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荧光标记法用于可视化斑马鱼中低表达蛋白

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DOI：

10.3791/67616

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2025年1月24日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Faculty of Medicine and Life Sciences, Xiamen University, 2Technology Center, Shanxi Xinghuacun Fenjiu Distillery Co., Ltd., 3Research Unit of Cellular Stress of CAMS, Cancer Research Center of Xiamen University, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 4Laboratory Animal Center, Xiamen University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种在斑马鱼幼鱼中用荧光蛋白标签标记蛋白质的实验方案，该方案为新近开发并经过改进的方法 体内 该系统特别适用于可视化斑马鱼中低丰度蛋白。

摘要

CRISPR/Cas9介导的敲入（KI）技术可实现斑马鱼中更便捷的荧光蛋白标记Danio rerio），一种优选的模式生物 体内 由于其在早期发育阶段具有透明性，斑马鱼适用于活体成像。本文提供了一套详细的实验方案，用于在斑马鱼幼鱼中实现高效荧光基因敲入（KI）、快速筛选KI founder个体以及低丰度蛋白的示踪，为后续开展斑马鱼生理与病理生理学研究奠定关键基础。本方案涵盖了针对目标基因的sgRNA设计、sgRNA体外转录、Cas9 mRNA合成、显微注射条件优化、突变体筛选及阳性后代鉴定等完整步骤。 体外 转录，Cas9 mRNA 体外 转录， 体内 sgRNA筛选效率最高的个体，供体质粒的设计与构建，斑马鱼幼体的显微注射，KI founder的筛选及斑马鱼活体成像。本文包含并讨论了该方案的关键步骤、故障排除建议、质量控制方法以及优势与应用。该方案成本低、结果快速且准确，已通过多次实验验证。

引言

作为一种被广泛接受的模式生物，斑马鱼（Danio rerio在发育、再生、肿瘤发生、感染和免疫等领域的科学研究中被广泛应用1,2,3,4,5斑马鱼特别适用于 体内 使用PTU（1-苯基-2-硫脲）处理后进行活体成像，PTU是一种抑制黑色素生成的有毒化合物，可使斑马鱼幼鱼在相对较长时间内保持透明状态6. 经基因改造的透明斑马鱼品系，例如 casper7 和晶体8，也可用于实现活体可视化及谱系追踪直至成年。除了这些旨在克服成年鱼类色素干扰以改善活体成像效果的努力外，我们的研究还致力于开发高效的基因编辑策略，以提高荧光蛋白标记的效率并减少人为干预。

基于CRISPR/Cas9介导的微同源末端连接（MMEJ）的基因敲入技术由于具有相对较高的敲入效率，现已被广泛应用于包括斑马鱼在内的多种生物体的遗传修饰中9,10,11,12. 为实现成功 体内 成像过程中需要解决两个挑战：一是重组过程引入的插入缺失突变（indels）或疤痕；二是某些目标基因内源性表达水平较低，导致共表达的荧光标签信号微弱，从而无法成功检测 体内 检测。为了实现高效且准确的蛋白质标记，并尽量减少对内源性基因表达水平的干扰，近期一项研究报道了一种优化策略，该策略结合了荧光信号放大技术 "VH" 标记方法与优化的生殖系筛选流程13，该方法通过优化供体质粒骨架并结合聚合酶链式反应（PCR）与荧光验证，更适用于低表达基因的荧光标记，在实现生殖系筛选时比以往方法更高效，且耗时和工作量成本最低。本文提供了该报道方法的详细分步操作流程，包括胚胎制备与斑马鱼饲养、sgRNA设计等步骤， 体外 sgRNA的转录 体外 Cas9 mRNA转录，斑马鱼胚胎显微注射 体内 筛选效率最高的sgRNA，供体质粒的设计与构建，定点整合斑马鱼的基因分型，定点整合生殖系筛选，以及定点整合斑马鱼的成像与表型分析。该一体化实验方案提供了一种前沿的荧光标记方法，无疑将推动斑马鱼在各个科学领域的研究应用，并使来自不同学术背景的读者受益。

