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方法文章

快速 体内 利用斑马鱼胚胎中的白血病细胞移植预测药物反应

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DOI：

10.3791/67451

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2025年5月23日

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1Charité-Universitätsmedizin Berlin, Klinik für Pädiatrie m.S. Onkologie/Hämatologie, 2German Cancer Consortium (DKTK), partner site Berlin, and German Cancer Research Center (DKFZ)

本文内容

摘要

本方案提供了从细胞系和新鲜患者样本在短暂免疫抑制的斑马鱼胚胎中建立人急性淋巴细胞白血病（ALL）异种移植模型并进行问题排查的逐步操作指南，同时包含使用流式细胞术评估药物反应的指导原则。该实验流程也可根据需要调整用于实体瘤研究。

摘要

斑马鱼异种移植是一种研究人类癌症发病机制并预测个体药物反应的关键技术。本文介绍了一种简化的实验流程（ZefiX），用于在短暂免疫抑制的斑马鱼胚胎中扩增原代B细胞前体急性淋巴细胞白血病（BCP-ALL）患者样本或永生化细胞系，并利用流式细胞术对治疗反应进行高分辨率的单细胞分析。与实体瘤移植相比，白血病细胞在实验过程中显著受益于基于吗啉代反义寡核苷酸的巨噬细胞和中性粒细胞分化因子的抑制。对解离后的移植物细胞进行流式细胞术分析，可对每个细胞的细胞数量、增殖速率和活力进行精确评估。该方法已使用靶向治疗药物（如维奈托克和达沙替尼）进行了验证，并将治疗结果与相应患者样本的临床记录及传统的二维培养对照进行了比较。值得注意的是，该方案 可在7 天内完成，符合临床决策的时间要求。该方法可适用于多种癌症类型（包括实体瘤）中特定药物的测试，从而支持个体化治疗策略的制定。然而，由于斑马鱼胚胎中的药代动力学限制，可同时评估的药物数量存在一定的局限性，需予以考虑。

引言

斑马鱼异种移植已成为研究癌症发病机制和预测药物反应的重要体内模型1,2,3,4,5。动物模型在临床前药物测试中仍至关重要，而斑马鱼模型相较于其他体内系统具有显著优势，包括高通量和高成本效益6,7,8。 该模型还可辅助个性化治疗反应的预测，包括分子靶向治疗和CAR-T细胞治疗9,10,11,12。

BCP-ALL 尤其可以从斑马鱼异种移植中获益，因为原代患者细胞在体外培养中扩增仍然具有挑战性13。急性淋巴细胞白血病（ALL）迫切需要新的治疗方法。尽管儿童 BCP-ALL 的缓解率高达 80%–85%，但复发或难治性疾病的患者长期生存率仅为约 30%–60%14,15,16。在此类情况下，使用本方案提出的药物筛选流程可整合到临床实践中，以确定最佳的个体化治疗方案14,15。当面对多重耐药情况时，这种个体化治疗策略至关重要，可通过避免使用无效或次优且具有严重副作用的药物，显著减轻患者的治疗负担。

斑马鱼胚胎异种移植模型具有多个优势。人类与斑马鱼之间的遗传相似性较高，两者具有70%的基因同源性以及84%的疾病相关基因共享，这为基因-药物相互作用研究提供了有力支持。17因此，利用转基因宿主胚胎可以揭示影响药物敏感性的遗传倾向18. 或者，可移植具有特定基因修饰的细胞，以评估药物敏感性或耐药性是否与 体外 研究结果表明，斑马鱼胚胎异种移植模型还能揭示药物潜在的全身性效应。尽管2-3天龄胚胎的器官发育尚未完全成熟，但其器官定位正确，并在部分细胞组成上与其成体对应器官具有相似性。19.

