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Summary

为了促进鲍 曼不动杆菌的快速和精确检测，我们提出了一种方案，该方案采用重组酶聚合酶扩增 （RPA） 与 LbaCas12a 核酸内切酶相结合来鉴定 鲍曼不 动杆菌感染。

Abstract

鲍曼不动杆菌是一种革兰氏阴性菌，因引起严重感染和高死亡率而臭名昭著。快速准确地检测 鲍曼不动杆菌 对于及时治疗、有效控制感染和遏制抗生素耐药性至关重要。然而，没有合适的方法可以快速简便地现场检测 鲍曼不动杆菌。DNA 核酸内切酶靶向 CRISPR 反式报告基因 （DETECTR） 系统通过将 Cas12a 的靶标特异性识别功能与重组酶聚合酶扩增 （RPA） 的等温扩增效率相结合，提供了一种快速、精确和灵敏的鲍 曼不 动杆菌检测方法。该方案详细介绍了使用 RPA 结合 LbaCas12a 核酸内切酶检测 鲍曼不 动杆菌。本文描述了以下步骤：DNA 的提取，特定 DNA 序列的选择，引物和 CRISPR RNA （crRNA） 的设计，阳性重组质粒的构建，Cas12a-RPA 测定的设置，RPA 扩增系统的优化，使用荧光检测工具（如实时 PCR 仪器）对 RPA-CRISPR/Cas12a 测定进行可视化， 以及敏感性评估和特异性评估。

Introduction

在临床微生物学中，检测鲍曼不动杆菌感染是一项重大挑战。这种革兰氏阴性菌可引起具有严重临床症状的感染，即使死亡率很高，尤其是在免疫功能低下患者中¹。传统的基于培养的病原体感染检测方法非常耗时且可能缺乏敏感性，这可能会延迟抗生素治疗并损害患者预后。快速准确地鉴定鲍曼不动杆菌对于有效治疗和疫情控制至关重要。已经探索了采用核酸扩增的分子技术来满足这一需求。然而，这些方法通常需要复杂的热循环设备，并且可能会受到训练有素的技术人员和成熟实验室的限制。为了克服这些挑战，研究越来越集中在开发等温扩增方法 ^2,3,4。

重组酶聚合酶扩增 （RPA） 是由 Piepenburg 等人 ⁵ 建立的一种方法，用于扩增 DNA，类似于聚合酶链反应 （PCR），但不需要温度循环。该方法包括 50 mM Tris （pH 7.5）、100 mM 乙酸钾、14 mM 乙酸镁、2 mM DTT、5% PEG20000（一种高分子量聚乙二醇）、200 μM dNTP、3 mM ATP、50 mM 磷酸肌酸、100 μg/mL 肌酸激酶、120 μg/mL UvsX、30 μg/mL UvsY、900 μg/mL Gp32、30 μg/mL Bsu LF、 450 nM 引物和 DNA 模板。扩增过程从重组酶蛋白 UvsX 在 3 mM ATP 和 5% PEG20000存在下与引物结合开始，形成重组酶-引物复合物。然后，该复合物促进引物与双链 DNA 上的同源序列结合。

在 UvsY 的帮助下，重组酶 UvsX 促进引物和模板链之间的交换，导致靶 DNA 的一条链发生位移。gp32 有助于维持单链 DNA 结构。最后，重组酶解离，能够置换 DNA 链的 DNA 聚合酶 （Bsu LF） 与引物的 3′ 端结合，在脱氧核糖核苷三磷酸 （dNTP） 存在下将其伸长。这个过程循环重复，实现指数扩增。所有扩增过程均可在 20-40 分钟内完成，并在 37 °C 至 42 °C 之间相对恒定的温度下完成。 该温度范围与生理温度大致相同，这使得 RPA 可以在极简的环境中进行，使 RPA 成为 DNA 检测和分析的多功能且高效的工具。

