基本设计特征。Oroboros仪器先前确定的腔室体积为2.0 mL。该体积经过优化，可确保仪器背景氧（O2 ）通量较低，并保证搅拌介质的均一性。这些是准确测量低氧条件和高氧条件下呼吸速率的关键质量标准，分别适用于线粒体氧动力学和透化肌纤维实验5,6,7,8,9。此外，多种多传感器插入装置10也需要占用2.0 mL腔室的空间（表 1）。

在本研究中，我们探讨了将高分辨率呼吸测定法（HRR）的腔室体积从2.0 mL减少至0.5 mL的可行性。在较小的腔室内进行呼吸测定实验时，是否可以使用较少的细胞数量或组织量，同时不降低检测的准确性？明确这一问题对于研究人体组织和液体活检样本、原代细胞以及生长缓慢的细胞培养物具有重要意义1同样，对于研究线粒体功能缺陷且呼吸活性较低的样品，减小反应室体积可能具有优势。11 以及固有容量较低的线粒体通路，例如大脑中的脂肪酸氧化12然而，由于O的伪影随腔室尺寸减小而 disproportionately 增加，分辨率可能会降低2 倒扩散与不准确的体积校准13,14因此，我们分析了Oroboros仪器的性能表现 使用小体积室（sV) 校准至最小实验体积为 0.5 mL，相较于传统体积腔室（cV) 校准至2.0 mL。特别地，我们分析了仪器背景O2 流速与最佳搅拌速度。

底物-解偶联剂-抑制剂滴定（SUIT）方案用于评估氧化磷酸化（OXPHOS）分析中的呼吸速率和呼吸状态。SUIT方案在每次呼吸测定实验中包含14至20次滴定，涉及的氧通量（O2 ）范围从每秒每毫升几皮摩尔（pmol∙s-1∙mL-1）到数百皮摩尔（pmol∙s-1∙mL-1）不等。 偶联控制状态包括漏呼吸率 L，即呼吸中以耗散形式存在的组分，无法用于将腺苷-5'-二磷酸（ADP）磷酸化为腺苷-5'-三磷酸（ATP），其来源包括质子漏、质子滑移、阳离子循环和电子漏。OXPHOS容量 P 指在存在ADP的条件下，电子传递（以O2 消耗（氧化）来测量）与ATP合成（磷酸化）相偶联时线粒体的呼吸能力。解偶联状态下的电子传递容量 E 通过在存在线粒体底物的条件下滴加质子载体（protonophore）进行定量测定15。残余氧消耗 rox 则在加入复合体I和复合体III抑制剂鱼藤酮（rotenone）和抗霉素A（antimycin A）后测定。

我们在sV和cV室中测量了细胞和线粒体分离物的呼吸作用。血小板是巨核细胞的无核细胞质碎片，是易于获取的人类线粒体来源。因此，血小板被用作具有完整质膜的活细胞（或细胞颗粒）的模型。血细胞的呼吸作用可作为系统性线粒体疾病的生物标志物，并与代谢活跃器官的生物能量健康状况相关16,17,18,19，尽管这些发现尚不能普遍化20,21,22。人成纤维细胞被选为线粒体功能障碍的细胞模型1,23,24,25。质膜的完整性对细胞存活至关重要，但其选择性通透化可允许细胞质与周围介质之间的分子交换。因此，化学法通透化质膜的成纤维细胞被作为通透化细胞的示例进行研究，而分离的线粒体则用于评估线粒体功能，并可用于分离不同的线粒体亚群26,27。

方案

在人类血小板研究中，八名志愿者签署了书面知情同意书，同意参与本研究，该研究已获得瑞典伦理审查局批准（编号：2013/181）。两株来自男性新生儿的人类皮肤成纤维细胞系购自ATCC，并根据捷克共和国卫生部的伦理批准（项目编号：AZV MZ CR NU22-07-00474）进行使用。涉及小鼠的实验操作均依照奥地利动物实验法以及《欧洲实验和其他科学用途脊椎动物保护公约》进行（Tierversuchsgesetz 2012；指令 2010/63/EU；BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016）。实验中遵循3R原则，以尽量减少实验动物的使用数量。

1. 体积校准

  1. 将小体积腔室（sV）或经典体积腔室（cV）安装到Oroboros 上（图1A、B；表1）。
  2. 打开Oroboros 仪器，并连接至DatLab软件。
  3. 干燥腔室。
  4. 向sV 中加入0.54 mL H2O（有效实验体积0.50 mL，毛细管死体积0.04 mL），或向cV 中加入2.07 mL H2O（有效体积2.00 mL，毛细管死体积0.07 mL）。
    注意：为避免液体在玻璃筒顶部与聚甲醛（POM）腔室支架之间流失，应将移液枪头插入足够深度，使其接触玻璃腔室壁。
  5. 启动搅拌器。
  6. 在关闭腔室前，润湿密封塞的O型圈，同时保持其毛细管部分干燥。松开体积校准环，将密封塞向下插入，直至液体充满密封塞毛细管，并在毛细管顶端的接收处形成一小滴液体（表1）。
  7. 拧紧体积校准环以固定其位置，确保每次插入密封塞时均可获得校准后的体积。

2. Oroboros 常规设置

  1. 开始 DatLab 软件
  2. 设置 实验温度 (37 °C）以及 搅拌转速 在 550 rpm （9.2 Hz 或每秒转数）在腔室中V 或 750 rpm (12.5 Hz) 在 Chamber c 中V. 设置 数据采样间隔 在 2 s 与 平滑处理 结束 80 s （40个数据点）在仪器O中2 背景测试或 40 s （20 个数据点）用于呼吸测定。
    注意：磁力搅拌子（AlNiCo 材质，外包聚偏二氟乙烯 [PVDF]）； 表1由腔室内搅拌器水平处强度为3.5 mT的脉冲旋转磁场驱动振荡。
  3. 进行空气校准28 在MiR05或后续实验所用的相同孵育介质中。
  4. 偶尔进行零氧校准，但切勿在开始实验前立即进行。
    1. 通过溶解 O 制备新鲜的 Na-连二亚硫酸盐储备液2-将Zero粉末溶于50 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.0）中，配制成2.5 mM或10 mM浓度，用于sV 或 cV 分别
    2. 过量滴加连二亚硫酸钠以获得原始信号 R0 或零电流µA] 在 O2 浓度 0 µM14,28.