该模型的其他优势包括：仅需少量癌细胞即可实现移植；宿主胚胎的维持操作简便，因为在出生后的前5天内无需喂养；并且由于胚胎具有透明性和适宜的尺寸，可快速评估注射是否成功。一个独特的特点是，在此发育阶段仅先天性免疫系统处于活跃状态，这有助于实现高效的移植20。本文所述的ZefiX实验方案（参见图1中的总结）通过在生命最初4天内使用靶向spi1和csf3r的稳定型吗啉代反义寡核苷酸抑制先天性免疫系统，进一步增强了免疫缺陷状态，从而阻断巨噬细胞和中性粒细胞的分化21,22,23。

该方案还不同于以往的斑马鱼异种移植方案，后者主要是为实体瘤移植而开发，通常采用基于整体成像的药物反应评估方法。ZefiX 针对液体肿瘤细胞（如 BCP-ALL 细胞）进行了优化，并已成功用于扩增新鲜或新鲜冷冻的患者样本21。通过选择适当的组织解离酶，ZefiX 也可适用于贴壁型癌细胞。

另一个主要优势是使用流式细胞术进行下游分析，该方法具有多项优点：（i）可快速处理大量移植物细胞，从而在单细胞水平上实现可靠的统计分析；（ii）可在单个细胞中同时评估增殖速率和存活率；（iii）流式细胞仪在临床研究环境中普遍可用，可在数小时内实现对移植物细胞在单细胞水平上的药物反应评价。为确保可重复性，本方案提供了一条从制备、移植到流式细胞术分析的标准化流程，可在一周内实现对急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞的药物反应预测。

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方案

所有斑马鱼实验均符合柏林夏里特大学医学中心实验医学研究所的指导方针及官方机构的规定。所有研究均使用斑马鱼胚胎。 < 受精后6天（dpf），此阶段免于适用《动物保护法》。斑马鱼（斑马鱼在德国柏林夏里特医学院（Charité-Universitätsmedizin Berlin）的动物实验中心，按照标准操作规程饲养和维持斑马鱼。饲养环境温度为 28 °C，光照周期为 14 小时光照和 10 小时黑暗。所有实验均使用 AB 或 TüLF 品系的野生型斑马鱼。

注意：在将每种所需药物应用于ZefiX之前，需建立其最佳处理条件，该过程包括多个必要步骤。首先，使用合适的细胞系在传统的二维（2D）培养系统中确定每种药物的半数抑制浓度（IC50）。根据以往经验，ZefiX处理中有效的药物浓度可能比常规细胞培养条件下使用的浓度高5至50倍21,24。在处理移植胚胎之前，必须 使用已确定的浓度范围，在未移植的宿主胚胎中评估药物的毒性。在评估毒性后，将携带细胞系移植的胚胎暴露于一系列围绕此前在2D培养中确定的IC50值50倍左右的药物浓度中。如果移植的细胞在高达IC50值100倍的剂量下仍无反应，则可认为该药物对ZefiX无效。为可能增强疗效，一种选择是在将细胞移植入胚胎前短时间内用药物对移植细胞进行预处理25。所有本研究中使用的溶液详见表1。

