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方法文章

衍生含小胶质细胞发育的人脑类器官

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DOI：

10.3791/67491

⸱

2025年1月17日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Cancer Genetics and Comparative Genomics Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health

本文内容

摘要

我们提出了一种通过将诱导性多能干细胞（iPSC）来源的造血祖细胞（HPCs）整合到类器官发育过程中，以生成含常驻小胶质细胞的人脑类器官的实验方案。

摘要

由诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的三维（3D）脑类器官培养物提供了一种重要的替代方案 体外 工具 用于研究人类大脑发育及神经系统疾病的发病机制。然而，目前人脑类器官缺乏小胶质细胞的整合，仍是构建神经炎症三维模型的主要障碍。现有方法主要包括将完全分化的小胶质细胞整合入成熟脑类器官，或在人诱导性多能干细胞（iPSC）来源的胚胎体（EBs）早期阶段即诱导小胶质细胞分化。前一种方法忽略了小胶质细胞分化与其邻近神经环境相互作用的关键阶段，而后一种方法在技术上具有挑战性，导致最终类器官中小胶质细胞的数量和质量不一致。为了构建含小胶质细胞的脑类器官以研究小胶质细胞与神经元发育之间的早期相互作用，本研究将由人iPSCs分化而来的高纯度造血祖细胞（HPC）整合入类器官 将iPSC来源的EBs用于构建脑类器官。通过免疫染色和单细胞RNA测序（sc-RNA-seq）分析，我们证实HPCs被成功整合至3D类器官中，并最终发育形成包含小胶质细胞和神经元的脑类器官。与不含HPCs的脑类器官相比，该方法显著提高了小胶质细胞在类器官中的整合效率。这一新型3D类器官模型兼具小胶质细胞和神经系统的发育特性，可用于研究先天免疫系统与神经系统发育早期的相互作用，亦有望作为神经炎症和神经感染性疾病的模型。

引言

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，在大脑发育和稳态维持中发挥关键作用1,2小胶质细胞的活化会导致促炎因子的产生、吞噬作用增强以及活性氧应激反应升高，从而清除入侵的病原体和受损细胞。然而，小胶质细胞的过度活化或持续活化反而可能作为多种神经系统疾病（包括帕金森病）发病机制中的一个环节，引发神经退行性变。3,4在研究人类神经系统疾病的相关模型中，包含小胶质细胞至关重要。近年来，人类干细胞已被用于开发三维类器官 体外 作为动物模型和人体研究的替代方案的模型5理想情况下，人类类器官包含多种细胞类型和组织结构，与相应的人体器官相似，在模拟人体生理和发病机制方面优于动物模型，同时避免了直接进行人体研究时涉及的伦理问题。类器官可能代表未来人类疾病建模的发展方向，可用于发病机制研究、药物开发以及个体化治疗的指导6例如，由人诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的三维人脑类器官已在神经科学研究领域广泛应用，用于模拟寨卡病毒（ZIKA）、严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）等神经感染性疾病7，以及包括肌萎缩侧索硬化症（ALS）和阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病8,9然而，采用双SMAD抑制法诱导神经分化的传统三维神经类器官10 生成不含小胶质细胞的脑类器官，因为它们是 源自从血液中募集的前体细胞，而非神经元所来源的神经外胚层谱系11,12如果没有小胶质细胞，类器官无法充分模拟中枢神经系统感染、炎症及相关神经退行性病变。

为解决这一关键问题，研究人员已尝试将已分化的小胶质细胞引入脑类器官13，或采用替代方法（而非双SMAD抑制法）从初始阶段即在类器官内诱导小胶质细胞分化13。然而，将已分化的小胶质细胞引入脑类器官的方式会错过神经元与小胶质细胞在发育早期的相互作用，这在中枢神经系统发育过程中可能具有重要意义，或影响以婴幼儿脑发育为靶点的神经感染性疾病的发病机制，例如寨卡病毒（ZIKA virus）感染14。另一方面，在诱导多能干细胞（iPSC）来源的脑类器官中直接分化出固有小胶质细胞，若不经过中间阶段，则过程较为漫长，且终末产物的个体间变异性较高15。在本研究报告的方案中，我们将iPSC来源的造血 祖细胞（HPCs）引入iPSC中以形成拟胚体（EBs），随后进一步分化为包含神经元和小胶质细胞的三维类器官。