3. 仪器操作O2 背景测试

  1. 腔室 sV
    1. 空气校准后，关闭腔室。监测氧气信号约60分钟，直至O₂2 浓度从空气饱和状态下降至约 150 µM. 设置四个标记 J°1 到 J°4 在图 'O 上2 斜率负值
      注意：执行此仪器操作时2 每天开始实验前进行背景测试。
    2. 可选：使用 Hamilton 注射器，滴加按步骤 2.4.1 制备的连二亚硫酸钠溶液，以达到所需的 O₂ 浓度。2 浓度 100 µM (图1C).
      注意：在另一项方案中，连二亚硫酸钠被滴加到 使用滴定-注射微泵（TIP2k； 补充图1 和 补充图2) 与标准方法测定仪器本底O进行比较2 通量28.
  2. 腔室 cV
    1. 空气校准后，关闭腔室，等待 O2 斜率，并设置 J°1 在图上标记“O2 斜率负值”28使用 Hamilton 注射器，按照 2.4.1 步骤制备的 Na-连二亚硫酸盐，以逐步滴定 0.7 µL 以匹配腔室的氧气环境V 并降低 O2 浓度至 150 µM.
    2. 添加另一步连二亚硫酸钠滴定（约 7 µL) 以降低 O2 浓度至 100 µM (图1D).
  3. 仪器 O2 背景数据分析
    1. 计算仪器的O2 DatLab 中的背景斜率28选择 通量/斜率 从顶部菜单。
    2. 打开 O2 背景校正 窗口。选择 活动文件 作为O的来源2 背景并选择 J° 标记 用于线性回归的计算。 应用 O2 背景校正。

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图1：小体积（sV）和经典体积（cV) 室和仪器 O2 背景检测 (A) 室V. (B) 室 cV. (C代表性轨迹图 斜率呈负值且 J°1 标记，sV （0.5 mL；绿色）和 cV （2.0 mL；蓝色） （D） 相应的氧浓度和R1标记。三次手动添加连二亚硫酸钠 滴定（约 0.7 µL，10 mM 储存液；cV）和最终 7.0 µL 2.5 mM 和 10 mM 的滴定 s中的储备V 和 cV 分别对腔室进行滴定，由此产生的峰信号已被消除。 请点击此处以查看此图的放大版本。

4. 将样品加入 Oroboros 反应室

注意：样本可通过两种方法加入腔室：部分体积置换法（本研究中的血小板和成纤维细胞）或完全体积置换法（本研究中的分离线粒体）。

  1. 部分体积置换
    1. 移除完全插入的塞子。用移液器吸取并弃去体积为 Vout 的 MiR05。对于血小板，Vout 为 60–70 µL；对于成纤维细胞，为 80–150 µL，具体数值根据储备细胞悬液中的细胞浓度计算确定。
    2. 用移液器将等体积 VJ.i 的储备细胞悬液（已知细胞浓度）加入氧电极室中，该体积与 Vout 相同（图2）。
    3. 根据实际体积 V'（0.54 mL 和 2.07 mL）计算实验中的细胞浓度，该体积大于有效实验体积 V（0.5 mL 和 2.0 mL）。
      注：储备细胞悬液的浓度和实验细胞浓度应预先设计，以确保 VJ.i = Vout 的体积值可兼容较小的滴定误差。在血小板实验中，sV 室使用了一种原型塞子，其帽状部分的死体积为 0.05 mL。
  2. 完全体积置换
    1. 用虹吸法将室内的全部培养基吸出，并分别向 sV 或 cV 室中加入至少 0.54 mL 或 2.07 mL 含实验样品浓度的分离线粒体储备溶液。
    2. 关闭反应室，再用虹吸法将塞子接收腔中多余的线粒体储备液吸出。
      注：完全体积置换可避免通过 Hamilton 注射器经塞子毛细管向密闭 反应室中滴加样品时可能引入的线粒体浓度变异。后一种方法适用于由高浓度储备悬液制备的小直径样品（例如分离的线粒体）；然而，该方法会使脆弱细胞暴露于 Hamilton 注射器长 51 mm、内径 0.41 mm 的针头所产生的剪切力下，可能导致细胞质膜受损。通过移除塞子并采用部分或完全体积置换的方式将样品移入反应室，可避免此类损伤。本研究共分析了三种类型的线粒体制剂。样品制备方法详见 补充文件11,26,29,30。
  3. 活细胞：人血小板
    1. 将含有血小板的冻存管插入 37 °C 水浴中，缓慢融化至仅剩少量冰晶。
    2. 打开冻存管，缓慢逐滴加入 1 mL 预热培养基（DPBS + 10 mM EGTA，37 °C）。
    3. 轻轻混匀血小板，转移至 50 mL 离心管中，加入预热培养基（DPBS + 10 mM EGTA，37 °C）至终体积 10 mL。在室温（RT）下，使用摆动转子以 1000 g 离心 10 分钟（加速度 6，刹车 2）。
    4. 将血小板重悬于 0.25 mL DPBS + 10 mM EGTA（室温）中，通过部分体积置换加入反应室，使初始实验细胞浓度在 0.5 mL 室中为 157 · 106 至 210 · 106 x·mL-1，在 2.0 mL 室中为 164 · 106 至 220 · 106 x·mL-1（有关基本单位 x 的详细信息见31）。
      注：一台 Oroboros 仪器在 A 和 B 位置分别装配 sV 和 cV 反应室，与另一台在 B 和 A 位置分别装配 sV 和 cV 反应室的 Oroboros 仪器并行使用。
  4. 透化细胞：人成纤维细胞
    1. 通过部分体积置换将细胞加入 Oroboros 反应室，名义细胞浓度为 0.75 · 106 x·mL-1 （两种反应室均适用），并计算实际浓度（步骤 4.1.3）。
      注：并行使用了多台不同的 Oroboros 仪器，每台仪器分别装配 sV 或 cV 反应室。
  5. 分离线粒体：小鼠心脏
    1. 将 15 µL 线粒体悬液加入 5985 µL 线粒体呼吸介质（MiR05）中，得到线粒体蛋白储备浓度范围为 0.013–0.026 mg∙mL-1。
    2. 通过完全体积置换将线粒体悬液加入 Oroboros 反应室中。
      注：一台 Oroboros 仪器在 A 和 B 位置分别装配 sV 和 cV 反应室，与另一台在 B 和 A 位置分别装配 sV 和 cV 反应室的 Oroboros 仪器并行使用。

