为了实现对Acinetobacter baumannii的快速且精准检测，我们提出了一种结合重组酶聚合酶扩增技术（RPA）与LbaCas12a内切酶的检测方案，用于鉴定A. baumannii感染。
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摘要
摘要
Acinetobacter baumannii 是一种革兰氏阴性细菌，因其可引起高死亡率的严重感染而臭名昭著。快速且准确地检测 A. baumannii 对于及时治疗、有效控制感染以及遏制抗生素耐药性至关重要。然而，目前尚无适用于现场快速、简便检测 A. baumannii 的理想方法。DNA内切酶靶向CRISPR反式报告系统（DETECTR）结合了Cas12a的靶标特异性识别能力与重组酶聚合酶扩增（RPA）的等温扩增高效性，为 A. baumannii 的检测提供了一种快速、精确且灵敏的方法。本方案详细描述了利用RPA与LbaCas12a内切酶联合检测 A. baumannii 的实验流程。本文所述步骤包括：DNA提取、特异性DNA序列的选择、引物与CRISPR RNA（crRNA）的设计、阳性重组质粒的构建、Cas12a-RPA检测体系的建立、RPA扩增系统的优化、使用实时荧光PCR仪等荧光检测工具对RPA-CRISPR/Cas12a检测结果进行可视化，以及灵敏度与特异性的评估。
引言
在临床微生物学中，检测Acinetobacter baumannii感染面临重大挑战。这种革兰氏阴性菌可引起具有严重临床症状的感染，甚至导致高死亡率，尤其在免疫功能低下患者中更为显著1。传统的基于培养的病原体检测方法耗时较长，且可能灵敏度不足，从而延迟抗生素治疗，影响患者预后。快速而准确地鉴定A. baumannii对于有效治疗和控制暴发至关重要。为满足这一需求，已探索采用核酸扩增的分子技术。然而，这些方法通常需要复杂的热循环设备，并受限于训练有素的技术人员和设施完善的实验室。为克服这些局限，研究 increasingly 集中于开发等温扩增技术2,3,4。
重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）是由 Piepenburg 等人建立的一种 DNA 扩增方法5，其原理类似于聚合酶链式反应（PCR），但无需进行温度循环。该方法包含以下组分：50 mM Tris（pH 7.5）、100 mM 醋酸钾、14 mM 醋酸镁、2 mM DTT、5% PEG20000（一种高分子量的聚乙二醇）、200 µM dNTPs、3 mM ATP、50 mM 磷酸肌酸、100 µg/mL 肌酸激酶、120 µg/mL UvsX、30 µg/mL UvsY、900 µg/mL Gp32、30 µg/mL Bsu LF、450 nM 引物以及 DNA 模板。扩增过程始于重组酶蛋白 UvsX 在 3 mM ATP 和 5% PEG20000 存在下与引物结合，形成重组酶-引物复合物。该复合物随后促进引物与双链 DNA 上同源序列的结合。
在UvsY的协助下，重组酶UvsX促进引物与模板链之间的交换，导致靶DNA的一条链被置换。Gp32有助于维持单链DNA的结构。最终，重组酶解离，一种具有链置换能力的DNA聚合酶（Bsu LF）结合到引物的3'端，并在脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）存在下延伸引物。该过程以循环方式重复进行，实现指数级扩增。所有扩增过程可在20至40分钟内完成，反应温度相对恒定，介于37 °C至42 °C之间。该温度范围与生理温度相近，使得RPA可在简化的环境中进行，因而RPA成为一种多功能且高效的DNA检测与分析工具。
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（CRISPR-Cas）系统在细菌和古菌中作为适应性免疫机制发挥作用，包括I类和II类系统。II类系统包含Cas12（a、b、f）、Cas13（a、b）和Cas14等蛋白，这些蛋白在CRISPR RNA（crRNA）的引导下识别并切割靶标DNA或RNA6,7,8。LbaCas12a（或Cpf1）是一种由crRNA引导的DNA内切酶。crRNA在CRISPR-Cas系统中作为引导RNA，与Cas蛋白形成复合物。它利用其间隔序列与靶标DNA配对，从而有效地将蛋白复合物导向靶序列。序列5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3'是保守的crRNA重复序列，为所有LbaCas12a crRNA中的恒定元件。该重复序列之后是一个靶标特异性片段，其序列根据预期的DNA靶标而有所不同。该靶向序列长度为18至24个核苷酸。