本方案提供了一种简便的方法，可用于研究人类中枢神经系统，涉及早期神经元-小胶质细胞相互作用，以及与小胶质细胞活化相关的神经感染性疾病和神经炎症的发病机制。

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方案

原始血液样本采集自健康成年捐献者，采集地点为美国国立卫生研究院（NIH）输血医学血库，并根据NIH机构审查委员会的规定获取了签署的知情同意书。

1. 由人诱导多能干细胞（iPSCs）产生造血祖细胞（HPCs）

注意：本研究使用人iPSC细胞系510和507获得代表性结果。iPSC的建立与维持方法详见先前发表的研究16。

  1. 第0天：向12孔细胞培养板中每孔加入500 μL冰上预冷的、用DMEM/F12培养基稀释的Matrigel（基底膜基质[BMM]）溶液，于室温（RT）孵育至少30分钟。
  2. 完全去除包被液，每孔加入1 mL E8 Flex培养基。
  3. 在显微镜下检查6孔板中的iPSC培养物，确认iPSC状态良好且无分化迹象。选择一个中等大小的克隆，并用记号笔在培养板底部对应位置做标记。
  4. 移除iPSC培养物中的培养基，向孔中加入500 μL乙二胺四乙酸（EDTA）iPSC解离缓冲液（含0.5 mM EDTA、0.45 g/L NaCl的DPBS溶液）。
  5. 在显微镜下观察细胞解离情况，当克隆边缘出现三到四排细胞收缩、细胞间出现空隙时，表明解离正在进行。此过程通常需要1–3分钟。
  6. 彻底弃去EDTA溶液。用移液器将1 mL E8 Flex培养基用力直接吹打至已标记的iPSC克隆上，使其脱落。确保经过1–3次吹打后，克隆完全解离为每个含20–50个细胞的细胞团块。
  7. 收集含有细胞团块的上清液，并将其加入12孔板已包被孔中的第一个孔。
  8. 通过轻柔吹打混匀该孔液体，然后将1 mL细胞悬液转移至第二个含有1 mL培养基的孔中。
  9. 重复步骤1.8两次，使iPSC培养物在总共四个孔中进行连续稀释。
  10. 将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。
  11. 24小时后（第1天），在显微镜下检查各孔克隆，连续观察所有视野并计数克隆数量。选择一个含有10–20个iPSC克隆的孔。
  12. 更换为1 mL造血诱导试剂盒中的A培养基，将培养板放回培养箱继续培养48小时。
  13. 第3天，移除500 μL用过的培养基，并加入500 μL新鲜A培养基。
  14. 第4天，在显微镜下观察，可见iPSC克隆发生显著的细胞增殖和分化现象。更换为1 mL B培养基。
  15. 持续在显微镜下监测细胞分化情况，每隔一天进行半量换液，加入500 μL B培养基。类造血祖细胞（HPC-like cells）通常在第6–7天出现。
  16. 第10天，在显微镜下观察到培养基中漂浮或松散附着于扁平单层细胞底部的明亮圆形单个细胞，以及部分松散的细胞聚集体。
    注意：已分化的HPCs已准备好用于收集，进行表征或进一步实验。
  17. 使用1 mL移液器枪头反复吹打三次，收集所有已分化的HPCs，以打散细胞聚集体并使HPCs从培养板表面完全脱离。
  18. 将细胞转移至15 mL离心管中，在300 × g 条件下离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL B培养基中。
  19. 计数细胞，并调整浓度至100万个细胞/mL。在此阶段，通常可获得超过100万个HPCs。通过流式细胞术检测时，应确保CD34+/CD43+细胞比例超过85%，且无明显死细胞（死细胞比例不超过5%）。