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图2通过部分体积置换添加细胞悬液。 (A) 0.5 mL 反应室中的添加步骤V 以及（B2.0 mL 室 cV. (1) 带有呼吸介质体积的密闭室 V 并填充带塞毛细管 Vstc，用于测量仪器本底O2 通量 JO2°. (2塞子移除， Vstc 流入腔室，导致总体积 V'= V+Vstc. (3部分去除培养基 V出 = -VJ.i. 一个体积 V''= V'+V出 留在室中。4移液取体积子样本 VJ.i 将呼吸测定用储备细胞悬液加入腔室，终体积为 V# = V+Vstc 稀释后的细胞悬液。5) 带有填充塞的密闭腔室（死体积） Vstc用于测定体积特异性氧2 通量 JV，O2 在实验体积中 V此图已根据 图2A 细胞计数与HRR中的归一化41. 请点击此处以查看此图的放大版本。

5. SUIT 实验方案

  1. 使用 Hamilton 微量注射器将 补充表 1 中所列化学品的储备溶液滴加到腔室中，调整滴加体积，使 sV 和 cV 腔室中的实验浓度保持一致（参见图 6、图 8 和图 10 的图注）。
  2. 选择实验方案 SUIT-003_D01832,33（本研究中用于血小板）。
  3. 选择实验方案 SUIT-001_D0044,15,34,35 和 SUIT-002_D0074,15,35,36（本研究中用于成纤维细胞）。
  4. 选择实验方案 SUIT-002_D0054,15,35,37（本研究中用于分离的线粒体）。

6. SUIT 数据分析

  1. 在 DatLab 中设置标记，以定义所选图表的各个区段。
  2. 在顶部菜单中选择通量/斜率，打开通量/斜率窗口。应用滴定体积校正，以校正 SUIT 方案中每次滴定对悬浮样品造成的稀释效应。
  3. 从顶部菜单中选择标记，打开标记统计，显示经减去残余氧消耗（rox）进行基线校正后的标记数据点的中位数。
  4. 使用电子表格软件，通过反向回归分析25,28，计算 sV 和 cV 腔室中成对结果之间的截距和斜率。
  5. 使用软件 jamovi 2.3.1338，通过配对样本 t 检验比较 sV 和 cV 腔室中 rox 状态（最低 O2 通量）下的呼吸速率。
    注意：由于 Oroboros 仪器中的两个腔室在功能上相互独立（除温度和 DatLab 记录间隔外），每个 腔室的测量可视为独立进行，类似于使用不同的 仪器。最终结果可报告为多个腔室的中位数或平均值，并附上其变异性信息。

结果

原始信号 R1 [µA氧气传感器（POS）的读数应不受“开放”室中与气相空气处于平衡状态的水相体积影响，这一点已得到证实。 补充表格 2在密闭腔室中，仪器背景O2 接近空气饱和的通量 J°1 [pmol∙s-1∙mL-1] 取决于体积 V (补充表格 2）。O2 传感器的消耗量 [pmol∙s-1] 可根据零点校正后的原始信号 R1-R0 测得的电子流进行预测 [µA]，电荷数 4 e-/02 以及法拉第常数 F = 96 485.33 C∙mol-1. 1 µA 相当于电子流（e-10.36 pmol∙s-1. 除以电荷数可得到一个 O2 流15,39 2.591 pmol∙s-1·µA-1. 记录的 R1-R0 中位数为 2.09 µA 和 1.98 µA 分别在0.5 mL和2.0 mL的反应室中（补充表格 2；R0 = 0.006 ± 0.007 µA 在 sV 且 R0 = 0.004 ± 0.003 µA 在 c 中V 腔室），理论上对应于 O2 5.41 pmol的消耗速率∙s-1和 5.13 pmol∙s-1. O2 传感器的流速被转换为空气饱和条件下预期的体积特异性通量（J°R1) 为 5.41 pmol∙s-10.5 mL = 10.82 pmol∙s-1∙mL-1 和 5.13 pmol∙s-1/2.0 mL = 2.56 pmol∙s-1∙mL-1 在 sV 和 cV 室分别。在2.0 mL和0.5 mL chamber中使用相同类型的极谱式氧传感器时，其体积特异性背景O₂2 通量 - 由电流 R1-R0 计算得出J°R1）——理论上会因腔室体积的倒数关系而增加4倍。 J°空气 （在空气饱和条件下，此时反向扩散为零；比较 Table 2 和 补充表格 3) 针对 O 进行了计算2 空气饱和浓度由实验背景测试的线性回归确定（图3). J°空气 接近理论预期值 J°R1 两个腔室均（Table 2）。该 J°空气 / J°R1 比值为0.85 ± 0.04 和 0.92 ± 0.12 在 s 中V 和 cV 分别在2.0 mL室中进行的一系列独立测量（共52次）也与此一致，其中该比值为0.95 ± 0.12 (补充表格 4). J°空气 在0.5 mL室中比在2.0 mL室中高3.9倍。净O2 反向扩散 J°50，计算于 50 µM O2 来自实验背景测试的线性回归结果显示，在0.5 mL反应室中，该值仅高出三倍Table 2）。仪器背景氧的变异性2 两种不同腔室体积中的通量几乎相同，标准差（SD） 0.5 和 0.3 pmol∙s-1∙mL-1 用于 J°空气 0.9 和 0.8 pmol∙s-1∙mL-1 用于 J°50 在 sV 和 cV 室，分别（Table 2）。尽管仪器本底较高 O2 0.5 mL chamber 中的斜率，背景 O2 通量在 cO2 在两种培养室中均具有高度可重复性（图3D。这会导致残差值较低 <±1 pmol∙s-1∙mL-1两个腔室均（补充表格 5)，符合Oroboros检测限的要求28.

我们量化了搅拌速度对POS在350 rpm（5.8 Hz）至950 rpm（15.8 Hz）范围内以100 rpm（1.7 Hz）为步长时校准原始信号R1的影响，实验在腔室处于“开放”配置下进行。在此配置中，O2 溶解在培养基中的气体与气相处于平衡状态；因此，原始信号（微安[µA]) 随搅拌速度的变化并不反映真实的差异 cO2. 氧传感器在默认转速750 rpm下，响应搅拌速度变化时相对于R1仅有微小偏差，且该偏差与腔室体积无关图4）。在“开放”构型中，O的噪声2 斜率，定义为信号稳定后每一步的标准差（SD），在两种腔室中均于850 rpm时最低，当搅拌速度向任一方向偏离该值时，斜率均增加（图5A。在550 rpm以下，O的噪声2 斜率超过了阈值 ±4 pmol∙s-1∙mL-1，定义最低的实用搅拌速度。由于技术限制，未能达到上限，因此将950 rpm定为最高的实用搅拌速度（图 5A）。在此范围内，O的偏差2 来自 R1 的信号 <2.5%。关闭腔室并未改变噪声与搅拌速度之间的关系图5B）。指数时间常数 τ，为2.53 ± 0.05 秒，550 转/分钟，2.50 ± 0.05 秒，750 转/分钟，适用于 0.5 mL 样品室（补充材料 图 3).