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方案

所有斑马鱼的饲养和实验均经过厦门大学实验动物管理与伦理委员会审查和批准，并严格遵守厦门大学实验动物中心规定的良好动物实验规范。本研究符合所有相关的动物使用伦理规定。

注意：所有成年及幼体斑马鱼均按照标准方案在厦门大学斑马鱼养殖系统中饲养，温度为 28.5 °C，光照周期为 13 小时光照/11 小时黑暗。胚胎置于胚胎缓冲液（表 1）中，在可控培养箱内培养（温度：28 ± 0.5 °C；光照：13 小时光照/11 小时黑暗周期）。所有斑马鱼的喂养和常规监测每日进行两次（上午 9 点和下午 4 点）。本研究使用的野生型（WT）品系为 Tübingen（Tü）。

1. 选择目的基因并设计向导RNA

  1. 了解目标基因的相关信息。在数据库（https://zfin.org/）中进行检索，并确认已知该基因的变异体数量。确定要操作的变异体，并从 Ensembl（https://www.ensembl.org/）下载目标基因的信息，包括基因组序列、cDNA 序列和编码序列（CDS）。在序列中标注外显子、内含子、UTR 区域、起始密码子和终止密码子。
  2. 选择目标基因终止密码子（TAA、TAG 或 TGA）上游不超过 200 bp 的 CDS 区域作为 sgRNA 靶向区域。
    注意：最好通过 DNA 测序确认该区域无单核苷酸多态性（SNPs）。
  3. 使用 CRISPRscan 网站（https://www.crisprscan.org/）在选定的靶向区域内设计候选 sgRNA，并预测其编辑效率。 
    1. 将 DNA 序列输入设计框中。
    2. 选择相应参数，包括物种、脱靶位点允许的最大错配数、核酸酶类型和启动子。本例中选择 斑马鱼- Danio rerio，不允许错配，Cas9-NGG，以及 体外 T7 启动子。
    3. 点击 获取 sgRNA 以获得若干候选 sgRNA。从中选择 5–7 个 CRISPRscan 评分高且脱靶评分低的 sgRNA，用于后续的 体内 筛选。
  4. 设计位于 sgRNA 靶位点两侧的 PCR 引物，扩增产物长度约为 500 bp，用于后续的 PCR 扩增、酶切检测和测序，以验证 sgRNA/Cas9 显微注射后的基因敲除效率。上下游区域各选择约 20 bp 的序列，确保其 GC 含量约为 50%，Tm 值在 50–55°C 范围内。
    注意：如需进行引物组合，可分别设计两条上游引物和两条下游引物。