成簇的规则间隔短回文重复序列 （CRISPR） 和 CRISPR 相关蛋白 （CRISPR-Cas） 系统在细菌和古细菌中起着适应性免疫机制的作用，包括 I 类和 II 类系统。II 类包括 Cas12 （a， b， f）、Cas13 （a， b） 和 Cas14 等蛋白质，它们可识别和切割由 CRISPR RNA （crRNA） 引导的目标 DNA 或 RNA ^6,7,8 。LbaCas12a （或 Cpf1） 是一种 crRNA 引导的 DNA 核酸内切酶。crRNA 在 CRISPR-Cas 系统中用作引导 RNA，在那里它与 Cas 蛋白复合。它利用其间隔区与靶 DNA 配对，有效地将蛋白质复合物引导至靶序列。序列 5′-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3′ 作为保守的 crRNA 重复序列，是所有 LbaCas12a crRNA 中的常数元件。在此重复之后是一个靶标特异性片段，该片段根据预期的 DNA 靶标而有所不同。该靶向序列的长度范围为 18 至 24 个核苷酸。

PAM（原间隔区相邻基序）序列（TTTV，其中 V 可以是 A、C 或 G）位于 DNA 靶标非互补链的 5′ 末端。Cas12a 在 PAM 序列上切割靶标双链 DNA。随后，活化的 Cas 蛋白执行单链 DNA （ssDNA） 的非特异性反式切割9,10,11,12。因此，用荧光基团和淬灭基团标记的 ssDNA 发生切割，导致侧支切割后发出荧光信号 ^8,13。可以使用荧光读数仪定量荧光强度，以进行精确的核酸检测¹⁴。值得注意的是，Cas12a 广泛用于 DNA 分析，其靶序列的结合和切割取决于对原始间隔区相邻基序 （PAM） 的识别，而 Cas13a 则独立于此类要求运行。

CRISPR-Cas 系统 15,16,17 促进单次反应内的切割 18,19,20,21。将上述两者结合起来可以创建一种称为鲍曼不动杆菌-DETECTR（LbaCas12a 启用靶向鲍曼不动杆菌检测）的稳健工具，用于核酸检测 22,23,24。该方案展示了将 RPA 与 Cas12a 的 DNase 活性结合使用，以特异性靶向和切割鲍曼不动杆菌 16s rDNA 基因内的 crRNA 引导序列，从而能够灵敏和精确地检测病原体。

与传统检测方法相比，鲍曼不动杆菌-DETECTR 方法具有多项优势^25,26。首先，RPA 的等温特性通过其独立于热循环仪的扩增机制简化了作程序并降低了成本⁵。其次，Cas12a 核酸内切酶通过 crRNA 介导的靶向和 Watson-Crick 碱基配对⁷ 提高了检测的特异性。最后，使用 A. baumannii-DETECTR 的单管方法不仅可以节省时间，还可以显著降低扩增子污染的风险¹⁹。

该方案概述了提取 DNA 提取、选择目标 DNA 序列、设计引物和 crRNA、构建阳性重组质粒、建立 Cas12a-RPA 测定、优化 RPA 扩增以及使用荧光检测仪器工具（如实时 PCR 机）可视化结果的步骤， 完成敏感性和特异性评估。

鲍曼不动杆菌-DETECTR 方法通过促进及时有效的治疗、强有力的感染控制和遏制抗生素耐药性传播，有望提高患者预后。该协议可以作为实施 Cas12a-RPA 技术的综合指南，增强其在各种医疗保健环境中的实用性。然而，需要注意的是，每个步骤都应根据特定的实验室条件和样品的种类进行优化，以确保结果的一致性和可靠性。

Protocol

1. 鲍曼不动杆菌 -DETECTR 的构建

注： 鲍曼不动杆菌-DETECTR 的构建是一个四步过程，涉及引物和 crRNA 的设计、阳性重组质粒的构建、反应溶液的制备、RPA 的等温 DNA 扩增以及 RPA-CRISPR/Cas12a 测定的可视化。DETECTR 测定的示意图如图 1 所示。

