鲍曼不动杆菌基于荧光的 T6SS 活性检测方法的建立及比较

Summary

在这里，我们提出了一种基于荧光标记（尤其是荧光素酶）的定量检测方法，以高效准确地评估细菌 T6SS 的活性，适用于临床菌株的高通量分析。

Abstract

VI 型分泌系统 （T6SS） 是介导革兰氏阴性菌细胞间相互作用的重要机制，尤其是在鲍 曼不动杆菌 等致病菌中。既往研究表明， 鲍曼不动杆菌 ATCC 17978 菌株中的大质粒 pAB3 编码一种抑制核心 T6SS 基因表达的 TetR 样蛋白。相比之下，缺乏 pAB3 的 WT^R- 菌株可以稳定表达和分泌 T6SS 效应蛋白 Hcp，并表现出杀死 大肠杆菌的能力。 tssM 基因是 T6SS 的核心基因之一，对其活性至关重要;它的缺失直接导致 T6SS 的失活。然而，传统的 T6SS 活性检测方法（如杀伤测定）存在通量低且灵敏度不足的问题。为了解决这些限制，我们开发了基于荧光标记的定量检测方法。

为了提高 T6SS 活性检测，我们开发了三种荧光标记方法：（1） 一种基于荧光素酶标记的定量检测方法，其特点是特异性、灵敏度和重现性高，使其适用于高通量分析;（2） 一种基于绿色荧光蛋白 （GFP） 标记的检测方法，尽管容易受到环境干扰，但具有高通量的优势;（3） 流式细胞术检测，可以定量评估细菌活力，但作复杂且成本高昂。经过全面比较，基于荧光素酶的标记方法被证明是最准确、最灵敏和用户友好的。当应用于 20 种 鲍曼不动杆菌临床分离株时，该方法被证实可以快速准确地评估 T6SS 活性。

Introduction

VI 型分泌系统 （T6SS） 是革兰氏阴性菌中重要的蛋白质分泌系统，广泛参与细菌竞争、对抗真核宿主和调节宿主免疫反应 ^1,2。通过将有毒效应蛋白注射到邻近的细菌或真核细胞中，T6SS 帮助细菌在复杂环境中保持竞争优势。近年来，T6SS 在细菌适应性、致病性和微生物相互作用中的重要作用使其成为研究热点，尤其是在多重耐药病原体中，其功能为开发新的抗菌策略提供了潜在靶点 ^3,4,5。

鲍曼不动杆菌 （Ab） 是一种广泛分布于医院的革兰氏阴性机会性病原体。由于其高耐药性和强适应性，已成为世界范围内重要的院内病原体 ^6,7,8。鲍曼不动杆菌在复杂微生物环境中的生存依赖于多种分泌系统，其中 T6SS 在其与其他微生物的竞争和与宿主的相互作用中起关键作用。凭借其高度保守的 T6SS 基因簇和明确的功能，鲍曼不动杆菌已成为研究 T6SS 机制的理想模型。此外，鲍曼不动杆菌 T6SS 的独特结构为进一步揭示 T6SS 的多样性和功能提供了独特的视角。

鲍曼曲霉的 T6SS 基因簇包含 12 个核心蛋白基因（如 tssA-tssM，缺乏 tssJ）和几个功能未知的基因（如 tagX、tagN、tagF 等）。^2,9,10.其中，溶血素共调节蛋白 （Hcp） 是 T6SS 的重要组成部分，其分泌被认为是功能性 T6SS 的标志。研究表明，鲍曼曲霉中的大质粒 pAB3 通过编码 TetR 样调节蛋白来抑制 T6SS 表达。相比之下，丢失 pAB3 的菌株（如 WT^R-）可以稳定表达和分泌 Hcp，表现出显著的 T6SS 活性¹¹。tssM 基因是 T6SS 的核心基因之一，其缺失直接导致 T6SS 失活。