2. sgRNA 的制备

注意：常用的sgRNA支架序列（图1）已克隆至质粒中（材料表）。

  1. 使用所示引物和PCR混合物对T7启动子-sgRNA连接序列进行PCR扩增 表2 和 表3，分别进行。在PCR仪中运行PCR程序 表4. 进行凝胶电泳（琼脂糖凝胶，1.2% 琼脂糖溶于TAE缓冲液；TAE缓冲液[表1]; 200 V；约5分钟）取2 µL PCR产物进行电泳，以确认产物正确（分子量约为150 bp）。
  2. 使用纯化试剂盒纯化PCR产物（材料表）或其他商业试剂盒，按照制造商说明书操作。
    注意：此后应使用无RNase的试剂和材料，并需特别小心操作，以避免RNase污染（详见讨论部分）。
    1. 将结合缓冲液以5:1的体积比加入PCR产物中并混匀。将混合液加入置于2 mL收集管中的柱子中。在17,900 × g 在25 °C下孵育1分钟。弃去流出液，将柱子放回原来的收集管中。
    2. 向柱中加入 750 µL 洗涤缓冲液，于 17,900 × g 在25 °C下孵育1分钟。弃去流出液，将柱子放回原来的收集管中。在17,900 × g 25 °C 下孵育 2 分钟。将柱置于干净的 1.5 mL 离心管中。
    3. 向柱中加入 20 µL 无核酸酶水，于 17,900 × g 在25 °C下孵育2分钟，以洗脱DNA，并使用分光光度计测定其浓度。
  3. 使用T7 RNA合成系统 材料表 或同等试剂盒 体外 转录250 ng纯化后的DNA。操作和条件需保持无RNase。
    1. 在无RNase的PCR管中按以下步骤准备反应 表3，轻轻混匀。在金属浴中37 °C孵育2小时。
    2. 加入0.5 µL DNase I（无RN酶），轻轻混匀。在金属浴中37 °C孵育15–20分钟。
    3. 乙醇沉淀
      1. 向每种反应体系中加入无RN酶水，使最终体积达到20 µL，并将样品转移至1.5 mL离心管中。
      2. 加入50 µL 100%乙醇（2.5倍体积，RNase-free），充分混匀，将混合物置于冰上10分钟，然后在21,000 × g 4 °C 下 15 分钟。
      3. 弃去上清液，用500 µL 75%乙醇（无RNase）洗涤沉淀，然后在21,000 × g 4 °C下离心5分钟。
      4. 弃去上清液，将沉淀物置于金属浴中45 °C干燥，再用40 µL无RNase水溶解。
        注意：对于敲入（KI），sgRNA需要进行LiCl沉淀（见下文），但对于敲除（KO）则无需此步骤。
    4. 运行琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶：1.2% 琼脂糖溶于TAE缓冲液；TAE缓冲液[表1]; 200 V；约5分钟）取1-2 µL RNA进行电泳以评估其质量，然后使用分光光度计测定浓度。
      注意：sgRNA 可在 -20 °C 或 -80 °C 保存，以备后续使用。

3. Cas9 mRNA 的制备

  1. 根据制造商说明，使用 XbaI 对 Cas9 质粒（材料表）进行酶切消化，时间超过 1.5 小时（反应体系见 表 3）。取 1 µL 进行琼脂糖凝胶电泳检测（琼脂糖凝胶：1.2% 琼脂糖溶于 TAE 缓冲液；TAE 缓冲液 [表 1]；200 V；约 10 分钟），以确认消化完全。
  2. 以与 sgRNA PCR 产物相同的方法进行产物纯化（步骤 2.2.1–2.2.3）。自此步骤起，需使用无 RNase 的耗材并进行无 RNase 操作。
  3. 使用 T3 体外转录试剂盒（材料表）或等效试剂盒进行 Cas9 mRNA 的 in vitro 转录。
    1. 根据 表 3 在无 RNase 的 PCR 管中配制反应体系，轻轻混匀。37 °C 孵育超过 2.5 小时。
    2. 加入 1 µL 无 RNase 的 Turbo DNase，37 °C 孵育 15–20 分钟。
    3. LiCl 沉淀
      1. 将样品转移至 1.5 mL 离心管中，加入 30 µL LiCl（1.5 倍体积），轻轻混匀。
      2. 置于 -20 °C 约 30 分钟，然后在 4 °C 下以 21,000 × g 离心 30 分钟。
      3. 弃去上清液，用 500 µL 75% 乙醇（无 RNase）洗涤沉淀，在 4 °C 下以 21,000 × g 离心 5 分钟。
      4. 弃去上清液，在 45 °C 下干燥沉淀，加入 40 µL 无 RNase 水溶解。
  4. 使用分光光度计测定 Cas9 mRNA 的浓度。取 1–2 µL RNA 进行琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖凝胶：1.2% 琼脂糖溶于 TAE 缓冲液；TAE 缓冲液 [表 1]；200 V；约 10 分钟），以检测浓度和质量。
    注意：OD 260/280 比值应高于 2.0，浓度应达到或超过 1000 ng/µL。Cas9 mRNA 可储存于 -20 °C 或 -80 °C 以备后续使用。