1. 第1天：实验准备工作

  1. E3 培养基的配制：准备 2 L 经高压灭菌的 E3 培养基，用于胚胎维持。
  2. 吗啉代反义寡核苷酸（MO）的配制：使用无核酸酶的水，在 1.5 mL 微量离心管中配制含有两种 MO 的 50 µM 储存液。将储存液在室温（RT）下保存。通过将溶液在 65 °C 的加热块上孵育 10 分钟，制备用于注射的 MO 溶液。
    注意：这些 MO 靶向 spi1 和 csf3r，以抑制巨噬细胞和中性粒细胞的分化，如参考文献22,23,26 所述。
  3. 注射用培养皿的制备
    1. 为制备 4–5 个培养皿，将 1% 琼脂糖溶解于 E3 培养基中，配制成 100 mL 溶液。对于移植用培养皿，将约 20 mL 该溶液倒入每个 10 cm 的培养皿中，确保填充至一半。轻轻旋转以使液体均匀分布。
    2. 对于吗啉代注射用培养皿，将注射模具放置于两个培养皿中的液态琼脂糖上，确保无气泡产生。通过倾斜盖子的方式盖上皿盖，并在室温下静置，直至琼脂糖完全凝固。凝固后，移除模具，并将培养皿倒置存放于密封塑料袋中，于 4 °C 保存。
  4. 注射针的制备
    1. 用于吗啉代注射：使用拉针仪从 10 cm 毛细管中制备注射针，并折断针尖，使其直径约为 10 µm（如参考文献27 所述）。
    2. 用于细胞移植：使用市售的预拉制钝头注射针，外径为 20 µm。
  5. 移植物细胞培养：在 T175 细胞培养瓶中，使用添加 10% 胎牛血清（FCS）和 1% 青霉素/链霉素（P/S）的 RPMI 完全培养基（RPMI-complete），于第 4 天将细胞（例如 Nalm6）传代，目标密度为 70%–80%。使用前需传代 3–4 次，以确保适当的增殖速率。
    注意：关于新鲜或新鲜/冷冻患者样本的移植前处理步骤，详见第 4.3 步。细胞在移植当天进行制备。
  6. 斑马鱼繁殖：于下午将野生型斑马鱼放入繁殖缸中，雄鱼与雌鱼分开饲养。
    注意：斑马鱼的饲养与发育阶段划分参照参考文献28 所述。时间单位（hpf 或 dpf）表示受精后小时或受精后天数。

2. 第2天：Morpholino 注射

  1. 在500 mL经高压灭菌的E3培养基中加入1%青霉素/链霉素（E3/P/S），并倒入两个10 cm的培养皿中。将注射用培养皿 从冰箱中取出，于室温下预热。
  2. 错开繁殖罐的隔板开口时间，使受精仅在部分繁殖罐中分批进行（根据注射速度而定），以确保在单细胞阶段及时对斑马鱼胚胎进行Morpholino溶液的显微注射28,29。开始时根据注射器速度打开一个或两个隔板，当一批卵完成注射后，再打开另外一至两个隔板，依此类推。
  3. 将受精卵以每批约100枚的方式、尽量去除多余液体后转移至预先准备好的注射用培养皿中。将胚胎沿培养皿的凹槽排列整齐。
  4. 在单细胞阶段，向每个胚胎的细胞或细胞下方的卵黄囊内注射1 nL体积、浓度为50 µM的两种Morpholino混合溶液29。注射足够数量的卵以满足后续实验需求（例如，为获得一个96孔板所需的样本量，可注射最多200枚卵，以备移植前可能出现的损失）。
  5. 将注射后的卵转移至含有E3/P/S的培养皿中，在28 °C条件下孵育。保留未注射的卵作为对照组鱼，用于5天龄幼鱼（5 dpf）的流式细胞术分析。将剩余的E3/P/S培养基储存于4 °C环境中。

3. 第3天：去卵膜

  1. 斑马鱼胚胎去壳：使用两把精密镊子，在胚胎发育超过24 hpf时手动去壳29。
    1. 用巴斯德移液管从培养皿中移除已死亡的胚胎，这些胚胎无心跳或运动，外观浑浊，或形态不规则。
    2. 用精密镊子夹住卵膜以固定其位置。在精密镊子尖端附近夹住卵膜，同时用第二把镊子固定胚胎，然后小心地将卵膜拉开，释放出胚胎
      注意：对于发育小于24 hpf的胚胎，去壳时应将其置于琼脂糖包被的培养皿中，以防止其粘附到塑料表面。推荐采用手动去壳法，因其对胚胎更为温和。另一种酶解去壳方法见其他文献30。
  2. 将去壳后的胚胎在28 °C条件下孵育过夜。