然而，传统的 T6SS 活性检测方法（如杀伤测定）存在通量低、重现性差、灵敏度不足等局限性，严重限制了 T6SS⁵ 的深入研究和广泛应用。因此，开发高效、准确的 T6SS 活性检测方法已成为当前研究的迫切需求。本研究旨在建立和比较基于荧光标记的 T6SS 活性检测方法，以克服传统方法的缺点。通过荧光标记技术，我们实现了 T6SS 活性的实时、定量监测，为细菌相互作用的研究提供了更精确、更可靠的工具。本研究验证了荧光标记方法的有效性，并通过比较不同荧光标记策略的优缺点，为未来的研究提供了新的视角和方法论支持。它不仅为 T6SS 研究提供了新的技术手段，而且为理解细菌相互作用的复杂机制和开发新的抗菌治疗策略奠定了科学基础。

Protocol

1. 菌株和质粒的来源

1. 使用 鲍曼不动杆菌 标准菌株 ATCC 17978、 大肠杆菌 （pZY01） 和从吉林大学第一医院检验科分离的 鲍曼不 动杆菌临床菌株。
2. 使用在实验室中修饰和保存的质粒 pZY01-GFP（携带卡那霉素抗性基因，能够在 鲍曼曲霉中稳定表达）和市售的质粒 pGEN-luxCDABE（携带氨苄青霉素抗性基因）。
3. 在 Luria-Bertani （LB） 培养基或含有以下成分的初级培养基中培养 鲍曼不动杆菌 和大 肠杆菌 ：50 mM 磷酸钾缓冲液 （pH 7.4）、15 mM （NH₄）₂SO₄、2 mM MgSO₄、0.2% （w/v） 琥珀酸钠作为唯一碳源，以及 0.01% （w/v） 酵母提取物¹²。必要时添加以下浓度的抗生素： 大肠杆菌：氨苄青霉素 （100 μg/mL） 和卡那霉素 （50 μg/mL）; 鲍曼不动杆菌：链霉素 （100 μg/mL）。
   注： 大肠 杆菌 （pZY01） 和 大肠杆菌 （pZY01-GFP） 表达卡那霉素抗性。 大肠杆菌 （pZY01） 没有荧光标记物，因此在下文中可以称为 大肠 杆菌。

2. 实验前细菌菌株的制备

1. 实验前 2 天从 -80 °C 冰箱中取出细菌菌株。将细菌菌株接种到含有相应抗生素的 LB 琼脂平板上。将板在 37 °C 下孵育过夜。
   注意：确保所有细胞在实验开始时都保留质粒。
2. 在实验前 1 天从每种细菌菌株中挑选两个独立的单菌落。将每个菌落分别接种到两个单独的试管中，其中含有 5 mL LB 液体培养基。将培养物在 37 °C 下以 200 rpm 振荡孵育过夜。将这些培养物用于后续实验。
   注意：根据细菌生长速率优化孵育时间，以确保获得足够量的细菌生物量。

3. 大肠杆菌 （GFP）/ 大肠杆菌 （荧光素酶） 菌株的制备

1. 转型
   1. 将 50 ng 质粒 DNA（pZY01-GFP 或 pGEN-luxCDABE，通过 NanoDrop 在 A260/A280 处定量）分别加入 100 μL 大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，并轻轻混合。
   2. 在冰上孵育 30 分钟，在 42 °C 下热休克 60 秒，然后立即置于冰上 30 秒。
   3. 加入 700 μL 不含抗生素的 LB 肉汤，并在 37 °C 下以 180 rpm 振荡孵育 2 小时。
2. 铺板和培养
   1. 以 420 × g 离心 2 分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 100 μL 不含抗生素的 LB 肉汤中。
   2. 将 pZY01 （GFP） 转化产物涂布到含有 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 琼脂平板上。
   3. 将 pGEN-luxCDABE 转化产物涂布在含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上。在 37 °C 孵育过夜。
3. 阳性克隆的验证
   1. 第二天挑选单个菌落并提取 DNA 作为聚合酶链反应 （PCR） 模板。进行 PCR 扩增并通过琼脂糖凝胶电泳进行验证。
   2. 确认阳性菌株并将其标记为 大肠杆菌 （GFP） 和 大肠杆菌 （荧光素酶）。
      注：确保感受态细胞的质量高，以实现高效转化。铺板过程中避免使用过多的细菌液体，以防止干扰单菌落分离。