4. 显微注射的准备工作

  1. 准备斑马鱼：显微注射前一晚，将一条健康的雌性斑马鱼和两条健康的雄性斑马鱼放入交配缸中，使用隔板将雌雄分隔开，以准备交配。
  2. 配制4%琼脂糖、裂解缓冲液和胚胎缓冲液（pH 8.0）（表1）。
  3. 准备显微注射用毛细玻璃针（材料表）。
  4. 制备显微注射用琼脂糖板：将35 mL熔化的4%琼脂糖倒入10 cm的培养皿中，轻轻放入塑料模具以形成楔形凹槽。通过轻敲模具避免产生气泡。待其凝固后，加入一些双蒸水（ddw），并将该培养皿置于4 °C保存备用。

5. 通过显微注射测试sgRNA效率

  1. 显微注射当天，在无RNase环境中将显微注射混合液置于冰上配制，具体成分见表5。
  2. 使用无RNase的移液枪头（材料表）将显微注射溶液吸入注射针中。注意避免产生气泡。
  3. 将装有溶液的注射针安装至连接显微注射仪的显微操作器上。在显微镜下用尖头镊子剪断注射针尖端，轻轻夹住针尖使其断裂。然后调节注射压力，直至针尖能稳定喷出体积为1 nL的液滴，液滴体积通过载物台测微尺和毛细管进行定量。
  4. 移除隔离板，让鱼类交配约6分钟。收集并转移单细胞期胚胎至含有胚胎缓冲液的培养皿中。
    1. 在光学显微镜下检查胚胎健康状况，去除未受精卵或碎片。另取20个健康胚胎作为未注射对照组，置于单独的培养皿中并做好标记。
  5. 使用小刷子将健康的单细胞期胚胎转移并轻轻排列在已预温至室温（RT）的显微注射板的凹槽中。去除多余的缓冲液。
  6. 所有后续操作均在体视显微镜下进行。用注射针尖轻轻调整胚胎位置，使动物极朝向注射针。向动物极注射1 nL混合溶液。
  7. 每种sgRNA注射约100个胚胎即可满足实验需求。注射完成后，用胚胎缓冲液轻轻冲洗胚胎，转移至六孔板中，并将培养皿放入28.5 °C恒温培养箱。受精后约10小时（hpf），在体视显微镜下观察胚胎发育情况，去除死亡胚胎。
  8. 在24 hpf时，将胚胎收集至1.5 mL离心管中用于基因型鉴定（每种sgRNA分3管，每管5个胚胎）。小心用移液器吸除多余液体，每管加入含蛋白酶K的裂解缓冲液100 µL（终浓度为0.5 mg/mL），56 °C孵育1小时，随后95 °C孵育15分钟。
  9. 加入200 µL乙醇（2倍体积），充分混匀，于室温下以19,000 × g离心10分钟。
  10. 弃去上清液，用500 µL 70%乙醇洗涤沉淀，于室温下以19,000 × g离心3分钟。
  11. 弃去上清液，室温下干燥沉淀，加入50 µL ddH₂O溶解。取1 µL提取物用于配制PCR反应体系（见表3）（PCR引物见步骤1.4）。
  12. 取2 µL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（凝胶：1.2%琼脂糖TAE缓冲液；TAE缓冲液[表1]；200 V；约10分钟），以确认PCR扩增成功，随后进行酶切反应（表3）以评估sgRNA的编辑效率。轻轻混匀酶切反应体系，按照试剂生产商推荐的温度和时间进行孵育。
  13. 对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳（凝胶：1.2%琼脂糖TAE缓冲液；TAE缓冲液[表1]；200 V；约10分钟），同时以未酶切的PCR产物作为对照，以确认酶切是否发生。
    注：Cas9切割位点位于PAM序列上游约3 bp处，因此限制性内切酶识别位点最好覆盖PAM上游6 bp区域。若sgRNA编辑效率高，切割后错配修复将导致插入或缺失（indels），限制性内切酶可能无法再识别切割位点；若sgRNA效率低，限制性内切酶识别位点保持完整，则可正常发生酶切。通过琼脂糖凝胶电泳可判断酶切是否发生。
  14. 若无合适的限制性内切酶识别位点，可对PCR产物进行测序，并通过TIDE工具（https://tide.nki.nl/）分析sgRNA编辑效率。 注意需同时对野生型（WT）基因组DNA进行PCR扩增和测序作为对照。
    1. 打开网站，点击Start TIDE。在Guide sequence框中输入sgRNA的引导序列。
    2. 在Control Sample Chromatogram (.ab1 or .scf)下方点击Browse，上传野生型对照样本的测序结果；在Test Sample Chromatogram (.ab1 or .scf)下方点击Browse，上传编辑样本的测序结果。
    3. 点击Update View。网站将显示两个序列之间的差异百分比，百分比越大表示sgRNA编辑效率越高。敲除效率高于80%的sgRNA适用于后续的KI实验。

