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研究髓系细胞与CAR T细胞之间的相互作用 体外 和 在体 内

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DOI：

10.3791/68013

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2025年7月25日

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1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 4Division of Hematology, Mayo Clinic, 5Department of Immunology, Mayo Clinic

本文内容

摘要

鉴于可用于研究人源CART细胞与髓系细胞相互作用的异种移植模型有限，我们建立了 体外 和 体内 利用模型研究人巨噬细胞对CAR-T细胞的影响。研究结果有望推广应用于评估巨噬细胞在肿瘤微环境中的作用，并测试靶向巨噬细胞的免疫疗法。

摘要

嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面已取得显著的临床成功。然而，大多数患者在1至2年内出现复发。目前已发现多种导致CART耐药的机制，包括免疫抑制性髓系细胞对T细胞的抑制作用。越来越多的证据表明，肿瘤微环境（TME）中的单核细胞和巨噬细胞会影响CART细胞的功能，导致疗效不佳和临床预后不良。但用于研究人源巨噬细胞与CART细胞相互作用的临床前模型仍十分有限。本文将探讨研究人源巨噬细胞对CART细胞影响的若干方法 体外 和 体内我们描述 体外 共培养模型以证明具有免疫抑制作用的巨噬细胞可抑制CAR-T细胞功能。此外，我们报道了一种异种移植模型，将人巨噬细胞与肿瘤细胞皮下移植至NSG小鼠，用于研究M2样巨噬细胞与CAR-T细胞及肿瘤细胞之间的相互作用。这些模型可用于评估巨噬细胞在肿瘤微环境中的作用，并测试靶向巨噬细胞的癌症免疫疗法。

引言

自体嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法在治疗复发或难治性血液系统恶性肿瘤方面已取得临床成功，由此推动美国食品药品监督管理局（FDA）批准了六种靶向CD19或B细胞成熟抗原（BCMA）的CART产品1尽管CAR-T细胞治疗在初期表现出显著疗效，但大多数患者在治疗后的前1-2年内出现复发2已发现多种CART耐药机制，包括T细胞功能欠佳、抗原逃逸、CART细胞存续能力差，以及由免疫抑制性肿瘤微环境（TME）介导的抑制作用。2,3髓系细胞（如单核细胞和巨噬细胞）通常构成肿瘤微环境（TME）的重要组成部分，并已被证实是其他免疫细胞（包括T细胞）的主要抑制因子。4,5在血液系统肿瘤和实体瘤的临床前模型及临床试验中，已有报道称髓系细胞对CAR-T细胞治疗效果具有不利影响。3,6髓系介导的抑制可能从CAR-T细胞制备过程的初始阶段即开始发生——已有研究表明，起始单采产品中的单核细胞具有抑制作用 离体 CART 扩增7,8鉴于髓系细胞介导的CAR-T抑制作用的证据不断积累，许多研究致力于对CAR-T细胞进行基因改造，以靶向并清除肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制性巨噬细胞，从而增强免疫应答5然而，CART细胞与免疫抑制性巨噬细胞之间相互作用的机制尚未完全阐明。此外，目前公开可用的此类相互作用的异种移植模型十分有限。因此，迫切需要建立用于研究人类巨噬细胞与CART细胞相互作用的模型 体外 以及在小鼠模型中。

在此，我们描述了一种将靶向人CD19的嵌合抗原受体T细胞（CART19）与CD19+ 肿瘤细胞和 离体 极化的M2样巨噬细胞。此外，我们报道了一种异种移植小鼠模型，该模型将免疫缺陷小鼠皮下植入靶细胞和人巨噬细胞，从而可在存在免疫抑制性巨噬细胞的环境中评估相关免疫疗法的效果。具体而言，我们在有或无免疫抑制性巨噬细胞的条件下，分析了CAR-T细胞针对抗原的特异性增殖情况 体外，显示在transwell和直接共培养板中T细胞扩增均受到显著抑制。在我们的异种移植模型中，将NSG小鼠皮下接种悬浮于Matrigel中的肿瘤细胞和人源巨噬细胞，用于治疗方案筛选。该动物模型成功证明了 离体 分化的免疫抑制型人巨噬细胞能够在NSG小鼠中促进肿瘤进展。通过遵循本方案，可测试靶向免疫抑制型巨噬细胞的治疗手段的有效性，包括小分子药物、生物制剂以及其他基于细胞的疗法。然而，由于使用免疫缺陷小鼠研究人类肿瘤微环境存在局限性，所提出的模型最适合用于概念验证研究。