4. 蛋白质印迹

1. 样品制备
   1. 收集细菌培养物并离心（1500 × g，10 分钟，4 °C）以分离细胞沉淀和上清液。
   2. 向细胞沉淀和上清液中加入适量的上样缓冲液。在金属浴中于 100 °C 煮沸 10 分钟。离心（1500 g，10 分钟，4 °C）并收集上清液作为蛋白质样品。
   3. 使用二辛可宁酸 （BCA） 或 Bradford 方法测量蛋白质浓度并调整至相同浓度。
2. 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）
   1. 制备适当浓度的 SDS-PAGE 凝胶（例如，12% 分离凝胶、5% 浓缩凝胶）¹³。
   2. 将 20 μg 蛋白质样品与 1-2 μL 预染蛋白质标记物一起加载到凝胶孔中。在 100-120 V 下进行电泳，直到溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。
      注：电泳缓冲液：Tris 25 mM，甘氨酸 192 mM，SDS 0.1% （w/v），蒸馏水至 1 L。
3. 转移（Western Blotting）
   1. 从玻璃板中取出凝胶并将其浸泡在转印缓冲液中。制备聚偏二氟乙烯 （PVDF） 或硝基纤维素 （NC） 膜，用甲醇活化 PVDF 膜，然后将其浸泡在转印缓冲液中。
      注：转印缓冲液：25 mM Tris、192 mM 甘氨酸、20% 甲醇
   2. 将转移装置组装成“三明治”结构（滤纸 - 凝胶 - 膜 - 滤纸）。在 100 V 下转移 60-90 分钟（根据蛋白质分子量调整时间;宿主细胞蛋白 （HCP） 的分子量约为 17 kDa）。
      注意： 将转运罐放入冰水中并添加冰袋以保持低温。如果转运时间较长，请中途更换冰袋。
4. 阻塞
   1. 转移后，将膜置于 5% 脱脂牛奶封闭溶液中。在室温 （RT） 下在摇床上封闭 1 小时或在 4 °C 下过夜。
5. 一抗孵育
   1. 用含有 0.1% Tween 20 （TBST） 缓冲液的 Tris 缓冲盐水 （TBS） 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。将膜与稀释的一抗（小鼠抗Hcp抗体，1：1000稀释;小鼠抗异柠檬酸脱氢酶（ICDH）抗体，1：1000稀释）在4°C下孵育过夜或室温2小时。
6. 二抗孵育
   1. 用 TBST 缓冲液洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。将膜与稀释的二抗（辣根过氧化物酶 [HRP] 偶联的抗小鼠 IgG，1：3000 稀释度）在 RT 下孵育 2 小时。
7. 检波
   1. 用 TBST 缓冲液洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。准备 ECL 化学发光底物并将其均匀地涂在膜上。
   2. 使用化学发光成像系统检测信号并捕获图像（HCP 蛋白的分子量约为 17 kDa，ICDH 是一种细胞质代谢酶，在 鲍曼不动杆菌中的预期分子量约为 45 kDa）。
      注：ICDH 是一种重要的质量控制标志物，只能在细胞沉淀部分（包含完整细菌）中检测到，而不能在上清部分（包含分泌蛋白）中检测到，从而证明在样品制备过程中没有发生细胞裂解。Hcp 分泌 （17 kDa） 只能在 T6SS 活性菌株的上清液中可见。