4. 第4天：异种移植与药物处理

  1. 宿主胚胎的制备：从冰箱中取出准备好的琼脂糖平板以及E3/P/S溶液，置于室温下使其恢复至室温。在48 hpf时，使用体视显微镜筛选处于适当发育阶段的胚胎。仅选用发育阶段正确且形态正常的胚胎进入后续实验流程，具体标准参见其他文献描述。29统计所有健康胚胎并规划后续处理。在28 °C条件下，每个10 cm培养皿中培养的胚胎数量不得超过100个，以避免因氧气不足导致胚胎发育速度不均。
    注意：细胞系请遵循步骤 4.2；新鲜或冷冻样本请直接进行步骤 4.3。
  2. 细胞系的制备
    1. 为进行流式细胞术和移植实验，准备荧光标记的BCP-ALL细胞：用1×PBS洗涤步骤1.5中的细胞： 以 350 x g 离心 g 5 分钟，然后在 20 中重悬 mL PBS
    2. 计数细胞并转移 3 x 105 将未染色的细胞放入FACS管中，用于第0天（注射后0天，dpi）的流式细胞术分析。置于冰上保存。
    3. 接种 3 x 10⁶ 个细胞5 在6孔板的一个孔中加入3 mL RPMI完全培养基，接种细胞，于37 °C培养至3 dpi作为对照。
    4. 转移 1 × 107 将细胞转入15 mL离心管用于CTV标记。在350 x g 室温孵育5分钟，倒出上清液（剩余部分用移液器吸除），将沉淀重悬于2.5 mL含1 µL CTV储存液的PBS（室温）中。
    5. 在37 °C避光孵育5分钟，加入12.5 mL完全RPMI培养基终止反应，然后在37 °C避光继续孵育10分钟。
    6. 350 x g 离心 g 室温下孵育5分钟，加入10 mL RPMI-完全培养基洗涤一次。再次离心后，重悬于10 mL RPMI-完全培养基中。
    7. 使用10 µm滤器，以350 x g离心过滤细胞 g 5分钟。重悬细胞沉淀，计数细胞，并转移3 x 105 将CTV标记的细胞加入FACS管中。每孔加入3 mL RPMI完全培养基，接种3×10⁵个细胞至6孔板的一孔中，于37°C培养  3 dpi 增殖对照。将剩余细胞置于 1 mL PBS 中，冰上保存，直至移植。
  3. 新鲜/冷冻患者样本的制备
    1. 预先将两个15 mL离心管各加入10 mL RPMI-complete培养基，并在37 °C下预热。解冻一支含有5-10 x 10⁶个细胞的冻存管。6 在37 °C水浴中处理细胞。
    2. 当仅剩少量冰时，将细胞转移至含有预热培养基的离心管中。在350 x g 室温孵育5分钟，弃上清，将沉淀重悬于第二管预热的RPMI完全培养基中。
    3. 使用台盼蓝计数活细胞。取1×10^5个细胞分装至1.5 mL离心管中，离心该细胞悬液 细胞置于FACS管中，350 × g离心 g 室温孵育5分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于300 µL PBS中。
    4. 将重悬的等分试样置于冰上保存，作为流式细胞术分析的未处理对照。
      注意：如果样本量足够，可在培养中保留未经处理的对照组，并于第7天进行流式细胞术检测。
    5. 将1 µL CTV储备液加入2.5 mL PBS（室温）中，用于每1 × 106 细胞。若细胞数量较少，可调整CTV储备液的体积。
    6. 在37 °C避光孵育细胞与CTV 5分钟，加入12.5 mL预热至37 °C的RPMI完全培养基终止反应，随后在37 °C避光孵育10分钟。