PAM（Protospacer-Adjacent Motif）序列（TTTV，其中V可以是A、C或G）位于DNA靶标非互补链的5'端。Cas12a在PAM序列处切割靶向的双链DNA。随后，被激活的Cas蛋白对单链DNA（ssDNA）执行非特异性的反式切割9,10,11,12。因此，带有荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA在发生附带切割后被裂解，从而产生荧光信号8,13。可通过荧光检测仪定量荧光强度，实现对核酸的精确定量检测14。值得注意的是，Cas12a被广泛用于DNA分析，其对靶序列的结合与切割依赖于对Protospacer-Adjacent Motif（PAM）的识别，而Cas13a则无需该识别条件。
CRISPR-Cas 系统15,16,17 可在单个反应中实现切割18,19,20,21。将上述两种技术结合，可构建一种名为 A. baumannii-DETECTR（LbaCas12a 介导的靶向 A. baumannii 检测）的高效检测工具，用于核酸检测22,23,24。本方案展示了将 RPA 与 Cas12a 的 DNase 活性相结合，特异性靶向并切割 A. baumannii 16s rDNA 基因中由 crRNA 引导的序列，从而实现对该病原体的高灵敏度和高精确度检测。
这 A. baumannii-DETECTR 方法相较于传统检测方法具有多项优势25,26首先，等温的 RPA 流程简化的特征 流程并降低成本 无需热循环仪的扩增 机制5其次，Cas12a 核酸酶通过 crRNA 介导的靶向作用和沃森-克里克碱基配对提高检测的特异性。7最后，使用单管法 A. baumannii-DETECTR 不仅节省时间，还显著降低了扩增子污染的风险19.
本方案详细描述了DNA提取的步骤、目标DNA序列的选择、引物和crRNA的设计、阳性重组质粒的构建、Cas12a-RPA检测体系的建立、RPA扩增条件的优化，以及利用实时荧光检测仪器（如实时荧光PCR仪）对结果进行可视化分析，并包含灵敏度与特异性评估。
A. baumannii-DETECTR 方法有望通过促进及时有效的治疗、强化感染控制以及遏制抗生素耐药性的传播，从而改善患者的治疗效果。本方案可作为 Cas12a-RPA 技术实施的全面指南，提升其在各类医疗环境中的应用价值。然而，必须注意的是，每个步骤都应根据具体的实验室条件和样本类型进行优化，以确保结果的一致性和可靠性。
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方案
1. 构建 A. baumannii -DETECTR
注意：A. baumannii-DETECTR 的构建是一个四步过程，包括引物和crRNA的设计、阳性重组质粒的构建、反应溶液的制备、通过RPA进行等温DNA扩增，以及RPA-CRISPR/Cas12a检测结果的可视化。DETECTR检测的示意图见图1。
- 引物与crRNA的设计（参见 补充文件 1)
- 根据引物设计原则，使用设计工具设计12对引物。获得4条正向引物（F0–F3）和3条反向引物（R1–R3），组合成12对引物（F0R1、F0R2、F0R3、F1R1、F1R2、F1R3、F2R1、F2R2、F2R3、F3R1、F3R2、F3R3）。
- 确保引物的5'端前3-5个核苷酸中包含C或T碱基，避免连续的G序列。同时，引物3'端的最后三个核苷酸最好为G和C碱基，以增强扩增效率。
- 设计引物时应避免自身互补序列，以防形成发夹结构，且引物之间互补或同源碱基数不超过四个。避免引物3'端互补，以防引物二聚体形成。
- 使用美国国家生物技术信息中心（NCBI）的Primer-BLAST工具评估每对引物的特异性，以评价引物的有效性和特异性。
注意：Primer-BLAST 可利用 NCBI 数据库查找与设计引物匹配的序列，帮助用户评估引物的有效性和特异性。 - 引物筛选完成后，使用 LbaCas12a crRNA 骨架序列（5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3'）作为固定序列，设计 CRISPR RNA（crRNA）或引导 RNA（gRNA）。插入靶点特异性片段（5'-GUUAAUACCUAGAGAUAGUG-3'），并确保 PAM 序列位于非互补链的 5' 端。
注意：所有寡核苷酸和crRNA的序列均列于 表1.