应用于血小板的 SUIT-003_D018 方案包含多达 14 步滴定操作。该方案旨在研究活细胞的偶联控制、ce 以及质膜通透性作为细胞活力的指标32。在两种类型的腔室中测得的氧通量（图6）在所有呼吸状态下均高度一致（图7）。需要间歇性重新充氧，以避免功能性缺氧或将实验中的 O2 浓度限制在特定范围内。重新充氧操作在鱼藤酮（Rot）滴定完成后通过将腔室打开至“开放”位置实现。关闭腔室后，2.0 mL 腔室中的 O2 通量在 4 分钟内即趋于稳定，而 0.5 mL 腔室则需要约 10 分钟才能稳定并设定新的基准值（图6 和 补充图 4）。在 O2 通量较低的 rox 状态下进行重新充氧，可避免在达到稳定所需的时间内 O2 浓度下降。在 sV 和 cV 腔室中，经鱼藤酮抑制后的 rox 值分别为 0.9 ± 0.6 和 2.0 ± 0.6 pmol∙s-1∙mL-1 ，对应的氧浓度分别为 98 ± 17 和 94 ± 17 µM O2 （均值 ± 标准差）。在 sV 和 cV 腔室中，重新充氧至 159 ± 8 和 147 ± 11 µM O2 后，rox 分别升高了 3.1 ± 0.9 和 0.9 ± 0.4 pmol∙s-1∙mL-1 。血小板中观察到的 rox 对氧的依赖性与人成纤维细胞和脐静脉内皮细胞的研究结果一致40。

在透化成纤维细胞的氧化磷酸化（OXPHOS）分析中，我们采用了两种SUIT方案，分别包含最多17步和20步的滴定步骤（SUIT-001和SUIT-002，分别35；图8）；因此，滴定体积校正尤为重要，因为在SUIT-002结束时，sV和cV腔室的最大稀释度分别达到14%和10.5%。在0.5 mL和2.0 mL腔室中，成纤维细胞数量分别为0.35·106 x和1.44·106 x，最终获得相同的细胞浓度，即0.75·106 x∙mL-1。SUIT-001与SUIT-002的联合应用共检测了20种呼吸状态，所有状态在两种腔室类型之间均表现出高度相关性（SUIT-001的r2 = 0.950，SUIT-002的r2 = 0.959）。在两种方案中，复合物IV（Complex IV）的数据均表现出相对较高的离散度（图9）。在SUIT-001中，起始时体积特异性O2 通量较低，为18.7 ± 7.0 pmol∙s-1∙mL-1 （均值 ± 标准差），在“常规” 状态下无需重新供氧，允许O2 浓度下降至56 µM，直至实验方案中与CIV相关的部分（图8A；8Ama）。然而，在SUIT-002中，需在解偶联剂滴定前进行重新供氧，将O2 浓度从100 µM提升至180 µM（图8B；6Gp）。考虑到重新供氧后通量稳定所需时间较长，应避免在解偶联剂滴定过程中进行重新供氧。

采用简化的SUIT方案对分离的线粒体进行检测（图10）。线粒体蛋白浓度在呼吸测定实验后确定，因此无法预先设定反应腔内样品的准确浓度。体积特异性呼吸通量随线粒体浓度变化而变化。因此，数据以体积特异性和蛋白质量特异性通量两种形式呈现（图11）。两种表示方式均显示出在0.5 mL和2.0 mL反应腔中获得的测量结果之间具有高度相关性（图11）。

在使用抗霉素A抑制复合体III后测得的残余氧消耗量rox，可作为仪器在极低呼吸速率下性能的指标。在所有实验系列中，0.5 mL和2.0 mL检测腔之间的rox值具有可比性（血小板：t(5) = -0.34，p = 0.74；成纤维细胞：SUIT-001：t(10) = 20.00，p = 0.06；SUIT-002：t(10) = 11.00，p = 0.96；分离的线粒体：t(4) = -1.18，p = 0.27）。数据的离散程度主要对应于仪器的不确定度±1 pmol∙s-1∙mL-1 13,28，如图12所示。原始文件可在Zenodo数据库中开放获取：10.5281/zenodo.11634408。

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图3仪器背景信号 O2 s的通量V （0.5 mL；绿色和黑色）以及 cV 腔室（2.0 mL；蓝色） O2 浓度范围从空气饱和（约 180 μM约 50 µM. 空心符号：O2 未加连二亚硫酸钠时测得的浓度。实心 符号：O2 由连二亚硫酸钠手动滴定控制浓度。黑色圆圈： O2 通过TIP2k使用连二亚硫酸钠滴定，在0.5 mL体系中控制浓度 腔室（N = 8）。仪器本底测试的结果汇总自（A系列 1 (sV: N = 2；cV: N = 2）在使用活细胞（ce）之前；（B系列 2（sV: N = 38; cV: N = 50）后使用透化细胞（pce）；（C系列 3（sV: N = 10；cV: N = 10）后使用分离的线粒体（imt）。D) 叠加自各图面板的数据 A-C。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图4：搅拌转速对0.5 mL腔室（绿色）和2.0 mL腔室（蓝色）在空气饱和状态（“开放”腔室）下POS信号的影响。响应值 [%] 相对于750 rpm时经R0校正的空气标定信号R1-R0 [µA]（sV：N = 4； cV：N = 4）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：O2 斜率噪声随搅拌转速的变化。 噪声以标准差表示，分别为（A）“开放”室；（B）封闭室（0.5 mL，绿色；2.0 mL，蓝色）。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-4
图6O2 0.5 mL腔室中冷冻保存的人血小板的消耗 O的代表性轨迹2 浓度 [µM]（蓝线）和 O2 每细胞流量 [amol∙s-1∙x-1] 计算为 O2 通量 [pmol∙s-1∙mL-1] 除以细胞浓度 157∙106 x∙mL-1 （红色线条，已校正仪器背景O2 通量；由...引起的尖峰 滴定被消除）。O2 浓度保持在以上 50 µM 间歇性地 复氧（空气，开放室，蓝色阴影）。呼吸状态序列（滴定） 和速率；方案 SUIT-003_D018) ce1，常规 呼吸作用 R 活细胞 ce1P, 5 mM 丙酮酸作为外源底物。 ce2Omy10 （面板 A），Omy滴定以5 nM为步长；漏液 呼吸作用 L. ce3U0.3 （面板 A）和 ce3U0.1 （面板 B），解偶联剂滴定至 最佳CCCP浓度为0.3和 0.1 µM，分别；ET 容量 E. ce3Glc, 葡萄糖 11 mM E 被解偶联剂逐渐抑制。 ce4旋转鱼藤酮 0.5 µM 抑制复合体 I；残余氧消耗 rox. ce5S，琥珀酸 10 mM；刺激 E 在 细胞膜通透性细胞 1挖15 （面板 A）和 1挖10 （面板 B)，皂苷 滴定在 5 µg·mL-115 和最佳浓度的步骤 10 µg·mL-1分别 用于完全的质膜透化；琥珀酸盐途径电子传递能力 SE. 1c细胞色素 c 10 µM线粒体外膜完整性检测 2Ama抗霉素A 2.5 µM 抑制复合体III； rox. 请点击此处以查看此图的放大版本。

