在此，我们介绍一种在斑马鱼幼鱼中用荧光蛋白标签标记蛋白质的实验方案，该方案为新近开发并经过改进的方法 体内 该系统特别适用于可视化斑马鱼中低丰度蛋白。
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摘要
摘要
CRISPR/Cas9介导的敲入（KI）技术可实现斑马鱼中更便捷的荧光蛋白标记Danio rerio），一种优选的模式生物 体内 由于其在早期发育阶段具有透明性，斑马鱼适用于活体成像。本文提供了一套详细的实验方案，用于在斑马鱼幼鱼中实现高效荧光基因敲入（KI）、快速筛选KI founder个体以及低丰度蛋白的示踪，为后续开展斑马鱼生理与病理生理学研究奠定关键基础。本方案涵盖了针对目标基因的sgRNA设计、sgRNA体外转录、Cas9 mRNA合成、显微注射条件优化、突变体筛选及阳性后代鉴定等完整步骤。 体外 转录，Cas9 mRNA 体外 转录， 体内 sgRNA筛选效率最高的个体，供体质粒的设计与构建，斑马鱼幼体的显微注射，KI founder的筛选及斑马鱼活体成像。本文包含并讨论了该方案的关键步骤、故障排除建议、质量控制方法以及优势与应用。该方案成本低、结果快速且准确，已通过多次实验验证。
引言
作为一种被广泛接受的模式生物，斑马鱼（Danio rerio在发育、再生、肿瘤发生、感染和免疫等领域的科学研究中被广泛应用1,2,3,4,5斑马鱼特别适用于 体内 使用PTU（1-苯基-2-硫脲）处理后进行活体成像，PTU是一种抑制黑色素生成的有毒化合物，可使斑马鱼幼鱼在相对较长时间内保持透明状态6. 经基因改造的透明斑马鱼品系，例如 casper7 和晶体8，也可用于实现活体可视化及谱系追踪直至成年。除了这些旨在克服成年鱼类色素干扰以改善活体成像效果的努力外，我们的研究还致力于开发高效的基因编辑策略，以提高荧光蛋白标记的效率并减少人为干预。
基于CRISPR/Cas9介导的微同源末端连接（MMEJ）的基因敲入技术由于具有相对较高的敲入效率，现已被广泛应用于包括斑马鱼在内的多种生物体的遗传修饰中9,
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方案
所有斑马鱼的饲养和实验均经过厦门大学实验动物管理与伦理委员会审查和批准，并严格遵守厦门大学实验动物中心规定的良好动物实验规范。本研究符合所有相关的动物使用伦理规定。
注意：所有成年及幼体斑马鱼均按照标准方案在厦门大学斑马鱼养殖系统中饲养，温度为 28.5 °C，光照周期为 13 小时光照/11 小时黑暗。胚胎置于胚胎缓冲液（表 1）中，在可控培养箱内培养（温度：28 ± 0.5 °C；光照：13 小时光照/11 小时黑暗周期）。所有斑马鱼的喂养和常规监测每日进行两次（上午 9 点和下午 4 点）。本研究使用的野生型（WT）品系为 Tübingen（Tü）。
1. 选择目的基因并设计向导RNA
- 了解目标基因的相关信息。在数据库（https://zfin.org/）中进行检索，并确认已知该基因的变异体数量。确定要操作的变异体，并从 Ensembl（https://www.ensembl.org/）下载目标基因的信息，包括基因组序列、cDNA 序列和编码序列（CDS）。在序列中标注外显子、内含子、UTR 区域、起始密码子和终止密码子。
- 选择目标基因终止密码子（TAA、TAG 或 TGA）上游不超过 200 bp 的 CDS 区域作为 sgRNA 靶向区域。
注意：最好通过 DNA 测序确认该区域无单核苷....
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结果
由称为连接蛋白（connexins）的聚合蛋白组成的间隙连接，对于相邻细胞之间低分子量代谢物和离子的交换至关重要。上述荧光蛋白标记方法分别用于标记connexin 39.9（图5A）和connexin 44.1（图5B）。通过连接PCR验证了正确的基因敲入（KI）（图6）。与已发表的数据一致16，在所有F1子代的肌肉中均观察到可遗传的特异性荧光，表明connexin 39.9的GFP标记成功（图5A）。与先前报道一致17，在所有F2子代的晶状体中检测到可遗传的特异性荧光，提示connexin 44.1的mCherry标记成功；在此情况下，F0代未观察到荧光，但在按照本实验.......
