我们提出了一种通过将诱导性多能干细胞（iPSC）来源的造血祖细胞（HPCs）整合到类器官发育过程中，以生成含常驻小胶质细胞的人脑类器官的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
由诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的三维（3D）脑类器官培养物提供了一种重要的替代方案 体外 工具 用于研究人类大脑发育及神经系统疾病的发病机制。然而，目前人脑类器官缺乏小胶质细胞的整合，仍是构建神经炎症三维模型的主要障碍。现有方法主要包括将完全分化的小胶质细胞整合入成熟脑类器官，或在人诱导性多能干细胞（iPSC）来源的胚胎体（EBs）早期阶段即诱导小胶质细胞分化。前一种方法忽略了小胶质细胞分化与其邻近神经环境相互作用的关键阶段，而后一种方法在技术上具有挑战性，导致最终类器官中小胶质细胞的数量和质量不一致。为了构建含小胶质细胞的脑类器官以研究小胶质细胞与神经元发育之间的早期相互作用，本研究将由人iPSCs分化而来的高纯度造血祖细胞（HPC）整合入类器官 将iPSC来源的EBs用于构建脑类器官。通过免疫染色和单细胞RNA测序（sc-RNA-seq）分析，我们证实HPCs被成功整合至3D类器官中，并最终发育形成包含小胶质细胞和神经元的脑类器官。与不含HPCs的脑类器官相比，该方法显著提高了小胶质细胞在类器官中的整合效率。这一新型3D类器官模型兼具小胶质细胞和神经系统的发育特性，可用于研究先天免疫系统与神经系统发育早期的相互作用，亦有望作为神经炎症和神经感染性疾病的模型。
引言
小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，在大脑发育和稳态维持中发挥关键作用1,2小胶质细胞的活化会导致促炎因子的产生、吞噬作用增强以及活性氧应激反应升高，从而清除入侵的病原体和受损细胞。然而，小胶质细胞的过度活化或持续活化反而可能作为多种神经系统疾病（包括帕金森病）发病机制中的一个环节，引发神经退行性变。3,4在研究人类神经系统疾病的相关模型中，包含小胶质细胞至关重要。近年来，人类干细胞已被用于开发三维类器官 体外 作为动物模型和人体研究的替代方案的模型5理想情况下，人类类器官包含多种细胞类型和组织结构，与相应的人体器官相似，在模拟人体生理和发病机制方面优于动物模型，同时避免了直接进行人体研究时涉及的伦理问题。类器官可能代表未来人类疾病建模的发展方向，可用于发病机制研究、药物开发以及个体化治疗的指导6例如，由人诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的三维人脑类器官已在神经科学研究领域广泛应用，用于模拟寨卡病毒（ZIKA）、严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）等神经感染性疾病7，以及包括肌萎缩侧索硬化症（ALS）和阿尔茨海默病在内的神经....
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方案
原始血液样本采集自健康成年捐献者，采集地点为美国国立卫生研究院（NIH）输血医学血库，并根据NIH机构审查委员会的规定获取了签署的知情同意书。
1. 由人诱导多能干细胞（iPSCs）产生造血祖细胞（HPCs）
注意：本研究使用人iPSC细胞系510和507获得代表性结果。iPSC的建立与维持方法详见先前发表的研究16。
- 第0天：向12孔细胞培养板中每孔加入500 μL冰上预冷的、用DMEM/F12培养基稀释的Matrigel（基底膜基质[BMM]）溶液，于室温（RT）孵育至少30分钟。
- 完全去除包被液，每孔加入1 mL E8 Flex培养基。
- 在显微镜下检查6孔板中的iPSC培养物，确认iPSC状态良好且无分化迹象。选择一个中等大小的克隆，并用记号笔在培养板底部对应位置做标记。
- 移除iPSC培养物中的培养基，向孔中加入500 μL乙二胺四乙酸（EDTA）iPSC解离缓冲液（含0.5 mM EDTA、0.45 g/L NaCl的DPBS溶液）。
- 在显微镜下观察细胞解离情况，当克隆边缘出现三到四排细胞收缩、细胞间出现空隙时，表明解离正在进行。此过程通常需要1–3分钟。
- 彻底弃去EDTA溶液。用移液器将1 mL E8 Fle....
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结果
本实验方案采用一种将iPSCs分化为HPCs，再将HPCs与iPSCs混合形成EBs，随后进行神经诱导、分化和成熟的流程（图1）。高质量的HPC分化对于EB形成及后续类器官分化的成功至关重要。通过连续稀释培养技术，可获得适当数量和大小的iPSC克隆，以启动HPC分化过程（图2A）。通常情况下，iPSC克隆在A培养基中培养结束时会发生显著的形态学变化（图2B），并在B培养基中继续培养3天后进一步表现出HPC分化特征（图2C），表现为形态均一的圆形细胞，悬浮于培养器皿底部上方或附着于底部。HPC可进一步扩展形成类似克隆的细胞簇（图2D）。在第10天时，HPC占主导地位，且无明显碎片残留（图2E）。高质量的HPC与iPSC混.......