figure-results-5
图7：0.5 mL和2.0 mL反应室中测定的冷冻保存人血小板呼吸的相关性 Rox校正的 O2 流程在方案 SUIT-003_D018 中进行评估（图6); N = 6. (A) 使用寡霉素 Omy；(B) 无 Omy 时的平均斜率 figure-results-6 和截距 figure-results-7 倒置最小二乘回归及决定系数 r2 根据所有数据计算得出。黑色虚线表示恒等线。红色线表示计算得到的回归线。O2 加入葡萄糖后处于该状态下的流被排除（参见 图6）。含寡霉素与不含寡霉素的实验方案分别展示于不同图中 A 和 B 以避免数据点重叠。 请点击此处以查看此图的放大版本。

figure-results-8
图8O2 0.5 mL chamber 中成纤维细胞的消耗量 代表性轨迹 cO2 （蓝色线条[μM]) 和 O2 每细胞流量计算为 O2 通量 [pmol∙s-1∙mL-1] 除以细胞浓度（0.75·106 x∙mL-1），并校正仪器背景O2 通量（红色线条，滴定引起的尖峰已被消除）。O2 浓度保持在以上 50 μM 通过间歇性再氧合（空气，“开放”室，蓝色阴影）进行。呼吸状态序列（滴定及速率）。A方案 SUIT-001_D004： ce1，常规 呼吸作用 R. +Dig，皂苷素 10 μg·mL-1 （细胞外聚合物转化为颗粒状细胞外聚合物），残余内源呼吸 仁. 1PM，丙酮酸钠 5 mM & 苹果酸 2 mM；N通路泄漏 呼吸作用 NL. 二维，ADP 2.5 mM；N通路氧化磷酸化能力 NP. 2c细胞色素 c 10 μM线粒体外膜完整性检测。 3U1.5，以确定最佳CCCP浓度的解偶联剂滴定 1.5 μM；NADH连接的电子传递链容量 NE. 4G，谷氨酸 10 mM；N(PGM)E. 5S, 琥珀酸 10 mM；NS途径电子传递能力 NSE. 6Rot鱼藤酮 0.5 μM；琥珀酸盐途径电子传递能力 SE. 7Gp，10 mM 甘油磷酸盐；SGpE. 8Ama抗霉素A 2.5 μM; rox. 9AsTm，抗坏血酸 2 mM & TMPD 0.5 mM；细胞色素c氧化酶（CIV）激活底物；反应室保持开放20分钟，以实现氧化还原平衡，同时避免氧气耗尽4；O2 关闭培养室后通量超出量程（205 amol·s-1·x-1). 10Azd，叠氮化物 100 mM；氧依赖性化学背景通量 中国台湾. (B方案 SUIT-002_D007： ce1, R. +Dig, 任. +D，刺激 任. +M.1，苹果酸 0.1 mM 和 10月1日，辛酰肉碱 0.5 mM；F通路氧化磷酸化能力 FP = J(10月1日)J(+M.1) 1c. 2M2，2 mM 苹果酸支持的回补性 N 途径；F(N)P. 3P 和 4G，向纤连蛋白的逐步活化P. 5S，FNSP. 6Gp，FNSGpP. 7U1.5，FNSGpE. 8Rot，SGpE. 9Ama, rox. 10AsTm O2 通量超出量程 207 amol·s-1·x-1. 11Azd, 中国台湾通常，复合体 IV 活性为反应速率之差， J(AsTm)-J（Azd）在紧密匹配的 O2 浓度。参见 图6 有关更多详细信息。 请点击此处以查看此图的放大版本。

figure-results-9
图9：0.5 mL和2.0 mL腔室中透化成纤维细胞呼吸作用的相关性。 经Rox校正的O2通量在(A) SUIT-001_D004和(B) SUIT-002_D007中的结果（N = 6）。所有数据经反向最小二乘回归分析得到的平均斜率 figure-results-10 和截距 figure-results-11，以及决定系数r2。黑色虚线表示恒等线。红色线表示计算得到的回归线。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-12
图10：0.5 mL（绿色）和2.0 mL（蓝色）腔室中分离的小鼠心脏线粒体的O2消耗。代表性曲线显示（A）线粒体蛋白浓度为0.023 mg∙mL-1时的单位质量O2通量（已校正仪器背景O2通量，滴定引起的尖峰已被消除）以及（B）O2浓度[μM]。按照SUIT-002_D005方案依次建立的呼吸状态（滴定及速率）：imt，残余内源性呼吸 ren；+D，加入ADP（2.5 mM），刺激ren；+M.1，加入苹果酸（0.1 mM）和1Oct，辛酰肉碱（0.5 mM）；F通路氧化磷酸化能力FP = J(1Oct)-J(+M.1)；1c，细胞色素c（10 μM）；检测线粒体外膜完整性；2M2，高浓度苹果酸（2 mM），支持补碳的N通路；F(N)P；3P，丙酮酸（5 mM）；FNP；4G，谷氨酸（10 mM）；FNP；5S，琥珀酸（10 mM）；FNSP；6Gp，甘油磷酸（10 mM）；FNSGpP；7U0.5，逐步加入解偶联剂至CCCP最适浓度（0.5 μM）；FNSGpE；8Rot，鱼藤酮（0.5 μM）抑制复合体I（CI）；SGpE；9Ama，抗霉素A（2.5 μM）抑制复合体III（CIII）；残余氧消耗rox。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-13
图11：在0.5 mL和2.0 mL腔室中测定的分离小鼠心脏线粒体呼吸的相关性。 按照图10所示方案测得的O2通量（N = 4）。(A) 体积特异性O2通量。(B) 经Rox校正后的O2通量除以线粒体蛋白浓度（0.013 - 0.026 mg∙mL-1）。均值斜率 figure-results-14 和截距 figure-results-15由逆向最小二乘回归计算得出，并基于所有数据计算决定系数r2。黑色虚线表示恒等线。红色线表示计算得到的回归线。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-16
图12：0.5 mL和2.0 mL检测室中残余氧消耗速率 rox。在加入抗霉素A后测得的体积比通量，数据综合了活细胞（ce，方块）、透化细胞（pce，圆圈）和分离线粒体（imt，三角形）的实验结果。平均斜率 figure-results-17 和截距 figure-results-18 由反向最小二乘回归计算得出。虚线：恒等线。红线：计算得到的回归线。阴影区域：仪器分辨率范围。请点击此处查看该图的放大版本。