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讨论
为了顺利且成功地进行本实验，应更加关注一些重要方面。斑马鱼注射的最佳发育阶段应为单细胞期。在此阶段内完成注射，可确保后续分裂产生的所有细胞均含有实现定点插入（KI）所需的组分，从而提高所有细胞同时发生KI的概率，并提升KI的整体成功率。降低环境温度会减缓斑马鱼胚胎的发育速度18。然而，胚胎长时间暴露于低温环境会增加死亡率。因此，我们强调不应将胚胎直接放置在冰上或冷金属台上，也不应使其长时间处于低温环境中。相反，我们维持相对较低的环境温度（16 °C），以适度减缓胚胎发育速度，从而为注射争取充足时间，注射操作应尽可能快速完成。通常情况下，约100枚胚胎的注射可在30分钟内完成。之后，应立即将胚胎转移至28.5 °C的恒温培养箱中，以最大程度地保证其存活能力。
注射到胚胎中的液体体积应严格控制在约 1 nL。体积过低会降低敲入效率，而体积过高则会导致胚胎死亡。根据我们的观察，健康的斑马鱼胚胎能够耐受 1 nL 的注射体积，且不影响胚胎的存活和发育。因此，我们选择 1 nL 以确保较高的敲入效率和存活率。
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披露
所有作者声明本文不存在利益冲突。
致谢
我们感谢厦门大学卢周对本文稿的校对和编辑。本工作得到国家自然科学基金（项目编号 82388201，J.H.；项目编号 31801158，Y.Z.）和国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2020YFA0803500，J.H.）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程（CIFMS）（2019-I2M-5-062，J.H.）；福建省中央引导地方科技发展专项（2022L3079，J.H.）；福厦泉自主创新示范区协同创新项目（3502ZCQXT2022003，J.H.）。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决策及稿件撰写过程中均未参与。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1000 µL 吸头 | 任意品牌 | N/A | 用于所有操作 |
| 1.5 mL 离心管 | 任意品牌 | N/A | 用于各种溶液的储存和离心 |
| 1.5 mL 无RNase离心管 | 任意品牌 | N/A | 用于无RNase溶液的储存和离心 |
| 10 µL 吸头 | 任意品牌 | N/A | 用于所有操作 |
| 10 µL 无RNase吸头 | 任意品牌 | N/A | 用于无RNase操作 |
| 1000 µL 无RNase吸头 | 任意品牌 | N/A | 用于无RNase操作 |
| 1-苯基-2-硫脲（PTU） | Sigma | P7629 | 用于抑制黑色素生成，保持幼鱼透明 |
| 200 µL 吸头 | 任意品牌 | N/A | 用于所有操作 |
| 200 µL 无RNase吸头 | 任意品牌 | N/A | 用于无RNase操作 |
| 2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus) | Vazyme | P213-03 | 用于sgRNA效率检测的PCR |
| 35-mm 培养皿 | Corning | 430165 | 用于成像 |
| 6孔板 | 任意品牌 | N/A | 用于斑马鱼个体饲养和临时培养 |
| Acc65I | NEB | R0599S | 用于酶切消化 |
| 乙酸 | Sigma | 695092 | 用于TAE缓冲液配制 |
| 琼脂 | Biofroxx | 8211GR500 | 用于LB平板 |
| 氨苄青霉素钠盐 | Sangon | A610028 | 用于LB平板 |
| CaCl2 | Sigma | C5080 | 用于胚胎缓冲液配制 |
| 毛细管 | Harvard Apparatus | 30-0016 | 用于制备显微注射针头 |
| 毛细管 | 任意品牌 | 内径（ID）= 0.1 mm | 用于定量1-nL液滴 |
| CRISPRscan | CRISPRscan | http://www.crisprscan.org/ | 用于sgRNA设计 |
| DH5α | TIANGEN | CB101 | 用于转化 |
| EDTA | Sigma | E6758 | 用于裂解缓冲液和TAE缓冲液配制 |
| Ensembl | Ensembl | https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index | 用于查找基因信息 |
| 乙醇 | HUSHI | 64-17-5 | 用于DNA纯化和提取 |
| 外切酶III | Takara | 2170A | LIC |
| 气动显微注射仪 | Warner Instruments | PLI-100A | 用于显微注射 |
| 凝胶电泳系统 | WIX | WIX-EP3000 | 用于凝胶电泳 |
| 手套 | 任意品牌 | N/A | 用于所有操作 |
| 葡萄糖 | sgdbio | 10010518 | 用于LB平板 |
| 甘油 | Sangon | A501745 | 用于LB平板 |
| gRNA-pMD19-T | 中国斑马鱼资源中心（CZRC） | CZP3 | 含sgRNA骨架的sgRNA质粒 |