    7. 以 350 x g 离心细胞 g 在室温下孵育5分钟，用10 mL RPMI-complete培养基洗涤细胞一次。再次以350 × g离心 g 在室温下孵育5分钟，然后将细胞重悬于10 mL RPMI完全培养基中。
    8. 使用10 µm滤器将细胞悬液过滤至一个新的50 mL离心管中，并在350 x g条件下离心 g 5 分钟。
    9. 不要丢弃上清液。重悬沉淀并计数细胞。转移 3 x 105 将CTV标记的细胞加入一个FACS管中。
    10. 将剩余细胞在 350 x g 室温孵育5分钟，弃去上清液。将剩余细胞重悬于1 mL PBS中，冰上保存备用，用于移植。
      注意：如果仍有足够的CTV阳性细胞，可将其与异种移植瘤平行进行二维培养，以比较增殖速率。
  4. 流式细胞术检测
    注意：为了尽量减少细胞在移植前于冰上放置的时间，0 dpi 时的流式细胞术应由第二位操作人员完成。在使用指定的染色组合（CTV、CD19-Alexa488、APC-Annexin V 和 7AAD）进行首次流式细胞术检测之前，需根据制造商说明书进行补偿对照实验。
    1. 准备两个FACS管，具体如下： 管1：未染色对照细胞； 管2：用CTV、CD19、7AAD和Annexin染色的细胞。
      注意：染色与标记物：CellTrace Violet（CTV）用于区分标记的移植细胞与宿主鱼细胞，并在移植后3天评估其增殖速率。CD19抗体作为细胞表面标志物，可作为识别人B系前体急性淋巴细胞白血病（BCP-ALL）移植细胞的额外标记。对于其他癌症类型，可能需要使用不同的标志物抗体。Annexin V用于标记早期凋亡，以评估细胞活力；7AAD用于标记晚期凋亡或坏死，以评估细胞活力。
    2. 离心管（一支含有CTV染色的细胞，另一支含有未染色的细胞）于350 x g 室温孵育5分钟，弃去1号管中的上清液。将沉淀重悬于310 µL Annexin结合缓冲液（ABB）中。
    3. 第2管：按如下所述进行抗体和活率染色。
      注意：本染色方案已针对 CD19 B 细胞染色进行优化。若使用其他用于标记不同类型细胞的人源抗体，可能需要对方案进行相应调整。
      1. 向2号管（含CTV标记的细胞）中加入98 µL ABB。向上述98 µL ABB中加入2 µL CD19-Alexa488抗体（1:50稀释）。充分混匀。
      2. 在 4 °C 下孵育混合物 30 分钟，加入 500 µL ABB 以终止反应。在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。弃去上清液并 重复洗涤步骤。
      3. 将细胞沉淀重悬于100 µL ABB中，随后进行7AAD和APC-Annexin V染色。7AAD和APC-Annexin V染色及流式细胞术检测步骤如下所述。
      4. 向重悬的细胞中加入 5 µL 7AAD 和 5 µL APC-Annexin V。轻轻涡旋混匀。室温避光孵育 15 分钟。加入 200 µL ABB，使终体积达到 310 µL。
      5. 在移植当天按以下顺序进行流式细胞术分析，以避免交叉污染：未染色对照细胞（Tube 1），CTV标记的细胞，染色试剂为Alexa488-CD19、APC-Annexin V和7AAD（Tube 2）。每份样本至少记录10,000个事件，以确保充分分析。