2. 由混合的iPSC和HPC诱导形成类胚体

  1. 在收集HPCs的同一天，确保一个iPSC培养物在6孔板的一个孔中（或12孔板的两个孔中）达到80%融合度。
  2. 处理微量培养板中的一个孔 用于 EB形成 加入500 µL抗黏附冲洗液，以尽量减少气泡产生。
  3. 以 2000 x 转速离心平板 g 使用配备板架的摆动转子，在5分钟内离心以去除可能的气泡。
  4. 用移液管彻底吸除洗涤液，随后用1 mL DPBS洗涤两次，再用1 mL DMEM/F12洗涤两次，操作过程中避免产生气泡。
  5. 用1 mL的Accutase溶液处理细胞，使iPSCs从培养板上解离。
  6. 在显微镜下观察，直至细胞出现分离迹象但仍附着于底部。此现象通常发生在使用Accutase处理1-3分钟内。切勿过度消化iPSCs。
  7. 完全去除Accutase溶液，注意不要扰动细胞，然后向孔中加入1 mL DMEM/F12培养基。接着使用1 mL枪头轻轻吹打数次，使细胞充分解离成单细胞悬液。
  8. 将细胞收集至15 mL离心管中，并用DMEM/F12培养基定容至5 mL。在300 x g 5 分钟。
  9. 用移液器吸除上清液，将细胞重悬于1 mL E8 Flex培养基中。对细胞进行计数，并用E8 Flex培养基调整细胞浓度至每毫升100万个细胞。
  10. 将iPSCs与HPCs按2:1的比例混合，加入100万iPSCs（1 mL）和50万HPCs（500 µL）。将混合后的细胞全部加入先前处理过的微孔培养板孔中。
  11. 每1 mL上清液中加入1 µL Rho激酶抑制剂Y27632储存液（1 mM）。轻轻左右摇晃培养板数次，使细胞均匀分布。
  12. 将微孔培养板在300 x g条件下离心 g 在配备板架的摆动桶转子中离心5分钟。在显微镜下观察细胞是否已沉降至微孔中。 (补充图 1A).
  13. 在不扰动细胞的情况下，将培养板放入37 °C、5% CO₂培养箱中2 细胞培养箱
  14. 第2天，即48小时后，在显微镜下观察细胞以确认胚状体（EBs）的形成。当EBs明显形成后，继续进行下一步操作（补充图1B).
  15. 用抗黏附冲洗缓冲液（500 µL）处理24孔细胞培养板，孵育15分钟，以制备低黏附培养板。
  16. 彻底去除洗涤缓冲液，用1 mL DPBS将孔板洗涤两次，然后向各孔中加入1 mL E8 Flex培养基。
  17. 用1 mL宽口吸头在微孔培养板中反复吹吸，重悬拟胚体。
  18. 对于每个经低黏附处理的24孔板中的孔，收集并加入含有胚状体（EBs）的100 µL培养基，使每孔含有10–20个EBs。向原有孔中残留EBs的培养基中添加E8 Flex培养基，作为备用。
  19. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育培养板2 细胞培养箱中孵育48小时。

3. 三维神经类器官的诱导、增殖与成熟

  1. 在形成胚状体（EB）后的第2天，将BMM分装样品置于冰上解冻，至少30分钟。
  2. 使用预冷的20 µL吸头，将15 µL冰上预冷的BMM逐滴加入培养基表面，以包被EB。此操作可形成一层BMM薄膜，供EB附着并生长。
  3. 将培养板放入37 °C、5% CO2的细胞培养箱中。
  4. 在EB形成后的第4天，小心移除500 µL培养基，注意不要丢弃EB，然后按照步骤3.2重复进行BMM包被。
  5. 立即加入500 µL PSC神经诱导培养基至细胞表面，启动神经诱导。
  6. 在第6天和第8天，通过小心移除500 µL培养基（避免触碰细胞）并加入500 µL神经诱导培养基，进行半量换液。
  7. 在第10、12和14天，使用神经干细胞（NSC）培养基进行半量换液：Knockout DMEM/F12 + 1x Glutamax补充剂 + 1x 神经补充剂 + bFGF + EGF。
  8. 在第15天，将整个孔中的类球体连同培养基转移至已用抗黏附冲洗液处理过的新12孔板中（处理方法如前所述），并在培养物上方加入500 µL神经元成熟培养基（DMEM/F12 + 1x N2补充剂 + 1x B27补充剂 + 1x 抗生素-抗真菌剂）。
  9. 每隔一天使用神经元成熟培养基进行半量换液。
  10. 在成熟阶段，若出现营养耗竭迹象（如培养基颜色改变），可将类器官转移至6孔板中，每孔最多可容纳3 mL培养基。
  11. 可选步骤：在EB形成后第17天，向成熟培养基中添加细胞因子（IL-34、M-CSF、TGF-β1、CD200、CX3CL1）共6天，以促进小胶质细胞成熟。
  12. 在第23天，收集生成的神经类器官用于表征分析或进一步实验。