| KCl | Sigma | P5405 | 用于胚胎缓冲液配制 |
| 氯化锂沉淀溶液 | Thermofisher | AM9480 | 用于sgRNA沉淀，无RNase |
| 低熔点琼脂糖 | Sangon | A600015 | 用于制备4%琼脂糖凝胶 |
| 硫酸镁 | sgdbio | 20025118 | 用于LB平板 |
| 金属浴 | 任意品牌 | N/A | 用于恒温孵育 |
| 亚甲蓝 | Sigma | M9140 | 用于胚胎缓冲液配制 |
| 显微注射模具 | 自制 | N/A | 用于在显微注射过程中固定胚胎的沟槽制作 |
| 微量加样器，用于填充Femtotips及其他玻璃毛细管，无菌，0.5 – 20 µL，100 mm，浅灰色，192个（2架 × 96个） | Eppendorf | 5242956003 | 用于将显微注射溶液装入注射针头，无RNase |
| 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument | P-97 | 用于制备注射针头 |
| 微量移液器 | Eppendorf | N/A | 用于所有操作 |
| 微波炉 | 任意品牌 | N/A | 用于制备注射板和琼脂糖凝胶 |
| MinElute PCR纯化试剂盒（50） | QIAGEN | 28004 | 用于纯化PCR产物和酶切产物，无RNase |
| mMESSAGE mMACHINE T3 转录试剂盒 | Invitrogen | AM1348 | 用于Cas9 mRNA的体外转录，无RNase |
| N2 | 任意品牌 | N/A | 用于显微注射 |
| NaCl | Sigma | S5886 | 用于胚胎缓冲液和裂解缓冲液配制 |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 用于胚胎缓冲液配制 |
| NaOH | Sangon | A100173 | 用于TAE缓冲液配制 |
| 无核酸酶水 | Thermofisher | R0581 | 用于RNA相关操作，无RNase |
| PciI | NEB | R0655S | 用于酶切消化 |
| PCR仪 | 任意品牌 | N/A | 用于PCR扩增 |
| PCR条形管 | 任意品牌 | N/A | 用于PCR |
| PCR管 | FEITONGKANG | blp-200 | 用于PCR |
| 培养皿 | 任意品牌 | N/A | 用于斑马鱼幼体饲养等 |
| 酚红 | Sigma | P0290 | 用于显微注射，无RNase |
| 移液器支架 | Warner Instruments | PLI-PH1 | 用于显微注射 |
| PrimeStar（预混液） | Takara | DR040A | 用于分子克隆 |
| 蛋白酶K | Merck | 539480 | 用于基因组DNA提取 |
| pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin) | 中国斑马鱼资源中心（CZRC） | CZP11 | Cas9质粒模板 |
| 冷冻离心机 | 任意品牌 | N/A | 用于RNA相关离心 |
| 天平 | Sartorius | BCE124-1CCN | 用于制备注射板和琼脂糖凝胶 |
| 剪刀 | 任意品牌 | N/A | 用于剪取成年鱼尾鳍 |
| SDS | Sangon | A600485 | 用于裂解缓冲液配制 |
| 小毛刷 | 任意品牌 | N/A | 用于在显微注射板上轻柔移动胚胎 |
| 分光光度计 | Thermofisher | NanoDrop 2000 | 用于DNA/RNA浓度测定 |
| 台式显微尺 | 任意品牌 | 分度值（DIV）= 0.01 mm | 用于定量1-nL液滴 |
| 立体荧光显微镜 | Olympus | SZX16 | 用于基因表达观察 |
| 立体显微镜 | Motic | SMZ-168 | 用于观察和显微注射 |
| T7 RiboMAX Express 大规模RNA生产系统 | Promega | P1320 | 用于sgRNA的体外转录，无RNase |
| 温控培养箱 | 任意品牌 | N/A | 用于胚胎培养 |
| TIDE | TIDE | https://tide.nki.nl/ | 用于sgRNA效率分析 |
| 三卡因甲磺酸盐 | Sigma | A5040 | 用于三卡因溶液配制 |
| Tris | Sangon | A600194 | 用于三卡因溶液、裂解缓冲液和TAE缓冲液配制 |
| 胰蛋白胨 | OXOID | LP0042 | 用于LB平板 |
| 镊子 | 任意品牌 | N/A | 用于切割注射针头 |
| XbaI | NEB | R0145S | 用于酶切消化 |
| 酵母提取物 | OXOID | LP0021 | 用于LB平板 |
| 斑马鱼养殖系统 | ESEN | ESEN-AW-S1 | 用于成年鱼养殖 |
| 斑马鱼交配缸（带隔板） | 任意品牌 | N/A | 用于鱼类交配 |
| Zeiss LSM 900+Airyscan2 | ZEISS | Zeiss LSM900 | 用于荧光标记鱼的共聚焦成像和数据分析 |
| ZFIN网站 | ZFIN | http://zfin.org/ | 用于查找基因信息 |
参考文献
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet....
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