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方案

以下方案遵循梅奥诊所机构审查委员会（IRB）、机构生物安全委员会（IBC）以及机构动物护理和使用委员会方案 A00001767 下比较医学部的指导方针。

1. 人经典单核细胞的制备 体外 研究

  1. 按照先前所述方法9从健康献血者外周血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。简言之，用含2% FBS的PBS以1:1体积比稀释全血，随后采用密度梯度介质分离PBMCs。
  2. 根据制造商说明书（材料表），通过阴性磁珠分选法从收获的PBMCs中分离人经典单核细胞（CD14+CD16-）。简言之，用分离缓冲液洗涤适量PBMCs，并根据制造商说明书将细胞重悬于指定体积缓冲液中。使用抗体混合物和磁性微珠标记非经典单核细胞，从流穿液中收集经典单核细胞，而将非单核细胞保留在柱中。
    注意：假设经典单核细胞占总PBMCs的5%，据此调整起始PBMCs细胞数量。将剩余PBMCs保存用于步骤1.7中单核细胞群体纯度的验证。经典单核细胞必须始终从未经冻存的新鲜PBMCs中分离。
  3. 使用细胞计数仪（材料表）计数分离得到的单核细胞数量，并在4 °C下以300 × g离心5分钟。用细胞分离缓冲液重悬细胞，使终浓度达到1 × 106 个细胞/mL。取100 µL细胞悬液转移至平底96孔板中。
  4. 将1 × 105 PBMCs转移至同一块板中作为阴性设门对照，用于通过流式细胞术确认经典单核细胞群体的纯度。在4 °C下以300 × g离心3分钟。在步骤1.5–1.12期间将分离的单核细胞置于冰上保存。
  5. 用200 µL FACS缓冲液重悬细胞进行洗涤，并在4 °C下以300 × g离心3分钟。小心弃去上清液。
  6. 为每个样本准备50 µL FACS缓冲液，其中包含0.3 µL活/死染料（激发波长405 nm）、0.5 µL APC标记抗人CD1410抗体（1 ng/µL）和0.5 µL PE标记抗人CD1611抗体（1 ng/µL；材料表）。
    注意：为保持染色一致性，可根据总样本数配制染色母液。向每孔加入50 µL染色液。
  7. 向每孔加入50 µL染色液，轻轻混匀细胞以避免产生气泡。在室温避光条件下孵育15分钟。
  8. 向每孔加入200 µL FACS缓冲液，并在4 °C下以300 × g离心3分钟。小心弃去上清液。
  9. 向每孔加入200 µL FACS缓冲液洗涤，并在4 °C下以300 × g离心3分钟。小心弃去上清液后，将细胞重悬于200 µL FACS缓冲液中。将样本上机进行流式细胞分析（材料表）。
  10. 设门圈选CD14+CD16-细胞群。理想纯度下，CD14+CD16-细胞群应占活细胞总数的90%以上。对活细胞单细胞群体中的CD14+CD16-细胞进行设门分析。
    注意：假设用户已熟悉流式细胞术分析操作。