1. 引物和 crRNA 的设计（参见 补充文件 1）
   1. 使用 Design Tools（设计工具）在 Primer 设计原则的基础上设计 12 对引物。获得四个正向引物 （F0-F3） 和三个反向引物 （R1-R3），以组成十二对引物（F0R1、F0R2、F0R3、F1R1、F1R2、F1R3、F2R1、F2R2、F2R3、F3R1、F3R2、F3R3）。
      1. 确保引物的 5′ 末端在前 3-5 个核苷酸内包含 C 或 T 碱基，而不是连续的 G 延伸。此外，确保 3′ 末端的最后三个核苷酸是理想的 G 和 C 碱基，以增强扩增。
      2. 设计不含自互补序列的引物以避免发夹形成，并且它们之间的互补或同源碱基不超过四个。避免 3′ 末端互补性，以避免引物二聚化。
   2. 使用美国国家生物技术信息中心 （NCBI） 的 Primer-BLAST 工具评估每个引物对的特异性，以评估引物的功效和特异性。
      注意：Primer-BLAST 可以利用 NCBI 数据库查找与设计引物匹配的序列，帮助用户评估引物的功效和特异性。
   3. 引物筛选后，使用 LbaCas12a crRNA 支架序列 （5′-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3’） 作为固定序列设计 CRISPR RNA （crRNA） 或向导 RNA （gRNA）。掺入靶标特异性片段 （5′-GUUAAUACCUAGAGAUAGUG-3’），确保 PAM 基序位于非互补链的 5′ 末端。
      注：所有寡核苷酸和 crRNA 的序列如 表 1 所示。
2. 阳性重组质粒构建
   1. 使用引物组 A. baumannii 16s rDNA-F（正向引物）和 A. baumannii 16s rDNA-R（反向引物）扩增 16s rDNA 片段。
      1. 向 50 μL PCR 系统中加入 1 μL 10 μM F 和 10 μM R、10 μL 5x FastpFu 缓冲液、1 μL FastpFu 聚合酶、4 μL 2.5 mM dNTP、1 μL 10 ng/μL 鲍曼不动杆菌 基因组 DNA 和 32 μL 无核酸酶水。
      2. 将PCR循环条件设置如下：在95°C下初始变性5分钟，然后在95°C下变性30秒，在55°C下退火30秒，并在72°C下延伸1分钟和20秒。最后，在 72°C 下进行 10 分钟以进行最终延伸。
   2. 要纯化阳性 PCR 产物，请根据制造商的说明使用 DNA 纯化试剂盒。此后，将纯化的 DNA 克隆到 pUC57 载体中，该载体已用 BamHI 和 SalI 酶消化。
      注：此过程将导致产生包含保守区域的阳性重组质粒。
   3. 用灭菌的 ddH₂O 以 10 倍的增量连续稀释阳性重组质粒，以达到 1 拷贝/μL 至 10⁷ 拷贝/μL 的浓度。将稀释的质粒储存在 -20 °C 用于后续实验。
3. 溶液制备
   1. 按如下方式制备溶液 A：对于每个反应，加入 29.5 μL 无引物再水化缓冲液、2.4 μL 10 μM 鲍曼不动杆菌-F 和 10 μM 鲍曼不动杆菌-R 以及 12.2μL ddH₂O，以达到 46.5 μL 的最终体积。涡旋并短暂旋转。接下来，将反应混合物添加到 RPA 试剂盒中的酶反应管中。移液管混合。
      注：鲍曼不动杆菌-F 和 R 的引物用于靶向 鲍曼不动杆菌 基因的测定中。顺序见 表 1 。
   2. 按如下方式制备溶液 B：对于每个反应，加入 0.24 μL 10 μM ssDNA 报告基因、2 μL 10x Cas12a 反应缓冲液、1 μL 1 μM crRNA、1 μL 1 μM Cas12a 和 10.76μL ddH₂O，以达到 15 μL 的最终体积。
      注：探针 （ssDNA 报告基团） 是购买的，由一个单链 DNA 报告基团组成，该报告基团在 5′ 端用 5-羧基荧光素 （FAM） 荧光团标记，在 3′ 端用黑洞淬灭基团 1 （BHQ1） 淬灭基团标记。在需要检测大量样品的情况下，制备大量溶液 B，然后将样品分成等分试样。
4. 等温 DNA 扩增 （RPA）
   1. 将 1 μL 10⁷ 拷贝/μL 的阳性重组质粒添加到具有不同引物对的溶液 A 中;充分混合。然后，向溶液中加入 2.5 μL 280 mM 乙酸镁 （MgOAc） 并充分混合。
      注意：添加 MgOAc 后立即开始 RPA 反应。
   2. 在 39 °C 孵育 20 分钟。20 分钟后，使用带有纯化试剂盒的 RPA 纯化用不同引物扩增的产物，然后在 120 V 下在 1% 琼脂糖凝胶上运行干净的扩增子 10 分钟，以选择最亮和最宽的条带作为最佳引物对。
      注意：对于低模板拷贝数，4 分钟后，取出 EP 管，涡旋并短暂旋转;然后将其放入加热装置中再放置 16 分钟。扩增后，应格外小心地打开试管，以避免扩增子污染工作台面。这种预防措施将降低在后续实验程序中诱导假阳性结果的风险。
5. RPA 放大系统优化
   注：将上一步中选择的最佳引物对 F3R3 设置为不同的 RPA 扩增反应终浓度，以筛选出最佳引物浓度和时间。NC 是相应引物浓度的空白对照。
   1. 保持溶液 A 中其他组分的浓度恒定且总体积为 46.5 μL。相应地调整不含 RNase 的 ddH₂O 的体积，以在 0.40 μM （2.0 μL）、0.44 μM （2.2 μL）、0.48 μM （2.4 μL） 和 0.52 μM （2.6 μL） 处达到 10 μM F3 和 10 μM R3 的最终引物浓度， 分别。
   2. 在 39 °C 下孵育不同时间：10 分钟、20 分钟、30 分钟。
   3. 使用 DNA 纯化试剂盒清洁 RPA 产物，并在 1% 琼脂糖凝胶上于 120 V 下电泳 10 分钟，以通过分析条带的特性来确定最佳引物浓度和孵育时间。
6. RPA-CRISPR/Cas12a 检测的可视化
   1. 将 5 μL RPA 产品加入溶液 B 中，充分混合直至均匀。
   2. 将样品放入荧光定量PCR仪器中，设置FAM通道，并在37°C下每分钟读取60分钟，60x，总共60分钟。
      注：绿色荧光信号可持续数天。为确保系统有效运行，最好进行无 DNA 和 RNase 检测。