- 根据引物设计原则，使用设计工具设计12对引物。获得4条正向引物（F0–F3）和3条反向引物（R1–R3），组合成12对引物（F0R1、F0R2、F0R3、F1R1、F1R2、F1R3、F2R1、F2R2、F2R3、F3R1、F3R2、F3R3）。
- 阳性重组质粒构建
- 使用引物组扩增16S rDNA片段 A. baumannii 16s rDNA-F（正向引物）和 A. baumannii 16S rDNA-R（反向引物）
- 加入1 µL 10 µM F和10 µM R，以及10 µL 5x 快速pFu缓冲液，1 µL 快速pFu DNA聚合酶，4 µL的2.5 mM dNTPs，1 µL 10 ng/µL A. baumannii 基因组DNA和32 µL无核酸酶水加入至50 µL PCR体系中。
- PCR扩增循环条件设置如下：95 °C预变性5 min；随后进行33个循环，每个循环为95 °C变性30 s、55 °C退火30 s、72 °C延伸1 min 20 s；最后72 °C终延伸10 min。
- 使用DNA纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化阳性PCR产物。随后，将纯化的DNA克隆至经BamHI和SalI酶切的pUC57载体中。
注意：该过程将产生含有保守区域的阳性重组质粒。 - 将阳性重组质粒用灭菌的ddH₂O进行10倍倍比稀释2O 以达到每微升1个拷贝至10个拷贝的浓度7 拷贝/µL 将稀释后的质粒于 -20 °C 保存，以备后续实验使用。
- 使用引物组扩增16S rDNA片段 A. baumannii 16s rDNA-F（正向引物）和 A. baumannii 16S rDNA-R（反向引物）
- 溶液配制
- 按如下步骤配制溶液A：每反应加入29.5 µL无引物重悬缓冲液和2.4 µL 10 µM A. baumannii- F 和 10 µM A. baumannii-R，和12.2µL 的 ddH2O，使终体积为46.5 µL。涡旋混匀，短暂离心。随后，将反应混合物加入RPA试剂盒的酶反应管中。用移液器吹打混匀。
注意：本实验采用针对A. baumannii的F和R引物 A. baumannii 基因。请参阅 表1 用于该序列。 - 按如下步骤配制溶液B：每个反应中加入0.24 µL的10 µM ssDNA报告探针、2 µL的10x Cas12a反应缓冲液、1 µL的1 µM crRNA、1 µL的1 µM Cas12a以及10.76 µL的无核酸酶水，混匀。µL 的 ddH2O，以达到终体积15 µL。
注意：探针（单链DNA报告探针）为外购产品，包含一条单链DNA报告探针，其5'端标记有5-羧基荧光素（FAM）荧光基团，3'端标记有黑洞淬灭剂1（BHQ1）淬灭基团。若需检测大量样本，可预先配制足量的溶液B，随后再分装成若干 aliquot 使用。
- 按如下步骤配制溶液A：每反应加入29.5 µL无引物重悬缓冲液和2.4 µL 10 µM A. baumannii- F 和 10 µM A. baumannii-R，和12.2µL 的 ddH2O，使终体积为46.5 µL。涡旋混匀，短暂离心。随后，将反应混合物加入RPA试剂盒的酶反应管中。用移液器吹打混匀。
- 等温DNA扩增（RPA）
- 加入1 µL 10的阳性重组质粒7 将不同引物对的拷贝数/µL加入溶液A中，充分混匀。然后，向溶液中加入2.5 µL的280 mM乙酸镁（MgOAc），充分混匀。
注意：RPA 反应在加入 MgOAc 后立即开始。 - 39 °C孵育20分钟。20分钟后，使用纯化试剂盒对RPA扩增的不同引物产物进行纯化，然后将纯化后的扩增产物在120 V电压下于1%琼脂糖凝胶中电泳10分钟，选择最亮且最宽的条带作为最佳引物对。
注意：对于模板拷贝数较低的情况，在孵育4分钟后，取出EP管，涡旋振荡并短暂离心，然后放回加热装置中继续孵育16分钟。扩增完成后，应极其小心地打开管盖，避免扩增产物污染工作台面。此预防措施可降低后续实验中出现假阳性结果的风险。
- 加入1 µL 10的阳性重组质粒7 将不同引物对的拷贝数/µL加入溶液A中，充分混匀。然后，向溶液中加入2.5 µL的280 mM乙酸镁（MgOAc），充分混匀。
- RPA 扩增体系的优化