5. 移植

  1. 移植板：准备两个装有 E3/P/S 的 10 cm 培养皿，放入 28 °C 培养箱中至少预热 30 分钟。
  2. 细胞准备：在室温下以 350 x g 离心 5 分钟，弃去上清液，并用微量移液器吸除残留液体。加入 PBS 至终体积为 20 µL。将浓缩的细胞悬液置于冰上保存。
    注意：在移植过程中，细胞在冰上放置时间不应超过 2 小时。
  3. 移植针和宿主胚胎的准备
    1. 使用玻璃巴斯德移液管将 25–30 个胚胎转移至其中一个预热的含 E3/P/S 的培养皿中作为对照。使用微量加样吸头将 4 µL 细胞悬液装入移植针中。
      注意：装样过程应在 1–2 分钟内顺利进行。若无法实现，请小心向细胞悬液中添加更多 PBS。
    2. 通过调节显微注射仪来校准注射压力和脉冲时长。调整至一次注射可排出约 1,000 个 ALL 细胞或 2 nL 细胞悬液（对应 20 µL 中含 1×107 个细胞）。为估算 1,000 个细胞，可将一定体积的悬液排至覆盖培养基的琼脂糖表面，在小范围内计数 100 个细胞，外推其分布至整个细胞群体，进而估算总数。
    3. 准备 50 mL 含三卡因（tricaine）的 E3 溶液（终浓度：80 mg/L）。将宿主胚胎转移至三卡因溶液中，孵育至少 2 分钟，以确保充分麻醉。当胚胎无任何运动反应时，表明已充分麻醉。
      注意：可使用微量加样吸头或镊子小心接近和/或轻触胚胎以判断麻醉状态。
    4. 使用尽可能少的液体，将 15–20 个去壳胚胎转移至涂有琼脂糖的注射培养皿中（参见前述制备说明），以防止胚胎滑动。
    5. 按 图 2A 所示排列胚胎。将约 1,000 个 CTV 阳性的 BCP-ALL 细胞注射至心包腔。如 图 2B 所示，从背侧尾部方向以 45° 角插入针头进行注射。
      注意：应使用市售的预拉制钝头移植针，其开口直径为 20 µm，专为小体积白血病细胞设计（见材料清单）。若针头堵塞，可适当修剪，但之后需重新校准注射体积和细胞数量。
    6. 完成全部 15–20 个胚胎的注射后，将其转移至预热的装有 E3/P/S 的培养皿中，并在 28 °C 下维持培养。
    7. 重复上述步骤，直至为一次药物处理实验共移植约 100–150 个胚胎，该实验应包括三种药物浓度组和一个对照组。
    8. 将移植胚胎和未移植的对照胚胎均在 28 °C 下孵育 1–3 小时，然后开始药物处理。
  4. 体内 药物处理（96 孔板）
    1. 使用荧光体视显微镜筛选胚胎，确认移植成功（图 2C）。确保卵黄完整，因为卵黄环境可能对移植物细胞具有毒性21。弃去细胞位于卵黄内的胚胎。
    2. 在含 0.5% DMSO 的 E3/P/S 中，为每种待测药物条件配制 2.5 mL 的 2 倍浓缩溶液。此外，配制 5 mL 含 0.5% DMSO 的 E3/P/S 作为空白溶剂对照溶液。
    3. 向 96 孔板的每个孔中加入 100 µL E3/P/S + 0.5% DMSO。此步骤可防止微量药物在孔间非预期转移。
    4. 小心地将一个移植成功的胚胎转移至每个孔中。使用玻璃巴斯德移液管，以尽可能少的 E3 培养基吸取每个胚胎。
    5. 轻轻倾斜移液管，使胚胎依靠重力沉降至管尖底部，并利用毛细作用将其释放入孔中。转移过程中避免移液管接触孔内液体。
    6. 向 96 孔板中添加药物溶液：将 24 个孔（两行）分别加入 100 µL 空白溶剂对照溶液或三种 2 倍浓缩药物溶液之一。
      注意：每种药物的有效浓度需根据前期针对该药物的预实验结果确定。
    7. 将胚胎（包括未移植的对照组）在 35 °C 下维持培养 72 小时，用于第 7 天的流式细胞术分析。