2. 基于 RPA-CRISPR/Cas12a 的检测平台的特异性评价

注：为了检测鲍曼不动杆菌-DETECTR 的特异性，对鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、穆氏立克次体、肠杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、克雷伯菌、鹦鹉热衣原体、军团菌、贝氏菌、沙拉氏菌a 和人类样品的核酸进行了 DETECTR 测试。

1. 使用参考的 DNA 试剂盒从各种物种获得的 DNA 模板，或通过在水中煮沸细菌来分离它们。确保所有模板具有相同的浓度。用水作为阴性对照。
2. 向含有 F3R3 引物的溶液 A 中加入 10 ng 或 1 μL DNA 模板。加入 2.5 μL MgOAc，充分混合，并在 39 °C 下孵育混合物 20 分钟。
3. 20 分钟后，向溶液 B 中加入 5 μL 上一步的产物并混合。
4. 置于荧光定量PCR仪器中，将通道设置为FAM，并在37°C下每分钟读取一次该值，共60 x 60分钟。

3. 基于 RPA-CRISPR/Cas12a 的检测平台的灵敏度评价

1. 使用已制备浓度为 1-10⁷ 拷贝/μL 的阳性重组质粒作为反应模板。用水作为阴性对照。
2. 按照 2.2 – 2.4 的步骤执行该方法。
   注：引物组 RPA-F3 和 RPA-R3 旨在从阳性重组质粒中扩增 174 个碱基对的较短片段。