注意：在上一步中选定的最佳引物对 F3R3 设置了不同的终浓度，用于 RPA 扩增反应，以筛选出最佳的引物浓度和反应时间。NC 为相应引物浓度的空白对照。- 保持溶液A中其他组分的浓度不变，总体积为46.5 µL。调整RNase-free ddH₂O的体积2O 相应地调整，使引物终浓度分别为 10 µM F3 和 10 µM R3，对应体积浓度为 0.40 µM (2.0 µL)、0.44 µM (2.2 µL)、0.48 µM (2.4 µL) 和 0.52 µM (2.6 µL)。
- 在39 °C下孵育不同时间：10分钟、20分钟、30分钟。
- 使用DNA纯化试剂盒纯化RPA产物，并在1%琼脂糖凝胶中以120 V电泳10分钟，通过分析条带特征确定最佳引物浓度和孵育时间。
- RPA-CRISPR/Cas12a 检测的可视化
- 向溶液B中加入5 µL的RPA产物，充分混匀至均一状态。
- 将样品放入荧光定量PCR仪中，设置FAM通道，在37 °C下每分钟读取一次数值，持续60分钟，共读取60次。
注意：绿色荧光信号可维持数天。为确保系统有效运行，建议进行无DNA和无RNase的检测。
2. 基于RPA-CRISPR/Cas12a检测平台的特异性评估
注意：为了测试 A. baumannii-DETECTR 的特异性，将 A. baumannii、Streptococcus pneumoniae、Staphylococcus aureus、Rickettsia mooseri、Enterobacter、Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Chlamydia psittaci、Legionella、Coxiella burnetii、Serratia 以及人源样本的核酸进行了 DETECTR 检测。
- 通过使用参考的DNA试剂盒或通过将细菌在水中煮沸来获得来自不同物种的DNA模板。确保所有模板的浓度相等。使用水作为阴性对照。
- 将10 ng或1 µL的DNA模板加入含有F3R3引物的溶液A中。加入2.5 µL的MgOAc，充分混匀，并在39 °C下孵育20分钟。
- 20分钟后，将上一步反应产物的5 µL加入溶液B中并混匀。
- 放入荧光定量PCR仪中，将通道设置为FAM，在37 °C下每分钟读取一次荧光值，共读取60次，持续60分钟。
3. 基于RPA-CRISPR/Cas12a检测平台的灵敏度评估
- 使用已配制浓度为 1-107 拷贝/µL 的阳性重组质粒作为反应模板，阴性对照使用水。
- 按照步骤 2.2–2.4 进行操作。
注意：引物组 RPA-F3 和 RPA-R3 旨在从阳性重组质粒中扩增一段较短的 174 个碱基对的片段。
4. 样品在紫外光下及侧向流动试纸检测期间的准备工作
- 取出所需数量的试纸条，并做好相应标记。
- 分别将步骤 2 和步骤 3 中扩增产物各 10 µL 转移至不同的 PCR 管中，然后每管加入 40 µL 的 ddH2O。
注意：若使用自行配制的反应体系，建议探索最佳稀释比例。 - 进行检测。
- 将含有扩增产物的 PCR 管置于凝胶成像仪下，观察是否存在荧光信号。
- 将试纸条插入 PCR 管中，确保样品垫一端朝下。
- 室温静置 5–10 分钟后读取结果。在此时间后，确保液体液面未超过最大标记线，再进行后续操作。
- 若 T 线无显色，则判读结果为阴性；若 T 线肉眼可见显色，则判读结果为阳性，表明核酸探针已被 Cas 酶切割，且 Cas 酶已被激活；若 C 线和 T 线均无显色，则判读结果无效。
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结果
本研究中，我们介绍了一种名为 A. baumannii-DETECTR 的新型便携式诊断平台，该平台结合了RPA的等温扩增效率与CRISPR-Cas12a系统，可实现对 A. baumannii 的快速、可靠的现场鉴定。DETECTR检测方法的示意图见图1。
根据引物设计原则，使用设计工具设计了十二对引物。共获得四条正向引物（F0-F3）和三条反向引物（R1-R3），由此组合成12对引物（F0R1、F0R2、F0R3、F1R1、F1R2、F1R3、F2R1、F2R2、F2R3、F3R1、F3R2、F3R3）。在39 °C下进行RPA扩增20分钟之后，将RPA-PCR产物在1%琼脂糖凝胶中以120 V电泳10分钟，以确定最佳引物组合。结果显示F3R3引物对效果最优，其条带最亮且最浓密（图2）。
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讨论