5. 用 LB 琼脂培养基制备 96 孔板

1. 将预热的高压灭菌的无抗生素 LB 琼脂培养基快速加入无菌 96 孔板中，每孔 50 μL。让板在 RT 下静置至少 1 小时，以确保培养基完全固化。
2. 使用底部透明黑色壁板检测 GFP 荧光。
3. 使用避光 96 孔板检测荧光素酶荧光，以避免交叉孔荧光干扰。
   注：添加培养基时避免产生气泡，以确保凝胶厚度均匀，从而促进细菌的最佳接触和生长。

6. 鲍曼不动杆菌 杀伤试验

1. 标准杀伤试验
   1. 在 37 °C 下在补充有 100 μg/mL 链霉素的 LB 培养基中振荡培养 WT^R 和 ΔtssM 突变菌株过夜，在相同条件下在含有 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中分别培养大 肠 杆菌。
   2. 用无菌 PBS 洗涤细菌培养物两次，然后将它们重悬于新鲜的无抗生素 LB 培养基中。将 OD₆₀₀ 调整为 1.0 以进行标准化。
   3. 将 WT^R- 和 ΔtssM 突变菌株与 大肠杆菌 以 1：1 的比例混合。
   4. 将 10 μL 混合细菌悬浮液点到不含抗生素的 LB 琼脂平板上，并在 37 °C 下孵育 6 小时。
   5. 刮除细菌斑点并将它们重悬于 1 mL PBS 中。进行 5 次 10 倍连续稀释。
   6. 将 10 μL 稀释的细菌悬浮液点样到含有卡那霉素的 LB 平板上，并在 37 °C 下孵育过夜。
   7. 通过菌落计数分析 WT^R- 和 ΔtssM 突变菌株的 T6SS 依赖性抗菌活性。
      注意：确保细菌悬浮液充分混合，以避免实验错误。每个样品至少执行 3 次独立重复，以确保数据可靠性。
2. 使用荧光素酶标记定量检测 T6SS 活性
   1. 将大肠杆菌（荧光素酶）、WT^R-、ΔtssM 突变体和其他菌株（例如，ATCC 17978、大肠杆菌、Ab#40、Ab#170、Ab#180）的 OD₆₀₀ 标准化为 1.0。将 5 μL 细菌悬浮液添加到含有不含抗生素的 LB 琼脂的 96 孔板中。在黑暗中风干后，测量基于荧光素酶的生物发光以验证大肠杆菌（荧光素酶）的发光特异性。
   2. 对 大肠杆菌 （荧光素酶）进行 5 倍连续稀释。将 10 μL 稀释的细菌悬浮液点在装有 LB 琼脂的 96 孔板和空的 96 孔板（均不透光）上。测量基于荧光素酶的生物发光，以评估基于荧光素酶的检测方法的灵敏度，并确认 LB 琼脂是否干扰发光信号。
   3. 以 1：1 的比例将 大肠杆菌 （荧光素酶）与 WT^R-、ΔtssM 突变体和 20 种临床菌株（OD₆₀₀ 标准化为 1.0）混合。稀释 10 倍，向 96 孔板中加入 5 μL，并设置三个技术重复。
   4. 在黑暗中风干后，测量生物发光。在 37 °C 下避光孵育 4-6 小时，然后再次测量生物发光（发射波长：562 nm）。
   5. 通过比较共培养前后的生物发光值，定量评估 T6SS 依赖性抗菌活性。
      注意：确保细菌悬浮液充分混合，以避免实验错误。每个样品至少执行 3 次独立重复，以确保数据可靠性。使用 Student 的 t 检验进行统计分析。
3. 使用 GFP 标记检测 T6SS 活性
   1. 遵循与荧光素酶标记实验相同的程序（激发波长：480 nm，发射波长：509 nm）。
   2. 以 1：1 的比例将 大肠杆菌 （GFP） 与 WT^R 和 ΔtssM 突变体（OD₆₀₀ 标准化为 1.0）混合。将 10 μL 点到不含抗生素的 LB 琼脂平板上。在 RT 风干后，使用多功能成像系统的 GFP 荧光通道（Alex488 程序，激发：488 nm，发射：509 nm）捕获图像。