6. 用于荧光蛋白标记的供体质粒构建

  1. 设计将首先克隆到质粒中，然后进一步插入鱼类基因组的序列，如图2所示：预测Cas9切割位点上游的25 bp序列设计为左同源臂，预测Cas9切割位点下游的25 bp序列作为右同源臂。将CDS引入供体质粒中sgRNA靶位点与终止密码子之间，以维持内源基因的完整性。
    注意：互补的CDS（图2中的元件4）的5'端需要进行同义突变，以避免sgRNA/Cas9复合物对重组基因组产生二次切割。
  2. 使用外切酶III（材料表）进行无缝克隆（LIC）14构建供体质粒。其他方法如Gibson组装也可行。克隆引物如图2所示。元件"1"、"2"、"3"和"4"由引物携带：
    1. 设计引物F1，其由与载体重叠的序列、元件"1"以及部分元件"2"组成。
    2. 设计引物R2，其由部分元件"1"、元件"2"以及元件"3"组成。
    3. 设计引物F2，其由元件"3"、"4"以及sgRNA靶位点后CDS的5'序列组成。
    4. 设计引物R1，其由基因CDS的3'序列以及与载体重叠的序列组成。
    5. 以斑马鱼cDNA为模板，使用上述引物进行PCR扩增。
      注意：建议引物之间或引物与载体之间的重叠区域为15–20 bp。本实验中cx39.9和cx44.1基因的引物示例见表2。该设计此前已有成功应用13。详细的质粒图谱见补充文件1和补充文件2。cx39.9和cx44.1的DNA及蛋白序列设计见补充文件3。
    6. 以与sgRNA PCR产物相同的方法纯化PCR产物（步骤2.2.1–2.2.3）。
  3. 使用适当的限制性内切酶对供体载体（图3和表6）进行酶切。本示例中使用的酶为PciI和Acc65I（材料表）。按照制造商说明书操作（表3）。以与sgRNA PCR产物相同的方法纯化酶切后的供体载体（步骤2.2.1–2.2.3）。
  4. 通过DNA凝胶电泳（DNA凝胶：1.2%琼脂糖TAE缓冲液；TAE缓冲液[表1]；200 V；约10分钟）对纯化的PCR片段和酶切供体载体进行定量。根据表3配制LIC反应体系。
    注意：所有离心管和反应组分均应置于冰上，反应及所有操作均需在冰上进行。将1 µL Exo III（20单位）作为最后一个组分加入反应体系，立即用移液器吹打混匀。请务必设置一个不含PCR片段的反应体系作为对照，以检测酶切载体自退火的可能性。
  5. 立即将反应体系置于冰上，孵育60分钟。
  6. 加入1 µL 0.5 M EDTA（pH 8.0）终止反应，吹打混匀，随后在60 °C孵育5分钟，再置于冰上5分钟。
  7. 使用LIC产物转化感受态细胞（如DH5α），并在含适当抗生素（本例中为氨苄青霉素）的LB平板（材料表和表1）上培养细菌16小时。
  8. 确保含PCR片段的平板上的菌落数量级显著高于对照平板。从LIC平板上挑取单克隆进行酶切分析和DNA测序。
  9. 使用纯化试剂盒以与sgRNA PCR产物相同的方法提取并纯化正确的供体质粒（步骤2.2.1–2.2.3）。确保最终浓度高于300 ng/µL。