模块sVcV
实验腔室体积 V0.5 mL2.0 mL
玻璃圆筒内径12.0 mm16.0 mm
玻璃圆筒外径24.0 mm24.0 mm
玻璃壁厚度6.0 mm4.0 mm
PVDF涂层搅拌子11.5 x 6.2 mm15.0 x 6.0 mm
塞子毛细管直径1.00 mm1.30 mm
塞子毛细管横截面积0.79 mm21.33 mm2
塞子毛细管长度50.64 mm48.86 mm
塞子毛细管体积39.8 µL64.9 µL
塞子毛细管死体积 Vstc（包含一小滴液体）a0.04 mL0.07 mL
体积校准用体积 V´ 0.54 mL2.07 mL

a液滴体积应为5 µL，对应于小室cV，而小室sV则接近0 µL。
表1：采用聚醚醚酮（PEEK）密封垫的小体积（sV）和经典体积（cV）模块的尺寸。

J°air / [pmol∙s-1∙mL-1]J°50 / [pmol∙s-1∙mL-1]
实验腔室体积 V0.5 mL2.0 mL0.5 mL2.0 mL
平均值9.222.37-3.17-1.17
中位数9.252.36-3.08-1.04
标准差0.490.340.930.83
最小值8.201.79-5.11-3.72
最大值10.413.42-0.820.67

表2：外推至空气饱和状态的J°air以及在50 μM O2浓度下计算的J°50。 第2系列（pce）和第3系列（imt）仪器本底测试的汇总数据，以及TIP2k 滴定前的数据（0.5 mL：N = 48；TIP2k：N = 8；2.0 mL：N = 60）。

补充文件 1：样品制备。 人血小板、人成纤维细胞以及从小鼠心脏中分离的线粒体。 请点击此处下载该文件。

补充图1：使用TIP2k进行仪器O2背景检测。 使用TIP2k在0.5 mL样品室中滴定Na-连二亚硫酸盐（2.5 mM）的代表性检测曲线。介质：MiR05，温度：37 °C，搅拌速度：750 rpm。滴定引起的信号尖峰已被消除。请点击此处下载该文件。

补充图2：仪器背景O2 通量 J°1 作为O的函数2 浓度 腔室 sV （0.5 mL；绿色， N = 48）和 Chamber cV （2.0 mL；蓝色， N 系列2（pce，圆圈）和系列3（imt，三角形）中n = 60，以及在0.5 mL样品池中进行TIP2k滴定前（黑圈， N = 8）。红线：中位数 ± SD 请点击此处下载此文件。

补充图3：指数时间常数τ随搅拌转速的变化关系。 在37 °C条件下，0.5 mL样品室的各个τ值（N = 2）。在0.5 mL样品室中，550 rpm时τ为2.53 ± 0.05 s，750 rpm时为2.50 ± 0.05 s，850 rpm时为2.47 ± 0.04 s。请点击此处下载该文件。

补充图4：O2 2.0 mL 室中冷冻保存的人类血小板的消耗 SUIT-003_D018 方案的代表性轨迹，包括寡霉素滴定（Omy）。通量 [pmol∙s-1∙mL-1] 已校正仪器本底信号2 通量除以细胞浓度（164∙106 x∙mL-1). 滴定引起的峰已被消除。 cO2 保持在以上 60 µM 通过间歇性再氧合（空气，“开放”室，蓝色阴影）进行。呼吸状态序列（滴定及速率）： ce1，常规 呼吸作用 R 活细胞 ce1P，以丙酮酸作为外源底物。 ce2Omy10，Omy滴定以5 nM为步长；漏液 呼吸作用 L. ce3U2.0，解偶联剂滴定至最适浓度 2 µM；ET容量 E. ce3Glc，葡萄糖 11 mM； E 被解偶联剂逐渐抑制。 ce4Rot鱼藤酮 0.5 µM 抑制复合体 I；残余氧消耗 rox. ce5S，琥珀酸盐 10 mM；刺激 E 在细胞质膜具有通透性的细胞中。 1Dig20，皂苷滴定至最适浓度 20 µg·mL-1，用于完全的质膜透化；琥珀酸盐途径电子传递能力 SE. 1c细胞色素 c 10 µM线粒体外膜完整性检测。 2Ama抗霉素A 2.5 µM 抑制复合体III； rox. 请点击此处下载此文件。

补充表 1：底物-抑制剂-解偶联剂滴定（SUIT）方案中使用的化学品。 sV 和 cV 室所用试剂的缩写及储备液浓度。请点击此处下载该文件。

补充表 2：R1-R0 比较与 J°1 在0.5 mL和2.0 mL的腔室中。 第二系列（pce）和第三系列（imt）仪器本底测试的合并数据，以及TIP2k滴定前（0.5 mL）的数据 N = 48；TIP2k： N = 8；2.0 mL： N = 60）。数据仅来自实验系列2（pce）和系列3（imt），这两组实验在平均大气压为94.9 kPa（奥地利因斯布鲁克）的条件下进行，排除了在海平面条件下获得的系列1（ce）的数据。在0.5 mL和2.0 mL反应室中使用了相同类型但不同个体的POS传感器。因此，在比较s时必须考虑传感器之间的变异性V 和 cV 腔室。尽管 J°1 = 2.26 ± 0.41 pmol∙s-1∙mL-1 通过实验测得的2.0 mL室腔结果与计算值高度一致， 实验的 J°1 = 8.48 ± 0.53 pmol∙s-1∙mL-1 0.5 mL 检测室中的数值低于预期，原因如下：关闭检测室后，较高的背景 O2 0.5 mL chamber 中的通量降低 O2 标记处的浓度 J°1 设置为相近的时间间隔（图1）。氧气浓度在 J°1 在0.5 mL和2.0 mL反应室中，平均分别比空气饱和度低4.06%和1.72%（补充图2，补充表2）。在较低 cO2，减弱的O2 传感器消耗以及部分 O2 反向扩散降低实验测定值 J°1. 请点击此处下载此文件。