传统的A. baumannii感染诊断方法存在多种限制，使其在即时检测中的可及性和可行性较低27。例如，PCR具有良好的灵敏度和特异性，但需要专业的热循环设备和复杂的操作流程，且必须由专业人员操作。本文介绍了一种新方法，即结合重组工程的RPA与CRISPR-LbaCas12a基因编辑技术，称为A. baumannii-DETECTR检测法，可实现高效的基因操作。该方法为Acinetobacter baumannii感染以及其他细菌病原体的诊断提供了快速、灵敏且特异的检测手段。工作流程如图1所示。
我们的方法在诊断和管理感染方面具有显著优势，有助于促进患者康复，并通过克服现有诊断技术的不足来遏制鲍曼不动杆菌（A. baumannii）的传播。A. baumannii-DETECTR 系统被证实能够以高特异性和高灵敏度检测出 A. baumannii（
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
本工作由吉林省科学技术发展计划项目（20240305027YY）和吉林省财政厅（JLSWSRCZX2023-55，JLSWSRCZX2021-041）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| -20 °C 冷冻柜 | Haier | HYCD-290 | 中国 |
| 琼脂糖基础 | BioFroxx | 1110GR100 | 中国 |
| 所有寡核苷酸和crRNA均由公司合成 | www.comatebio.com | ||
| Cas12a切割底物 - 单链DNA - 荧光型 | EZassay Biotech. Co. Ltd. | DNA-FAM-BHQ | 中国 |
| Cas12a切割底物 - 单链DNA - 试纸型 | EZassay Biotech. Co. Ltd. | DNA-FAM-BIO | 中国 |
| 电泳装置 | BIO-RAD | POWER PAC1000 | 美国 |
| 荧光定量PCR仪 | BIO-RAD | CFX Connect | 美国 |
| 凝胶成像系统 | BIO-RAD | Gel Doc 2000 | 美国 |
| https://ezassay.com/rna | |||
| https://www.ezassay.com/primer | |||
| https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast | |||
| 侧向流动试纸条（生物素/FAM） | EZassay Biotech. Co. Ltd. | HD-FMBO | 中国 |
| LbaCas12a (Cpf1) 增强蛋白 | EZassay Biotech. Co. Ltd. | CAS-12E-001 | 中国 |
| LED透射仪 | LABGIC | BL-20 | 中国 |
| 乙酸镁，MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | 英国 |
| 微量离心机 | allsheng | Mini-6k | 中国 |
| PCR条形管 | PCR条形管 | PST-0208-FT-C | 中国 |
| TGrade干浴孵育器 | Tiangen biochemical technology | OSE-DB-01 | 中国 |
| 天根细菌DNA提取试剂盒 | Tiangen biochemical technology | DP302-02 | 中国 |
| TIANamp 细菌DNA提取试剂盒 | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.; LTD. | DP302 | 中国 |
| TransStart FastPfu DNA聚合酶 | TransGen Biotech. Co. Ltd. | AP221 | 中国 |
| TwistAmp Basic试剂盒 | TwistDX | TABAS03KIT | 英国 |
| 通用DNA纯化试剂盒 | Tiangen biochemical technology | DP214-03 | 中国 |
参考文献
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