7. 斑马鱼胚胎基因敲入的显微注射

  1. 执行上述所有显微注射操作，但显微注射溶液的制备需根据表7进行。

8. 筛选与鉴定荧光蛋白标记的子代

  1. 显微注射后12-48小时，在体视荧光显微镜下观察荧光。
  2. 采用新建立的筛选方法13。若观察到明显荧光，则挑选出荧光幼鱼并进行培育；若仅观察到微量荧光甚至无荧光，则将所有注射后的幼鱼均进行培育。
  3. 在1月龄时，使用0.02%三卡因对显微注射的斑马鱼进行麻醉（表1）。对每条斑马鱼，取其尾鳍一小片组织放入标记好的PCR管中，并将对应编号的麻醉后斑马鱼保留在六孔板的一个孔中，孔内含经紫外灭菌的过滤水（pH 7.2），且标签一致。
  4. 采用碱裂解法（裂解缓冲液见表1）15提取基因组DNA，随后进行5'-连接PCR。在左侧同源臂上游设计正向引物，在插入片段上设计反向引物（图4）。PCR产物大小约为500 bp。引物设计示例见表2。
    注意：对于具有荧光的斑马鱼，该PCR用于验证敲入（KI）的准确性，因此PCR产物需进行测序；对于无荧光的斑马鱼，该PCR用于验证是否发生敲入。挑选出PCR阳性个体，并将其培育至性成熟，作为F0代。
  5. 通过交配筛选获得的F0代与野生型（WT）斑马鱼，获得F1胚胎，观察其GFP表达模式，并通过连接PCR进行基因型鉴定。
    注意：若在F1代中检测到目标插入（无论是否完全准确），则将对应的F0代定义为可遗传的F0代，其PCR产物需进一步测序。若插入准确，则将该F0代定义为理想的F0代。
  6. 当获得理想的F0代后，利用其子代进行成像，以观察和追踪目标蛋白。

9. 成像与数据处理

  1. 确定需要成像的发育阶段，提前准备好斑马鱼。如有必要，向鱼液中加入稀释的1-苯基-2-硫脲（PTU；0.003%，材料表）以去除色素。
    注意：若在24小时后（hpf）再添加PTU，其效果会降低。本示例中，PTU在24 hpf前已加入胚胎缓冲液中，并持续保留在缓冲液中直至48 hpf，即斑马鱼幼鱼进行成像处理时。
  2. 将2 mL融化的4%琼脂糖（表1）加入35 mm培养皿中，静置使其凝固。将斑马鱼转移至含有0.02%三卡因（表1）的胚胎缓冲液中。
  3. 将200 µL融化的4%琼脂糖加入1 mL去离子水中稀释。当琼脂糖冷却时，用1 mL移液器将麻醉后的斑马鱼转移至稀释的琼脂糖溶液中。轻轻混匀后，将用于固定斑马鱼的稀释琼脂糖转移至步骤9.2中已制备好的、含有凝固4%琼脂糖凝胶的培养皿中。
  4. 调整斑马鱼的位置，使待观察区域朝上。
  5. 按照制造商说明，使用直立式共聚焦荧光显微镜进行成像和数据处理（材料表）。

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结果

由称为连接蛋白（connexins）的多聚蛋白组成的间隙连接，对于相邻细胞间低分子量代谢物和离子的交换至关重要。上述荧光蛋白标记方法分别用于标记connexin 39.9（图5A）和connexin 44.1（图5B）。通过连接PCR验证了正确的基因敲入（KI）（图6）。与已发表的数据一致16，在所有F1代子代的肌肉中均观察到可遗传的特异性荧光，表明connexin 39.9的GFP标记成功（图5A）。与先前报道一致17，在所有F2代子代的晶状体中检测到可遗传的特异性荧光，提示connexin 44.1的mCherry标记成功；在此情况下，F0代未观察到荧光，而在按照本实...