补充表3：获得校准值（R1）和J°1时的氧气浓度[µM]及其百分比差异。 系列2（pce）和系列3（imt）的仪器本底测试汇总数据，以及TIP2k滴定前的数据（0.5 mL：N = 48；TIP2k：N = 8；2.0 mL：N = 60）。请点击此处下载该文件。

补充表 4：测量值与预期值 J°1 在2.0 mL室中。 独立系列的仪器本底测试，使用O2k系列A（配备钛制塞子）13), V = 2.0 mL (37 °C，含O的NaCl溶液2 溶解度因子 0.92； N = 52). nO2/Qe = 106/(96485.33·4) = 2.591 pmol∙µC-1 = 2.591 pmol∙s-1∙µA-1. 基于以下假设：O2 反向扩散可忽略不计 cO2,1，这只在 cO2,1 ~ cO2*. 请点击此处下载此文件。

补充表5：线性回归残差（绝对值 [pmol O2∙s-1∙mL-1]) 针对每种仪器的 O 计算得出2 背景测试第2组（pce）和第3组（imt）仪器本底测试的汇总数据，以及TIP2k滴定前的测试结果。 请点击此处下载此文件。

讨论

呼吸测定实验中可获取的样品量通常有限，例如在活检组织、原代细胞或细胞数量较少的慢速生长细胞培养物的研究中1此外，由于线粒体损伤，呼吸活性受到抑制11 或在研究呼吸容量较低的线粒体通路时，例如脂肪酸氧化12. 在这些情况下，较低的呼吸测量室体积有助于提高 O₂ 流量检测的分辨率2 通量。然而，仪器的背景氧通量2 在较低的腔室体积下，通量会增加，若未能可靠测量并针对氧浓度进行适当校正，则可能引发误差2 浓度。仪器氧2 背景测试与背景校正对于小体积实验腔室尤为重要。理论值（J°R1）和实验（J°空气) O2 通量为使用4 e的极谱法测量的准确性提供了证据-/2 在 的 阴极 POS 反应。两者之间的差异 J°R1 以及 J°空气 为1.64 ± 0.43 和 0.22 ± 0.31 pmol∙s-1∙mL-1 在 sV 和 cV 分别表明测量的精确度处于2.0-mL chamber的检测限范围内±1 pmol∙s-1∙毫升-1)28. 在 2.0-mL 和 0.5-mL 实验 chamber 中使用相同类型的极谱氧传感器时，单位体积的背景 O₂ 通量2 通量随腔室体积成反比增加4倍，两种腔室体积下的变异程度几乎相同，标准差分别为0.5和0.3 pmol∙s-1∙mL-1 用于 J°空气 和 0.9 与 0.8 pmol∙s-1∙毫升-1 用于 J°50 在 sV 和 cV 室，分别（Table 2）。在最低呼吸活性（小体积 chamber 的设计目标）条件下，即使微小的背景效应也变得显著（补充 Table 3; 补充图 2）。因此，对仪器背景氧通量进行常规评估是必要的2 通量图1) 是进行适当校正所必需的28.

为了维持体系的均一性并保证稳定的氧信号，需要对介质进行高速且持续的搅拌。2.0 mL 搅拌腔的搅拌速度设定为 750 转/分钟（rpm），但 0.5 mL 搅拌腔的最佳搅拌速度尚不明确。由于玻璃腔室与搅拌子在几何结构上的差异（表 2），需对 0.5 mL 腔室的最佳搅拌速度进行独立评估。氧传感器对 550 rpm 至 950 rpm 之间的搅拌速度变化有响应，在 750 rpm 时，O2 信号 R1 仅有微小偏离，且不受腔室体积影响。在相同搅拌速度下，对 Chamber sV 计算得到的指数时间常数 τ 与 2.0 mL 腔室报道的 τ 值一致13。这些结果表明，两种腔室几何结构下的搅拌效率相当，因此 2.0 mL 腔室默认的 750 rpm 搅拌速度可直接应用于 0.5 mL 腔室。在“开放”和“封闭”两种腔室构型下，0.5 mL 腔室均表现出更高的信噪比，提示其具有更高的检测精度，这是 0.5 mL 腔室的一项优势（图 5），尽管个体间 POS 的差异影响尚不能排除。由于将搅拌速度从 750 rpm 降低至 550 rpm 时噪声并未增加，因此在 0.5 mL 腔室中将搅拌速度降至 550 rpm 可能有助于减小剪切应力，同时不损害信噪比。

几乎相同的O₂通量2 在应用适当的背景校正后，于三种实验模型中分别在 0.5-mL 和 2.0-mL 检测室中测定了耗氧速率。使用少量血小板所得的结果 µ直径为 m42，活细胞和透化纤维细胞以及分离的线粒体结果表明，在0.5-mL和2.0-mL chamber中可获得一致的呼吸速率 多种细胞类型和线粒体制备样品中均适用。然而，本研究尚未测试透化肌纤维。准确测量 rox 需要控制氧水平40 且具有高仪器分辨率1. 体积特异性氧2 通量 rox 可能低至检测限。当实验中使用较少的细胞数量或通常较少的样品量时，无需重新氧合。然而，如有必要，建议在氧通量较低的呼吸状态下进行重新氧合2 通量，以避免氧气的快速下降2 稳定 O₂ 所需时间段内的浓度2 通量。氧气2 复氧后的通量在0.5 mL chamber中恢复所需时间更长。

作为质量控制的一部分，在部分换液过程中对悬浮液中样品的稀释需特别注意。在完全插入的塞子被取出后，总体积 V' 呼吸介质在腔室中的体积由实验体积决定 V 以及封口毛细管体积 Vstc (Table 2）。因此，储备体积 VJ. i 在实际体积中被稀释 V'，大于 V，导致稀释倍数 V/V' 0.5/0.54 = 0.926 和 2.0/2.07 = 0.966，分别对应 0.5 mL 和 2.0 mL 气室（图2）。在血小板实验中，使用了 Chamber 的原型塞子 sV 毛细管死体积为0.05 mL，对应的稀释因子为0.909。

在相同样品浓度（单位体积内的量）下，0.5-mL 比 2.0-mL 气室所需的活细胞、透化细胞和分离线粒体的用量少近四倍，经细胞数量或蛋白质量归一化后的呼吸性 O2 消耗量测定结果具有可比性。这表明 Chamber sV 是样品量有限的研究中一种有价值的工具。另一方面，在 Chamber sV 中使用相同量的样品可提高体积特异性 O2 通量，从而在呼吸活性较低时降低测量的不确定性。