   3. 在 37 °C 下避光孵育 4-6 小时，然后再次捕获图像。根据细菌斑点荧光强度的变化评估 T6SS 活性。
      注：在黑暗中执行所有步骤，以避免干扰荧光信号。确保细菌悬浮液充分混合，以避免实验错误。每个样品至少执行 3 次独立重复，以确保数据可靠性。
4. 流式细胞术检测
   1. 以 1：1 的比例将 WT^{R -} 与 大肠杆菌 （GFP） 混合，将 ΔtssM 突变体与 大肠杆菌 （GFP） 混合。取适量的混合细菌悬浮液，用无菌 PBS 或 1× 缓冲液稀释至合适的浓度（通常 OD₆₀₀ 为 0.1-0.5）。
      注：1×缓冲液是指流式细胞术染色缓冲液 （1×），成分包括：1× PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO_4，pH 7.4），补充：2-5% （v/v） 热灭活 FBS（或 1% BSA 作为替代品），2 mM EDTA。
   2. 将稀释的混合细菌悬浮液以 300 x g 离心 2 分钟，然后弃去上清液。将沉淀重悬于 1 mL 无菌 PBS 或 1× 缓冲液中，并轻轻混匀。通过 35 μm 细胞过滤器过滤重悬溶液，以去除聚集体并确保单细胞悬液。
   3. 打开流式细胞仪，预热激光器，并校准仪器。
      1. 设置检测参数：使用 488 nm 激光激发 GFP。检测通道：FL1（通常为 GFP 荧光检测的 530/30 nm 滤光片）。设置前向散射 （FSC） 和侧向散射 （SSC） 参数以区分细菌细胞。
      2. 使用未标记 的大肠杆菌 作为阴性对照，调整电压和增益，并确保 GFP 阴性群体处于荧光信号的基线。
   4. 轻轻混合过滤后的样品，并将 100 μL 转移至流式细胞仪管中。
      1. 使用以下仪器设置分析样品：将 FSC-H 阈值设置为 19,000 以排除碎片，增益值为 100 （FSC）、110 （SSC） 和 80 （FITC）。
      2. 对于门控，最初在 FSC-A 与 SSC-A 散点图中排除碎片和非目标信号，然后在 FITC 通道中进行群体分析。对于每个样本，从目标群体（由 FSC/SSC 特征定义）中获取至少 10,000 个事件。
   5. 使用流式细胞术软件（例如 FlowJo、BD FACSDiva）分析数据。
      1. 绘制 FSC 与 SSC 散点图以设门目标细菌种群。绘制 FL1 荧光直方图以区分 GFP 阳性和 GFP 阴性群体。
      2. 计算 GFP 阳性细胞的百分比和平均荧光强度 （MFI）。
   6. 将剩余的混合细菌悬浮液以 300 g 离心 2 分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于 10 μL 无菌水中，并将其点在不含抗生素的 LB 琼脂平板上。
   7. 在 37 °C 避光中孵育 5 小时，然后刮除细菌斑点并将它们重悬于 500 μL 的 1× PBS 中。取 100 μL 重悬溶液，适当稀释，进行流式细胞术检测，重复步骤 6.4.4-6.4.5。
   8. 比较共培养前后 GFP 阳性细胞的百分比和荧光强度。评估 WT^R- 和 ΔtssM 突变体对 大肠杆菌 （GFP） 的杀伤作用。
      注意：确保单细胞悬液，以避免细胞聚集影响检测结果。检测前校准仪器，以确保荧光信号的准确性和重现性。实验过程中避免将样品暴露在强光下，以防止 GFP 荧光猝灭。每个样品至少执行 3 次重复，以确保数据可靠性。