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讨论

为了顺利且成功地进行本实验，应更加关注一些重要方面。斑马鱼注射的最佳发育阶段应为单细胞期。在此阶段内完成注射，可确保后续分裂产生的所有细胞均含有实现定点插入（KI）所需的组分，从而提高所有细胞同时发生KI的概率，并提升KI的整体成功率。降低环境温度会减缓斑马鱼胚胎的发育速度18。然而，胚胎长时间暴露于低温环境会增加死亡率。因此，我们强调不应将胚胎直接放置在冰上或冷金属台上，也不应使其长时间处于低温环境中。相反，我们维持相对较低的环境温度（16 °C），以适度减缓胚胎发育速度，从而为注射争取充足时间，注射操作应尽可能快速完成。通常情况下，约100枚胚胎的注射可在30分钟内完成。之后，应立即将胚胎转移至28.5 °C的恒温培养箱中，以最大程度地保证其存活能力。

注射到胚胎中的液体体积应严格控制在约 1 nL。体积过低会降低敲入效率，而体积过高则会导致胚胎死亡。根据我们的观察，健康的斑马鱼胚胎能够耐受 1 nL 的注射体积，且不影响胚胎的存活和发育。因此，我们选择 1 nL 以确保较高的敲入效率和存活率。

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披露

所有作者声明本文不存在利益冲突。

致谢

我们感谢厦门大学卢周对本文稿的校对和编辑。本工作得到国家自然科学基金（项目编号 82388201，J.H.；项目编号 31801158，Y.Z.）和国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2020YFA0803500，J.H.）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程（CIFMS）（2019-I2M-5-062，J.H.）；福建省中央引导地方科技发展专项（2022L3079，J.H.）；福厦泉自主创新示范区协同创新项目（3502ZCQXT2022003，J.H.）。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决策及稿件撰写过程中均未参与。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1000 µL  吸头任意品牌N/A用于所有操作
1.5 mL 离心管任意品牌N/A用于各种溶液的储存和离心
1.5 mL 无RNase离心管任意品牌N/A用于无RNase溶液的储存和离心
10 µL 吸头任意品牌N/A用于所有操作
10 µL 无RNase吸头任意品牌N/A用于无RNase操作
1000 µL  无RNase吸头任意品牌N/A用于无RNase操作
1-苯基-2-硫脲（PTU）SigmaP7629用于抑制黑色素生成，保持幼鱼透明
200 µL 吸头任意品牌N/A用于所有操作
200 µL 无RNase吸头任意品牌N/A用于无RNase操作
2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)VazymeP213-03用于sgRNA效率检测的PCR
35-mm 培养皿Corning430165用于成像
6孔板任意品牌N/A用于斑马鱼个体饲养和临时培养
Acc65INEBR0599S用于酶切消化
乙酸Sigma695092用于TAE缓冲液配制
琼脂Biofroxx8211GR500用于LB平板
氨苄青霉素钠盐SangonA610028用于LB平板
CaCl2SigmaC5080用于胚胎缓冲液配制
毛细管Harvard Apparatus30-0016用于制备显微注射针头
毛细管任意品牌内径（ID）= 0.1 mm用于定量1-nL液滴
CRISPRscanCRISPRscan http://www.crisprscan.org/用于sgRNA设计
DH5αTIANGENCB101用于转化
EDTASigmaE6758用于裂解缓冲液和TAE缓冲液配制
EnsemblEnsembl https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index用于查找基因信息
乙醇HUSHI64-17-5用于DNA纯化和提取
外切酶IIITakara2170ALIC
