一种通过颅窗对新皮层血流进行双光子成像的方法

摘要

可通过双光子显微镜成像经尾静脉注射荧光葡聚糖染料的啮齿类动物，从而在活体中研究大脑皮层的血流动力学。本视频展示了如何通过覆盖玻璃的颅窗制备方法，对小鼠新皮层的血流动力学进行成像。

摘要

对活体啮齿类动物完整大脑中的脑血管系统（从大血管到毛细血管）进行成像并记录血流动力学变化，是一项强大的技术。通过颅窗利用活体双光子显微镜，可对经静脉注射的荧光染料进行成像，从而观察大脑皮层血管结构，并获取血流动力学参数的测量数据。该技术最初由 David Kleinfeld 和 Winfried Denk 开发。此方法可用于研究脑缺血期间或之后、神经退行性疾病、脑肿瘤以及正常脑生理状态下的血流动力学变化。例如，已有研究利用该技术探讨卒中如何引起梗死区域及其周围血流方向的改变，以及红细胞速度或通量的变化。本文将演示如何通过尾静脉注射荧光染料，结合双光子显微镜对活体小鼠新皮层中的血流动力学进行成像。 关键词：脑血管系统，血流动力学，双光子显微镜，颅窗，活体成像，新皮层，小鼠，荧光染料，尾静脉注射，红细胞流速

方案

荧光葡聚糖染料的尾静脉注射

1. 为了成像脑血管系统，需通过静脉注射荧光染料。我们使用与葡聚糖偶联的染料，因为葡聚糖部分可防止染料穿过血脑屏障并从血管中渗漏。
2. 小鼠使用异氟烷进行麻醉（诱导浓度为4%，注射期间维持在1.5-2%）。
3. 用70%酒精对尾部进行消毒。
4. 使用26号针头，将75–100 µl浓度为5% v/v的罗丹明-葡聚糖生理盐水溶液注入尾静脉，注射位置位于尾杆中段。
5. 尾静脉注射后可立即开始成像，直至染料随尿液排出；若使用罗丹明染料，尿液约在2小时后变为粉红色。

使用双光子显微镜成像血流（每次实验总时长为30-60分钟，具体时间取决于成像血管的数量）

1. 注射荧光葡聚糖染料后，使用异氟烷对小鼠进行麻醉（诱导浓度为4%，成像时为1-1.5%）。
2. 通过钛条将小鼠牢固地固定在显微镜载物台上，载物台配备有温控加热垫以维持动物体温。同时涂抹眼膏以保持眼睛湿润。
3. 用70%酒精清洁颅窗的盖玻片。
4. 在4倍物镜下，将颅窗调整至与焦平面平行，并置于视野中央。
5. 最好使用数码相机拍摄脑表面血管的照片。该图像将在后续成像过程中作为参考图，以便逐日重复定位成像区域。
6. 在不移动载物台的情况下，将4倍物镜更换为水浸40倍物镜，并再次拍摄视野的数码图像。将载物台操控器的坐标设为零。
7. 我们使用ScanImage作为图像采集软件。该软件由Tom Pologruto和Bernardo Sabatini在Karel Svoboda实验室中基于MatLab编写（Pologruto等，2003年）。接下来，我们开启所有其他设备：激光器、功率计、光电倍增管、放大器等。
8. 首先在低倍镜下对颅窗中适合成像的区域进行快速扫描，以确定最佳成像区域。一旦确定目标区域，即采集该区域的低倍图像序列，并记录其XY坐标。
9. 为记录小血管或毛细血管中的血流动力学，我们沿目标血管至少40 µm的长度进行线扫描。这些持续一秒钟的单次“扫描”应尽可能使用最低的激光功率完成，同时记录扫描的坐标和角度。
10. 成像结束后，将动物转移至温暖的恢复舱中，使其从麻醉状态中苏醒。

讨论

可通过双光子显微镜成像技术，在活体动物中研究经尾静脉注射的荧光葡聚糖染料在大脑皮层的血流动力学。本视频展示了一种通过玻璃覆盖的颅窗制备方法，对小鼠新皮层血流动力学进行成像的技术。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异硫氰酸荧光素-葡聚糖	试剂	Sigma-Aldrich	FD500S	分子量 500,000
异硫氰酸罗丹明B-葡聚糖	试剂	Sigma-Aldrich	R9379	分子量 ~70,000