Results

检测 T6SS 活性的传统方法通常包括在不含抗生素的 LB 琼脂平板上共培养捕食者和靶菌株 5 小时，然后刮除细菌斑点，重新悬浮它们，并进行连续稀释。然后将稀释的细菌悬浮液点样到选择性琼脂平板上。通过第二天在平板上计数目标菌株的菌落，可以定性评估 T6SS 活性。然而，这种方法有局限性，包括程序繁琐、依赖手动菌落计数以及定量分析困难。为了解决这些缺点，本研究创新性地引入了一种基于荧光的定量检测方法。具体来说，我们用荧光蛋白（GFP 或荧光素酶）标记靶菌株（例如， 大肠杆菌），并以 1：1 的比例混合捕食者和靶菌株，然后稀释。共培养前后，测量混合细菌悬浮液的荧光值，并根据荧光值的变化定量评估 T6SS 活性，如图 1 所示。与传统方法相比，这种基于荧光的检测方法具有作简单、定量结果和高重现性等优点。

鲍曼不动杆菌 ATCC 17978 依靠 T6SS 来拮抗细菌生长
鲍曼曲霉ATCC 17978 ...

Discussion

VI 型分泌系统 （T6SS） 是一种复杂的多蛋白机制，其功能主要通过分泌效应蛋白来实现。这些效应蛋白通过杀死或抑制其他细菌种类来介导细菌间竞争，从而为宿主细菌在微生物群落中提供竞争优势¹⁵。除了在竞争中的作用外，研究表明 T6SS 还参与各种细胞过程，包括细菌定植、环境适应、生物膜形成、粘附修饰和免疫逃避¹⁶。值得注意的是，T6SS 功能的调节是多层次的，涉及转录、转录后和翻译后水平的复杂机制¹⁷。

在 T6SS 研究领域， 醋酸不动杆菌 和 鲍曼不动杆菌 因其独特的优势而成为模式菌株。首先， 鲍曼不动杆菌 的基因组已经被广泛测序和注释，为研究人员提供了丰富的遗传信息¹⁸。其次，该菌株具有高度功能性的 T6SS，Hcp 等关键成分已在结构和功能方面进行了全面表征

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10%， 15% SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒	Epizyme	PG112-20
°C 冷冻柜	海尔	HYCD-290
37 °C 培养箱	Bluepard	181254254
4 °C 冰箱	海尔	HYC390-80
°C 冷冻柜	海尔	DW-86L726G（726L）
96孔板	喷射	TCP010096
琼脂	Biofrox	8211KG001
过硫酸铵 （APS）	Thermo	7727-54-0
生物安全柜	ESCO	AC2-4S1
电子天平	赛多利斯 AG	BSA124S-CW
电泳仪	BIO-RAD	POWER
片冰机	GRANT	XB70
流式细胞仪	BECKMAN COULTER	AW38143
流式细胞仪 染色缓冲液	proteintech	PF00018
凝胶成像系统	BIO-RAD	Gel Doc 2000
甘氨酸	Zike	ZK-L2577
高速离心	Eppendorf	5405IN106358
HRP 偶联兔/小鼠二抗	proteintech	SA00001-2
LB 肉汤	Solarbio	L8291
低温高速离心机	Thermo	17R
甲醇	Thermo	R40121
微量紫外-可见分光光度计	Thermo	Nanodrop one
微量离心机	allsheng	Mini-6k
酶标仪	Bio-Tek	H1M
NuPAGE LDS 样品缓冲液	Thermo	NP0007
磷酸盐缓冲溶液 （PBS）	Zike	ZK-L1649
Precision Plus 蛋白质双色标准品	Bio-Rad	1610374
SDS 样品加载缓冲液	Beyotime	poo15L
脱脂奶粉	热	LP0033B
十二烷基硫酸钠 （SDS）	Zike	zk6885
恒温水浴	精宏	DK-420S
转移仪	Bio-Rad	PowerPac HC
Tris（羟甲基）氨基甲烷 （Tris）	Zike	ZK-L2557
垂直电泳仪	Bio-Rad	Mii-PROTEAN Tetra