第7天

  1. 胚胎/移植物解离
    1. 使用体视显微镜筛选96孔板，识别并挑选健康的斑马鱼胚胎。从每种实验条件下随机选取10个健康宿主胚胎，转移至1.5 mL微量离心管中（理想情况下每种条件获得2管）。
    2. 尽可能吸除各管中的液体，并通过将离心管置于冰上孵育1小时，以低温休克法处死胚胎。
    3. 向每根离心管中加入500 µL无钙无镁的Hank's平衡盐溶液（HBSS）。使用200 µL移液枪头通过反复吹打约15次，机械解离胚胎和移植物细胞。
    4. 在室温下以350 × g离心5分钟，使组织碎片沉淀。同时，为每种实验条件准备含2 mL PBS的FACS管（共4管），并配备带有35 µm细网滤膜盖的滤筛。
    5. 将每份沉淀重悬于500 µL酶解混合液中（含0.01%木瓜蛋白酶、0.1%分散酶II、0.01%脱氧核糖核酸酶I及12.4 mM MgSO4的无钙无镁HBSS），进行酶解消化。室温孵育15分钟。
    6. 在孵育过程中，每隔5分钟使用同一枪头对各管中的混合液反复吹打一次，以避免组织损失。
  2. 流式细胞术检测
    1. 将解离后的细胞转移至FACS管的35 µm细网滤膜盖中，以350 × g离心5分钟。
    2. 在离心过程中，配制CD19 B细胞表面染色的主混合液。每种实验条件加入98 µL ABB缓冲液和2 µL Alexa Fluor 488标记的抗人CD19抗体。
    3. 弃去解离细胞沉淀的上清液，将沉淀重悬于100 µL CD19染色主混合液中。
    4. 对所有ZefiX样本执行CD19、7AAD和APC Annexin V染色流程，如有平行细胞培养物，应包括其中3 × 105个CTV阳性细胞。
    5. 按照表2中列出的顺序进行流式细胞术分析，并记录事件数量。尽可能完整地检测所有含宿主和移植物细胞的样本，以评估移植物细胞的总数。
  3. 使用商业软件分析结果
    1. 细胞培养样本的设门策略：打开软件并将FCS文件载入工作区。创建CD19与CTV的散点图，确认信号重叠并验证癌细胞的存在。随后创建FSC-A（x轴）与SSC-A（y轴）的散点图，以区分完整细胞（Q2）与碎片 （Q4；图3A'）。
    2. 利用完整细胞群体创建SSC-H（x轴）与SSC-A（y轴）的新散点图，以识别单细胞（图3A''）。
    3. 使用单细胞群体创建Annexin V（x轴）与7AAD（y轴）的散点图（图3A'''），将细胞分为四群：活细胞：Annexin V阴性、7AAD阴性（Q4）；早期凋亡细胞：Annexin V阳性、7AAD阴性（Q3）；晚期凋亡/坏死细胞：Annexin V阳性、7AAD阳性（Q2）；坏死细胞：Annexin V阴性、7AAD阳性（Q1）。
    4. 对3 dpi样本重复上述步骤（图3B）。
    5. 移植物与宿主胚胎细胞的设门策略
      1. 使用CTV（x轴）与CD19（y轴）的散点图将人源移植物细胞与宿主细胞分离，识别并分离CTV/CD19双阳性移植物细胞（图3C）。
      2. 将3 dpi培养细胞所用的相同设门策略（图3B' - B'''）应用于移植物细胞群体，复制设门策略以保证一致性。
      3. 将所有Annexin V和7AAD阴性的细胞群体合并，生成以CTV值为x轴的直方图（图3D）。计算五个样本的几何平均值，以确定增殖速率。
  4. 治疗反应评估的计算
    1. 为确定3天后的细胞分裂次数，使用以下公式：
      n = log2 (I0/I)
      ​其中，I0 = 初始CTV荧光强度（几何平均值，0 dpi），I = 72小时时的CTV荧光强度，n = 细胞分裂次数。
      示例：新鲜冷冻患者细胞在ZefiX模型中分裂2.6次，log2(88317/14644) = 2.6
      ​在2D培养中分裂2.8次，log2(88317/12992) = 2.8
    2. 为确定3天后每条鱼中的移植物细胞总数，将癌细胞总数（包括凋亡细胞但排除碎片）除以样本中合并的鱼的数量（通常n = 10）。
    3. 为确定3天后CTV阳性移植物细胞的存活率，使用以下公式：
      V = (C/100) × A
      其中：V = 存活率，C = 无碎片的完整单细胞比例（以百分比表示），A = Annexin V和7AAD阴性细胞的比例（以百分比表示）。

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结果

有关ZefiX方案的详细科学评估，包括对新鲜冷冻的原代BCP-ALL细胞样本进行异种移植和药物处理，请参阅先前发表的论文21。使用患者样本进行临床前药物测试的研究许可，已由当地医学研究伦理委员会作为ALL-REZ BFM 2002试验（NCT00114348）和ALL-REZ BFM注册库与生物样本库（EA2/055/12）的附加研究部分批准，同时亦获得国家主管部门对IntReALL SR 2010国际试验（NCT01802814）的批准。患者和/或其监护人已通过其参与的相应试验或注册库程序签署了知情同意书。

图2 展示了注射前在琼脂糖培养皿中进行胚胎排列的示例，有助于简化注射过程。注射时应按照图中所示角度操作，以精确定位发育心脏周围的腔隙。此外，图2C 提供了成功注射的人源移植物细胞（蓝色）在2天龄胚胎中的参考图像，移植物细胞在注射前已用CTV标记。凡注射结果与图2C