2. 人经典单核细胞向M0巨噬细胞的分化

注意：人经典单核细胞向M2样巨噬细胞的分化方法改编自先前发表的研究12。

  1. 在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心分离的单核细胞 5 分钟，吸除上清液。用细胞培养基重悬细胞，调整细胞终浓度为 1 × 106 个细胞/mL。
  2. 加入人重组 GM-CSF，使其终浓度为 10 ng/mL（材料表），充分混匀。将 100 µL 细胞悬液转移至经组织培养处理的 48 孔板中，并额外加入 50 µL 细胞培养基。确保每种实验条件在第 11 天检测终点时设有 3 个重复孔。
    注意：用户可根据需要增加实验组。本方案仅包含肿瘤细胞与 T 细胞共培养的实验组，其中部分组别加入 M2 样巨噬细胞，部分不加（表 1）。
  3. 将 100 µL 细胞悬液转移至另一块 48 孔板中，并额外加入 50 µL 细胞培养基，用于巨噬细胞表型分析。确保设置一个用于 M0 巨噬细胞表型分析的孔，以及一个用于 M2 样巨噬细胞表型分析的孔。
  4. 在周围孔中加入 200 µL PBS，以防止细胞培养液蒸发。将单核细胞在 37 °C 培养 7 天，使其分化为 M0 巨噬细胞。
  5. 为研究分化后的巨噬细胞与供体匹配的 CART19 细胞之间的相互作用，从同一供体的 PBMCs 中分离 1 × 107 个 T 细胞，并按照先前描述的 8 天 CART 制备流程生成 CART19 细胞9,13,14。
    注意：共刺激信号域为 CD28 的 CART 细胞由 5 × 106 个 T 细胞制备，方法同前9,13,14。同时，按照相同流程制备未转导（UTD）T 细胞9,13,14。UTD T 细胞将作为 T 细胞增殖实验中的阴性对照，以排除同种异体增殖的影响。