气动显微注射仪Warner InstrumentsPLI-100A用于显微注射
凝胶电泳系统WIXWIX-EP3000用于凝胶电泳
手套任意品牌N/A用于所有操作
葡萄糖sgdbio10010518用于LB平板
甘油SangonA501745用于LB平板
gRNA-pMD19-T中国斑马鱼资源中心（CZRC）CZP3含sgRNA骨架的sgRNA质粒
KClSigmaP5405用于胚胎缓冲液配制
氯化锂沉淀溶液ThermofisherAM9480用于sgRNA沉淀，无RNase
低熔点琼脂糖SangonA600015用于制备4%琼脂糖凝胶
硫酸镁sgdbio20025118用于LB平板
金属浴任意品牌N/A用于恒温孵育
亚甲蓝SigmaM9140用于胚胎缓冲液配制
显微注射模具自制N/A用于在显微注射过程中固定胚胎的沟槽制作
微量加样器，用于填充Femtotips及其他玻璃毛细管，无菌，0.5 – 20 µL，100 mm，浅灰色，192个（2架 × 96个）Eppendorf5242956003用于将显微注射溶液装入注射针头，无RNase
微量移液器拉制仪Sutter InstrumentP-97用于制备注射针头
微量移液器EppendorfN/A用于所有操作
微波炉任意品牌N/A用于制备注射板和琼脂糖凝胶
MinElute PCR纯化试剂盒（50）QIAGEN28004用于纯化PCR产物和酶切产物，无RNase
mMESSAGE mMACHINE T3 转录试剂盒InvitrogenAM1348用于Cas9 mRNA的体外转录，无RNase
N2任意品牌N/A用于显微注射
NaClSigmaS5886用于胚胎缓冲液和裂解缓冲液配制
NaHCO3SigmaS5761用于胚胎缓冲液配制
NaOHSangonA100173用于TAE缓冲液配制
无核酸酶水ThermofisherR0581用于RNA相关操作，无RNase
PciINEBR0655S用于酶切消化
PCR仪任意品牌N/A用于PCR扩增
PCR条形管任意品牌N/A用于PCR
PCR管FEITONGKANGblp-200用于PCR
培养皿任意品牌N/A用于斑马鱼幼体饲养等
酚红SigmaP0290用于显微注射，无RNase
移液器支架Warner InstrumentsPLI-PH1用于显微注射
PrimeStar（预混液）TakaraDR040A用于分子克隆
蛋白酶KMerck539480用于基因组DNA提取
pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)中国斑马鱼资源中心（CZRC）CZP11Cas9质粒模板
冷冻离心机任意品牌N/A用于RNA相关离心
天平SartoriusBCE124-1CCN用于制备注射板和琼脂糖凝胶
剪刀任意品牌N/A用于剪取成年鱼尾鳍
SDSSangonA600485用于裂解缓冲液配制
小毛刷任意品牌N/A用于在显微注射板上轻柔移动胚胎
分光光度计ThermofisherNanoDrop 2000用于DNA/RNA浓度测定
台式显微尺任意品牌分度值（DIV）= 0.01 mm用于定量1-nL液滴
立体荧光显微镜OlympusSZX16用于基因表达观察
立体显微镜MoticSMZ-168用于观察和显微注射
T7 RiboMAX Express 大规模RNA生产系统PromegaP1320用于sgRNA的体外转录，无RNase
温控培养箱任意品牌N/A用于胚胎培养
TIDETIDEhttps://tide.nki.nl/用于sgRNA效率分析 
三卡因甲磺酸盐SigmaA5040用于三卡因溶液配制
TrisSangonA600194用于三卡因溶液、裂解缓冲液和TAE缓冲液配制
胰蛋白胨OXOIDLP0042用于LB平板
镊子任意品牌N/A用于切割注射针头
XbaINEBR0145S用于酶切消化
酵母提取物OXOIDLP0021用于LB平板
斑马鱼养殖系统ESENESEN-AW-S1用于成年鱼养殖
斑马鱼交配缸（带隔板）任意品牌N/A用于鱼类交配
Zeiss LSM 900+Airyscan2ZEISSZeiss LSM900用于荧光标记鱼的共聚焦成像和数据分析
ZFIN网站ZFINhttp://zfin.org/用于查找基因信息

参考文献

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