4. 样品在紫外光和 LFS 检测下的制备

1. 取出所需数量的试纸并适当地贴上标签。
2. 将步骤 2 和 3 中的 10 μL 扩增产物分别转移到单独的 PCR 管中。然后，向每个试管中加入 40 μL ddH₂O。
   注：如果使用自行制备的反应系统，建议探索最佳稀释比例。
3. 执行测试。
   1. 将含有扩增产物的 PCR 管置于透射仪上，以评估荧光的存在。
   2. 将试纸插入 PCR 管中，样品垫端朝下。
   3. 让它在室温下静置 5-10 分钟以读取结果。在此之后，请确保液位不超过最大线，然后再继续。
   4. 如果 T 线不显示颜色，则将结果解释为负数。如果肉眼可以看到 T 线，则将结果解释为阳性，表明核酸探针已被 Cas 酶切割，并且 Cas 酶已被激活。如果 C 线和 T 线均未显示颜色，则认为结果无效。

Representative Results

Discussion

鲍 曼不动杆菌 感染的传统诊断方法存在各种限制，使其更难进行即时检测²⁷。例如，PCR 具有良好的灵敏度和特异性，但需要专门的热循环设备和复杂的工作流程，必须由专业人员作。这里介绍的新方法将 RPA 和 CRISPR-LbaCas12a 基因组编辑与重组相结合，称为 鲍曼不动杆菌-DETECTR 测定，可实现高效的基因作。它为 鲍曼不动杆菌 感染以及其他细菌病原体的诊断提供了一种快速、灵敏和特异性的检测方法。该工作流如图 1 所示。

我们的方法在诊断和管理感染方面特别有利，这应该会通过克服现有诊断技术的缺点来促进患者康复并减轻 鲍曼不 动杆菌的传播。发现鲍 曼不动杆菌-DETECTR 系统以高特异性和灵敏度识别 鲍曼不动杆菌 （图 5 和 图 6）。我们的研究结果显示，在实时评估过程中，只有 鲍曼不 动杆菌基因组表现出阳性荧光倍数变化，而所有其他物种的基因组都显示出阴性结果（图 5）。

为了评估 RPA-CRISPR/Cas12a 检测平台的灵敏度，采用 鲍曼不动杆菌阳性的重组质粒 pUC57-16s rDNA 作为靶标来确定系统的检测限 （LOD）。在基于荧光的 RPA-CRISPR/Cas12a 检测中，检测范围从 1 拷贝/微升到 10⁷ 拷贝/微升，与阴性对照组相比，1 拷贝/μL 组观察到荧光强度显著增强（图 6）。重要的是，对于实时诊断，检测结果可以通过手持式便携式设备直接可视化，独立于实验室设备，这对于实时诊断至关重要。

关于协议²⁶，必须考虑几个关键因素。首先，鉴于 鲍曼不动杆菌-DETECTR 检测的高灵敏度，在样品采集过程中防止交叉污染是必不可少的。此外，反应试剂应避免阳光直射。遵守所有程序步骤对于获得最佳结果至关重要。应掺入由含有 鲍曼不动杆菌特异性基因片段的质粒组成的阳性对照，以验证 鲍曼不动杆菌-DETECTR 系统在实际应用中的正常功能。

该方案表明，可以针对特定的实验室条件和样品类型（例如引物浓度、反应时间和其他变量）优化参数。在本实验中，选择了 RPA 扩增的最佳引物组合、引物浓度和反应时间，以产生最高的扩增效率和特异性。这是通过琼脂糖凝胶电泳确定的（图 2 和图 3）。此外，使用含有鲍曼不动杆菌基因组保守区域的阳性重组质粒作为对照，以确保方案的准确性。值得注意的是，市售细菌基因组 DNA 提取试剂盒在该方案中提供了一种标准化且可靠的 DNA 提取方法。然而，在未来的研究中，不同的样品类型，如临床或环境样品，可能需要特定的提取方法²⁸ 来有效分离鲍曼不动杆菌 DNA。