4. 三维神经类器官的透明化与免疫染色

  1. 将最多10个类器官浸入1 mL 4%多聚甲醛（PFA）中，在4 °C固定24小时。
  2. 将每个孔中的类器官转移至96孔透明底板中，每次加入200 µL DPBS，在温和振荡条件下洗涤2次，每次1小时。
  3. 在4 °C、温和振荡条件下，依次用含50%甲醇的DPBS、含80%甲醇的双蒸水（dd水）和100%干燥甲醇各洗涤1次，每次10分钟，以对类器官进行通透处理。
  4. 在4 °C、温和振荡条件下，依次用20% DMSO/甲醇、80%甲醇的dd水、50%甲醇的DPBS、100% DPBS以及含0.2% Triton X-100的DPBS洗涤，每次10分钟。每次洗涤后应尽量彻底去除残留缓冲液。
  5. 在通透缓冲液（含0.2% Triton X100、0.3 M甘氨酸和20% DMSO的DPBS）中，室温下温和振荡孵育40分钟。
  6. 在封闭缓冲液（含0.2% Triton X100、6%山羊血清和10% DMSO的DPBS）中，37 °C、80 rpm振荡器上温和振荡封闭1小时。
  7. 在抗体稀释缓冲液（IBA1 1:100，TREM2 1:100，βIII-微管蛋白 1:1000，每孔100 µL，含0.2% Tween 20、100 µg/mL肝素、3%山羊血清和5% DMSO的DPBS）中，37 °C孵育2小时，或在冷室中80 rpm振荡器上温和振荡孵育3天。
  8. 用含0.2% Tween 20和100 µg/mL肝素的DPBS洗涤5次，每次10分钟，室温下80 rpm振荡器上温和振荡。
  9. 加入二抗（1:200山羊抗小鼠Alexa488），37 °C孵育1小时，随后在室温下继续振荡孵育过夜，80 rpm振荡器上保持温和振荡。
  10. 如需进行细胞核对比染色，可在抗体孵育过程中或在洗涤缓冲液中同时进行DAPI染色。
  11. 用洗涤缓冲液洗涤类器官10次，每次10分钟，37 °C下温和振荡。
  12. 在显微镜下观察。若背景信号仍较高，可继续洗涤5次。
  13. 尽可能弃去上清液。加入200 µL类器官透明化溶液，孵育5分钟后，使用共聚焦显微镜观察并采集图像。

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结果

本实验方案采用一种将iPSCs分化为HPCs，再将HPCs与iPSCs混合形成EBs，随后进行神经诱导、分化和成熟的流程（图1）。高质量的HPC分化对于EB形成及后续类器官分化的成功至关重要。通过连续稀释培养技术，可获得适当数量和大小的iPSC克隆，以启动HPC分化过程（图2A）。通常情况下，iPSC克隆在A培养基中培养结束时会发生显著的形态学变化（图2B），并在B培养基中继续培养3天后进一步表现出HPC分化特征（图2C），表现为形态均一的圆形细胞，悬浮于培养器皿底部上方或附着于底部。HPC可进一步扩展形成类似克隆的细胞簇（图2D）。在第10天时，HPC占主导地位，且无明显碎片残留（图2E）。高质量的HPC与iPSC混...