本研究中的氧环境仅限于从空气饱和至30 µM的O2 范围。在该范围之外的氧水平下的适用性尚需进一步评估，以研究组织常氧或低氧状态下的线粒体功能43，以及高氧条件下的透化组织9。Oroboros NADH和Q- 模块的多种多传感器配置，以及pH、NO和TPP+-电极10,44，无法适配于sV腔室，仍需使用2.0-mL腔室。

披露

EL 是 Oroboros Instruments 的员工。EG 是 Oroboros Instruments 的创始人兼首席执行官。

在本项目中，Oroboros Instruments 使用了 LFGS。EÅF 和 EE 是位于瑞典隆德的 Abliva AB 公司的员工，该公司与 Oroboros Instruments 持有商业协议。

LR 声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢 Manuela Passrugger 在分离线粒体数据收集方面的贡献，Patrizia Guerth 在搅拌转速测试方面的技术支持，以及 Mateus Grings 对搅拌器测试时间常数的分析。我们感谢我们的合作伙伴奥地利 Kolsass 的 WGT Elektronik GmbH & Co KG 提供玻璃腔室、密封塞和磁场强度的技术参数信息。我们感谢 Luiza HD Cardoso、Alejandra Romero-Martinez、Ondrej Sobotka、Alba Timon-Gomez 和 Jaime Willis 提出的宝贵意见。本研究部分由欧盟“地平线2020”研究与创新计划资助，资助号为 859770（NextGen-O2k 项目）。同时感谢 COST 行动 CA15203 MitoEAGLE 项目提供的短期科学访问计划（LFGS、LR）的财政支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Anaconda3Anaconda Software Distributionhttps://www.anaconda.com/软件
ADPMerck, Germany117105
抗生素-抗真菌素 100倍浓缩液Biosera, FranceXC-A4110警告 H317 可能引起过敏性皮肤反应
抗霉素 ASigma-Aldrich, USAA8674警告 H300  吞咽致命，H400 短期（急性）对水生环境有害 
抗坏血酸Sigma-Aldrich, USAA7631
ATPSigma-Aldrich, USA A 2383
无脂肪酸牛血清白蛋白Sigma-Aldrich, USAA 6003bovine serum albumin
CaCO3Sigma-Aldrich, USAC 4830
CCCPSigma-Aldrich, USAC2759羰基氰化物间氯苯腙 警告 H301 + H311 + H331 吞咽、皮肤接触或吸入有毒
Countess 自动细胞计数仪 Thermo Fisher Scientific, USAAMQAX100
细胞色素 cSigma-Aldrich, USAC7752
DatLab Oroboros Instruments, AustriaVersion 7.4用于数据采集与分析的软件
DatLab Oroboros Instruments, AustriaVersion 8.1用于数据采集与分析的软件
DC 蛋白检测试剂盒Bio-Rad, USA5000112蛋白检测试剂盒；警告 H314 可引起严重皮肤灼伤和眼睛损伤
皂苷Sigma-Aldrich, USAD5628警告 H301 吞咽有毒
二硫苏糖醇Sigma-Aldrich, USAD 0632警告 H318 可引起严重眼睛损伤
DMEMPan Biotech, GermanyP04-05551Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基
DMSOSigma-Aldrich, USAD2650二甲基亚砜
DPBSLonza Bioscience, SwitzerlandLONBE17-512F无钙 Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液
EGTASigma-Aldrich, USAE 4378
FBSThermo Fisher Scientific, USAA5256701胎牛血清
葡萄糖Sigma-Aldrich, USA G7528
谷氨酸 Sigma-Aldrich, USAG1626
甘油磷酸Santa Cruz Biotechnologysc-215789
Heraeus Multifuge 3s LargeThermo Fisher Scientific, USAHM3S离心机
Hettich Rotina 380R Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Germany1701离心机
咪唑Honeywell Fluka, Austria56750警告 H302 吞咽有害，H314 可引起严重皮肤灼伤和眼睛损伤，H360D 可能损害未出生婴儿
jamovi The jamovi projectVersion 2.3.13软件
K+-MESSigma-Aldrich, USAM 8250
Leucosep 管 Greiner Bio-One GmbH, AustriaZ642843-300EA带聚乙烯屏障的离心管
苹果酸 Sigma-Aldrich, USAM1000警告 H319 可引起严重眼睛刺激。
甘露醇Sigma-Aldrich, USAM 4125
MgCl2 Scharlau, SpainMA 0036
MiR05-试剂盒Oroboros Instruments, Austria60101-01线粒体呼吸介质
Mixer Swelab Instruments, Sweden440S摇床
Mr. Frosty 冷冻容器Thermo Fisher Scientific, USA5100-0001冷冻容器
OroborosOroboros Instruments, AustriaNextGen-O2k 和 O2k 统称为 ‘Oroboros’
Oroboros Chamber cVOroboros Instruments, Austria23100-01经典体积腔室
Oroboros Chamber sVOroboros Instruments, Austria33100-01小体积腔室
Oroboros TIP2k-模块Oroboros Instruments, Austria11100-03滴定-注射微泵
O2-Zero 粉末Oroboros Instruments, Austria26600-02 Na-连二亚硫酸盐 警告 H251 自热：可能起火，H302 吞咽有害，H319 可引起严重眼睛刺激
辛酰肉碱Biotrend - APExBIO Technology, GermanyB6371
寡霉素Sigma-Aldrich, USAO4876
磷酸肌酸Sigma-Aldrich, USAP 7936
丙酮酸Sigma-Aldrich, USAP2256警告 H317 可能引起过敏性皮肤反应
鱼藤酮Sigma-Aldrich, USAR8875警告 H300 吞咽致命
皮肤成纤维细胞系  ATCC, USA
叠氮化钠Sigma-Aldrich, USAS2002警告 H300 + H310 + H330 吞咽、皮肤接触或吸入致命
枯草杆菌蛋白酶 ASigma-Aldrich, USAP 5380警告 H318 - 可引起严重眼睛损伤，H334 - 吸入可能引起过敏或哮喘症状或呼吸困难
琥珀酸Sigma-Aldrich, USAS2378
蔗糖Sigma-Aldrich, USAS 7903
Swelab Alfa 血细胞计数仪 Boule Diagnostics AB, Sweden1420041
牛磺酸 Sigma-Aldrich, USAT 0625
Tecan Infinite TM F200Tecan, Switzerland分光光度计
TMPDSigma-Aldrich, USAT3134N,N,N',N'-四甲基对苯二胺二盐酸盐 警告 H315 可引起皮肤刺激，H319 可引起严重眼睛刺激
胰蛋白酶Sigma-Aldrich, USAT4799警告 H334 吸入可能引起过敏或哮喘症状或呼吸困难
VacuetteGreiner Bio-One GmbH, Austria15452520

参考文献

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