在没有来自阳性对照的可检测荧光信号的情况下，反应混合物中可能存在抑制剂，因此需要更换试剂。相反，如果荧光强度不足以进行明确区分，则延长孵育时间可能是有益的。然而，长时间孵育也可能导致假阳性²⁶。

目前鲍 曼不 动杆菌的检测方法需要使用昂贵的 PCR 设备、固定的作位置和专业人员。相比之下，本文提出的方法有助于在现场环境中准确和灵敏地诊断 鲍曼不动杆菌 ，使其适用于更广泛的人群。

等温扩增和通过荧光收集的数据特性使鲍曼不动杆菌-DETCTER 工作流程简单且设备要求低，并且能够在偏远地区或爆发期间进行快速病原体检测。RPA-LFS ^29,30,31,32 是一种新型等温核酸扩增技术，由于其作简单和减少的时间需求，在病毒、细菌、真菌和寄生病原体的检测中获得了显着的关注。该方案详细说明了样品在紫外 （UV） 光或透射仪和侧向层析试纸 （LFS） 检测下的荧光信号。它可以避免对高精度仪器和专业技术人员的依赖，因为目视检查可在短时间内产生结果（图 7），从而消除了对昂贵和复杂的实验室设备的需求和作人员。此外，单管方法不仅节省时间，而且降低了扩增子污染的风险³³。

未来的研究应旨在改进该方法，使其适用于各种类型的样品和不同的环境条件，例如探索更高效、成本更低的 DNA 提取技术。鲍 曼不动杆菌-DETECTR 不仅适用于临床诊断，还可用于环境评估、监测和疫情管理，使社区和医院能够快速识别 鲍曼不动杆菌。此外，通过修饰 crRNA 和引物，这种分子诊断方法可以适应各种呼吸道细菌感染的检测，例如 肺炎链球菌、 金黄色葡萄球菌 和 肠杆菌。

综上所述， 鲍曼不动杆菌-DETECTR 由于其高灵敏度和特异性、用户友好的设计和便携性，可以尽可能快速准确地识别 鲍曼不 动杆菌。这种方法可以通过促进及时有效的治疗、感染控制和减轻抗生素耐药性的扩散来改善患者的健康结果，同时还可以应对鲍 曼不 动杆菌感染日益增长的威胁。

Materials

 -20 °C Freezer	Haier	HYCD-290	China
Agarose Basic	BioFroxx	1110GR100	China
All oligonucleotides and crRNA were synthesized by company	www.comatebio.com
Cas12a cutting substrate – ssDNA – fluorescent type	EZassay Biotech. Co. Ltd.	DNA-FAM-BHQ	China
Cas12a cutting substrate – ssDNA – test paper type	EZassay Biotech. Co. Ltd.	DNA-FAM-BIO	China
Electrophoresis apparatus	BIO-RAD	POWER PAC1000	USA
Fluorescence quantitative PCR instrument	BIO-RAD	CFX Connect	USA
Gel Imaging System	BIO-RAD	Gel Doc 2000	USA
https://ezassay.com/rna
https://www.ezassay.com/primer  
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast
Lateral flow paper strip (Biotin/FAM)	EZassay Biotech. Co. Ltd.	HD-FMBO	China
LbaCas12a (Cpf1) enhanced protein	EZassay Biotech. Co. Ltd.	CAS-12E-001	China
LED Transilluminator	LABGIC	BL-20	China
Magnesium acetate, MgOAc	TwistDx	TABAS03KIT	UK
Microcentrifuge	allsheng	Mini-6k	China
PCR strip tubes	PCR strip tubes	PST-0208-FT-C	China
TGrade Dry Bath Incubator	Tiangen biochemical technology 	OSE-DB-01	China
Tianamp Bacteria DNA Kit	Tiangen biochemical technology 	DP302-02	China
TIANamp Bacteria DNA Kit 	TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.; LTD.	DP302	 China 
TransStart FastPfu DNA Polymerase 	TransGen Biotech. Co. Ltd.	AP221	 China 
TwistAmp Basic Kit	TwistDX	TABAS03KIT	UK
Universal DNA Purification Kit	Tiangen biochemical technology 	DP214-03	China