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讨论

本文介绍了一种利用混合的诱导多能干细胞（iPSC）及由iPSC分化而来的造血前体细胞（HPC）所衍生的拟胚体（EB）来制备包含固有小胶质细胞的三维神经类器官的详细方案。该方法相对简短且易于操作，仅需常规细胞培养技术以及大多数实验室普遍具备的设备即可完成。

该实验方案成功最关键的因素除了HPC分化质量外别无其他。我们采用了一种已发表的方法17，利用商业试剂盒将iPSCs分化为HPCs，并进行了一些修改。与原始方案相比，我们起始使用的iPSC集落尺寸更小、数量更少，并在诱导分化10天后收集HPCs，而非12天。该方法每孔仅产生100万至200万个HPCs，但仍足以满足下一步3D类器官生成的需求。维持这些细胞与iPSC集落之间的适当比例至关重要，因为细胞数量过多最终可能导致细胞死亡或产生碎片，从而阻碍胚状体（EB）的形成。尽管HPCs可在诱导后第10至第12天收集，但我们发现第12天收集会增加死细胞和杂质的风险，因为HPCs在培养末期快速生长可能迅速耗尽营养因子，需要密切监测并额外更换培养基。在第10天收集HPCs则无需通过流式细胞术或磁珠...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由NINDS 院内研究基金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12孔细胞培养板Corning #3512
24孔细胞培养板SARSTEDT#83.3922
AccutaseThermoA1110501
Aggrewell 400板Stemcell technologies#34411文中称为微孔培养板 
Alexa Fluor 488山羊抗小鼠抗体Life techniologiesA110011:400稀释
Alexa Fluor 594山羊抗兔抗体Life techniologiesA110121:400稀释
Allegra X-30R离心机，配备S6069转子Beckman Couler
抗黏附冲洗液 Stem Cell Technologies#07010
抗CD34抗体Stem Cell Technologies#600131:100稀释
抗人CD43抗体Stem Cell Technologies#600851:100稀释
抗IBA1兔抗体Fujifilm019-197412.5 µg/mL
抗TREM2大鼠多克隆抗体 RD Systemsmab172912.5 µg/mL
抗生素-抗真菌剂Gibco15240-0621x
B27添加剂Life technologies17504-0441x
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CD200NovoproteinC311 100 ng/mL
CryoTube冻存管Thermo#368632
CX3CL1Peprotech300-31 100 ng/mL
DAPISigmaD95421 µg/mL
DMEM/F12Life technologies12400-0241x
DMSOSigmaD2650
DPBSGibco#41901361x
E8 Flex培养基试剂盒ThermoA2858501
EDTAMediatech46-034-Cl 0.5 mM
EGFPeprotechAF-100-1520 ng/mL
EVOS FL Auto显微镜Thermo荧光显微镜 
FastStart Universal SYBR Green PCR主混合液Roche#4913850001
GlutamaxGibco#35050079
山羊血清SigmaG90234%
IL-34Peprotech200-34 100 ng/mL
ImageXpress Micro共聚焦显微镜Molecular Devices
Knockout DMEM/F12Gibco#10829018
M-CSFPeprotech300-25 25 ng/mL
MatrigelCorning#354277基底膜基质（BMM）
小鼠抗-βIII-微管蛋白抗体PromegaG712A1:1000稀释
Mr. Frosty冻存容器Thermo5100-0001
N2添加剂Life technologies17502-0481x
多聚甲醛SigmaP61484%
PSC神经诱导培养基GibcoA1647801
ROCK抑制剂Y27632Stemcell technologies#723041 mM储备液
RT LTS 1000 µl移液器吸头RAININ#30389218 用于类器官转移
STEMdiff脑类器官试剂盒Stem Cell Technologies#08570
STEMdiff造血试剂盒StemCell Technologies#5310文中称为造血试剂盒
StemPro神经添加剂GibcoA1050801文中称为神经添加剂
TGF-β1Peprotech100-2150 ng/mL
总RNA纯化Plus试剂盒Norgen#48400
吐温X-100SigmaT92840.10%
Visikol Histo-启动试剂盒VisikolHSK-1包含类器官透明化溶液HISTO-M和洗涤缓冲液
Zeiss LSM 510-META共聚焦显微镜Zeiss

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