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讨论
本文介绍了一种利用混合的诱导多能干细胞（iPSC）及由iPSC分化而来的造血前体细胞（HPC）所衍生的拟胚体（EB）来制备包含固有小胶质细胞的三维神经类器官的详细方案。该方法相对简短且易于操作，仅需常规细胞培养技术以及大多数实验室普遍具备的设备即可完成。
该实验方案成功最关键的因素除了HPC分化质量外别无其他。我们采用了一种已发表的方法17，利用商业试剂盒将iPSCs分化为HPCs，并进行了一些修改。与原始方案相比，我们起始使用的iPSC集落尺寸更小、数量更少，并在诱导分化10天后收集HPCs，而非12天。该方法每孔仅产生100万至200万个HPCs，但仍足以满足下一步3D类器官生成的需求。维持这些细胞与iPSC集落之间的适当比例至关重要，因为细胞数量过多最终可能导致细胞死亡或产生碎片，从而阻碍胚状体（EB）的形成。尽管HPCs可在诱导后第10至第12天收集，但我们发现第12天收集会增加死细胞和杂质的风险，因为HPCs在培养末期快速生长可能迅速耗尽营养因子，需要密切监测并额外更换培养基。在第10天收集HPCs则无需通过流式细胞术或磁珠.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由NINDS 院内研究基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12孔细胞培养板 | Corning | #3512 | |
| 24孔细胞培养板 | SARSTEDT | #83.3922 | |
| Accutase | Thermo | A1110501 | |
| Aggrewell 400板 | Stemcell technologies | #34411 | 文中称为微孔培养板 |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠抗体 | Life techniologies | A11001 | 1:400稀释 |
| Alexa Fluor 594山羊抗兔抗体 | Life techniologies | A11012 | 1:400稀释 |
| Allegra X-30R离心机，配备S6069转子 | Beckman Couler | ||
| 抗黏附冲洗液 | Stem Cell Technologies | #07010 | |
| 抗CD34抗体 | Stem Cell Technologies | #60013 | 1:100稀释 |
| 抗人CD43抗体 | Stem Cell Technologies | #60085 | 1:100稀释 |
| 抗IBA1兔抗体 | Fujifilm | 019-19741 | 2.5 µg/mL |
| 抗TREM2大鼠多克隆抗体 | RD Systems | mab17291 | 2.5 µg/mL |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240-062 | 1x |
| B27添加剂 | Life technologies | 17504-044 | 1x |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CD200 | Novoprotein | C311 | 100 ng/mL |
| CryoTube冻存管 | Thermo | #368632 | |
| CX3CL1 | Peprotech | 300-31 | 100 ng/mL |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 µg/mL |
| DMEM/F12 | Life technologies | 12400-024 | 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | #4190136 | 1x |
| E8 Flex培养基试剂盒 | Thermo | A2858501 | |
| EDTA | Mediatech | 46-034-Cl | 0.5 mM |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 20 ng/mL |
| EVOS FL Auto显微镜 | Thermo | 荧光显微镜 | |
| FastStart Universal SYBR Green PCR主混合液 | Roche | #4913850001 | |
| Glutamax | Gibco | #35050079 | |
| 山羊血清 | Sigma | G9023 | 4% |
| IL-34 | Peprotech | 200-34 | 100 ng/mL |
| ImageXpress Micro共聚焦显微镜 | Molecular Devices | ||
| Knockout DMEM/F12 | Gibco | #10829018 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | 25 ng/mL |
| Matrigel | Corning | #354277 | 基底膜基质（BMM） |
| 小鼠抗-βIII-微管蛋白抗体 | Promega | G712A | 1:1000稀释 |
| Mr. Frosty冻存容器 | Thermo | 5100-0001 | |
| N2添加剂 | Life technologies | 17502-048 | 1x |
| 多聚甲醛 | Sigma | P6148 | 4% |
| PSC神经诱导培养基 | Gibco | A1647801 | |
| ROCK抑制剂Y27632 | Stemcell technologies | #72304 | 1 mM储备液 |
| RT LTS 1000 µl移液器吸头 | RAININ | #30389218 | 用于类器官转移 |
| STEMdiff脑类器官试剂盒 | Stem Cell Technologies | #08570 | |
| STEMdiff造血试剂盒 | StemCell Technologies | #5310 | 文中称为造血试剂盒 |
| StemPro神经添加剂 | Gibco | A1050801 | 文中称为神经添加剂 |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | 50 ng/mL |
| 总RNA纯化Plus试剂盒 | Norgen | #48400 | |
| 吐温X-100 | Sigma | T9284 | 0.10% |
| Visikol Histo-启动试剂盒 | Visikol | HSK-1 | 包含类器官透明化溶液HISTO-M和洗涤缓冲液 |
| Zeiss LSM 510-META共聚焦显微镜 | Zeiss |
参考文献
- Sabate-Soler, S., et al. Microglia integration into human midbrain organoids leads to increased neuronal maturation and functionality. Glia. 70 (7), 1267-1288 (2022).
- Lazarov, T., Juarez-Carreño, S., Cox, N., Geissmann, F. Physiology and diseases of tissue-res....
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