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讨论

由于具有高通量能力和成本效益，斑马鱼胚胎已成为药物筛选和癌症研究中日益流行的异种移植模型。这些异种移植模型有望成为转化医学的关键支柱，有助于临床前研究和决策制定9,21。然而，与大量关于实体瘤移植的研究相比，用于人类白血病细胞扩增和治疗的斑马鱼异种移植模型仍相对较少。本实验方案为利用斑马鱼异种移植模型开展白血病研究提供了详细指导，同时亦可灵活适用于实体瘤研究。

实现稳定的癌细胞移植具有挑战性，凸显了标准化分析和提高统计可靠性的必要性。本方案通过提供一套完整的流程，涵盖细胞准备、移植操作及后续的流式细胞术分析，并结合故障排除建议，解决了上述问题。

通过吗啉环寡核苷酸注射实现短暂免疫抑制
斑马鱼胚胎在发育的最初几天依赖其先天免疫系统，这决定了本实验流程的时间窗口20。原始巨噬细胞约在受精后12小时出现，部分细胞在受精后33...

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披露

所有作者均声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）在合作研究中心CRC1588（项目编号493872418）以及柏林Dr. Kleist基金会的资助，同时也获得了德国José Carreras白血病基金会（R03/2016）、柏林癌症协会（HEFF201633KK）和德国癌症联盟（DKTK，联合资助项目2016）的支持。我们感谢Julia Köppke和Mareike Wolff对稿件的审阅与宝贵意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
培养皿 （10 cm）GreinerP7237
7-AAD 活性染色液 Invitrogen00-6993-50
琼脂糖（LE，分析级）Biozym 840004
气压注射器NarishigeIM400 需外接气体供应
Alexa Fluor 488 抗人 CD19 抗体 Biolegend302219
Annexin 结合缓冲液Biolegend422201或参见溶液配制方法
APC 标记 Annexin V Biolegend640941
毛细管（10 cm，外径 1.0 mm，带丝）WPIINCTW100F-4外径 1.0；内径 0.75
细胞培养瓶（T-175）Sarstedt83,39,12,002
CellTrace Violet InvitrogenC34557
二甲基亚砜（DMSO）RothA994.1
Dispase II Sigma AldrichD4693-1g
DNase IAppliChem GmbHA3778
Eppendorf 管（1.5 ml）Eppendorf30120086
FACS 管（聚苯乙烯圆底管，带细胞筛网帽，5 ml）Falcon352235
Falcon 管（50 ml）Falcon352070
胎牛血清（FCS）Sigma AldrichC8056
细网滤器 （10 µm）PluriStrainer435001050
细网滤器 （20 µm）PluriStrainer431002040
流式细胞仪 Becton DickinsonBD LSRFortessa X-20
荧光体视显微镜Leica
带相机的荧光体视显微镜LeicaM165 FC相机：DFC7000 T
Hank’s 平衡盐溶液（HBSS，无钙镁）Sigma Aldrich88284
注射模具（斑马鱼 MI/移植试剂盒）World Precision Instruments Z-MOLDS
注射针（无丝）Biomedical instrumentsVZIPbl-20-10-55斑马鱼注射移液管，钝头，外径：20μm ± 1，总长：~10 mm，针长：55 mm，玻璃材质：BM100T-10P
大容量离心机Eppendorf
微量离心机
Morpholino（csf3r）Gene Tools LLCcsf3r (GAAGCACAAGCGA
GACGGATGCCA)
Morpholino（spi1）Gene Tools LLCspi1(GATATACTGATAC
TCCATTGGTGGT)
木瓜蛋白酶Sigma AldrichP3125
青霉素-链霉素（Penstrep；10,000 U/ml）Gibco15140122
培养板（4 孔）Greiner Bio one 657160
培养板（96 孔）Greiner Bio one 657180
Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基Gibco21875-034
Tricaine （MS-222）Sigma AldrichE10521-50G乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐

参考文献

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