3. 通过与靶细胞共培养将M0巨噬细胞诱导为M2样巨噬细胞

  1. 第7天，取出含有M0型巨噬细胞的48孔板，置于冰上孵育至少30分钟。在保持板子始终处于冰上的同时，用力反复吹打细胞。
    注意：冰上孵育的时间长短取决于巨噬细胞的贴壁程度，而贴壁性可能因供体差异而有所不同。第一次吹打旨在收集松散贴壁的巨噬细胞，因此吹打5分钟通常已足够。
  2. 将脱落的细胞转移至预先在冰上预冷的洁净15 mL锥形管（材料表）中。向48孔板的各孔中加入200 µL预冷的PBS，并每隔10分钟用力吹打残留细胞，直至大多数巨噬细胞从孔底脱落。每次吹打后，在显微镜下观察细胞状态，并根据需要调整冰上孵育时间，贴壁性更强的细胞需更长的孵育时间。
  3. 将剩余脱落的M0型巨噬细胞转移至冰上的15 mL锥形管中。轻柔混匀细胞，并使用细胞计数仪进行计数。
  4. 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。用预冷的PBS重悬细胞，调整至终浓度为1 × 106 个细胞/mL。
  5. 将200 µL细胞悬液转移至平底96孔板（材料表）中，在4 °C条件下以300 × g离心3分钟。小心倾去上清液。作为阴性设门对照，额外设置一孔仅用亲代细胞标记物染色的样本。
  6. 向每份样本中加入100 µL FACS缓冲液，并添加1 µL Fc受体阻断液。室温孵育10分钟。在4 °C条件下以300 × g离心3分钟，小心倾去上清液。
    注意：在正式进行表面标记物染色前，预先用Fc受体阻断缓冲液孵育巨噬细胞至关重要，以避免出现假阳性结果。
  7. 对于样本孔，配制50 µL FACS缓冲液，其中包含0.3 µL活/死染料（激发波长405 nm）、0.5 µL APC标记的抗人CD1410（1 ng/µL）、0.5 µL APC/Cy7标记的抗人CD20615（2 ng/µL）以及0.5 µL PerCP标记的抗人CD16316（2 ng/µL；材料表）。对于阴性设门对照孔，配制50 µL FACS缓冲液，其中包含0.3 µL活/死染料和0.5 µL APC标记的抗人CD14。
  8. 向每孔加入50 µL染色液，轻柔混匀细胞以避免产生气泡。室温避光孵育15分钟。
  9. 向每孔加入200 µL FACS缓冲液。在4 °C条件下以300 × g离心3分钟，小心倾去上清液。
  10. 用200 µL FACS缓冲液洗涤一次。在4 °C条件下以300 × g离心3分钟，小心倾去上清液，然后将细胞重悬于200 µL FACS缓冲液中。
  11. 将样本上流式细胞仪检测，设门分析CD14+CD206+CD163+细胞群体。以M0型巨噬细胞上CD163和CD206的表达水平作为M2样表型的基线。M2样巨噬细胞中，细胞群体应从CD163lowCD206low向CD163high或CD206high迁移。群体迁移的程度可能因供体而异。
  12. 准备目标肿瘤细胞系，并使用细胞计数仪进行计数。
    注意：本方案使用非贴壁性的CD19+套细胞淋巴瘤细胞系JeKo-1作为靶细胞。其他肿瘤细胞系及其诱导M0型巨噬细胞向M2样表型分化的潜力可根据需要进行测试。
    1. 使用供应商推荐的培养基（材料表）在组织培养瓶中维持JeKo-1细胞，细胞密度为1 × 106 个细胞/mL。吹打混匀培养瓶中的肿瘤细胞，并使用细胞计数仪计数。
  13. 在4 °C条件下以300 × g离心靶细胞3分钟，小心吸除上清液。用细胞培养基重悬靶细胞，调整至终浓度为2 × 106 个细胞/mL。
    注意：根据实验组数量准备相应数量的肿瘤细胞。确保每个M2样巨噬细胞共培养组（包括M2表型分析板）均含有2 × 105个靶细胞。
  14. 向第0天准备的48孔板中的M2样巨噬细胞共培养组加入100 µL肿瘤细胞，轻柔吹打混匀。37 °C继续孵育24小时。
    注意：本方案已测试JeKo-1细胞与M0型巨噬细胞以2:1的比例共培养以诱导M2样表型分化。其他比例可根据需要进行测试。
  15. 第8天，将M2表型分析板置于冰上，用力吹打使细胞脱落，并按照步骤3.4–3.11所述方法进行表型分析准备。
    注意：M2样巨噬细胞比M0型巨噬细胞贴壁性更强，因此需要更长的冰上孵育时间。本方案仅使用冰和预冷PBS来解离巨噬细胞，以最大程度减少对细胞的应激。
  16. 将第7天获得的M0表型流式数据与M2样表型数据合并。对M0型巨噬细胞样本中CD14+亲代细胞群体设门分析CD206和CD163的表达，并将相同的设门策略应用于M2样巨噬细胞样本，以观察细胞群体的迁移变化。
  17. 为引入T细胞至共培养体系，收获第8天由步骤2.5生成的CART19和UTD T细胞，转移至50 mL锥形管中。用移液器充分混匀，并使用细胞计数仪计数。
  18. 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，小心吸除上清液。用细胞培养基重悬CART或UTD T细胞，调整至终浓度为2 × 106 个细胞/mL。
  19. 准备肿瘤细胞系并在细胞计数仪上计数。在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，吸除上清液。
  20. 用细胞培养基重悬肿瘤细胞，调整至终浓度为2 × 106 个细胞/mL。向不含M2样巨噬细胞的共培养孔中加入100 µL肿瘤细胞（表1）。
  21. 向相应的共培养孔中加入100 µL CART或UTD T细胞（表1）。最终含有M2样巨噬细胞的共培养体系中，肿瘤细胞、T细胞与巨噬细胞的比例应为2:2:1。以不含巨噬细胞的共培养组作为对照。
  22. 为保持各组终体积一致，向不含巨噬细胞的孔中额外加入100 µL细胞培养基。37 °C孵育3天。
    注意：若使用异基因来源的CART细胞，用户必须在共培养体系中加入供体匹配的UTD T细胞作为适当对照，以检测任何由异基因性引起的T细胞扩增。在此情况下，应将先前冻存的CART和UTD T细胞正确复苏，并在加入共培养体系前至少静置3–4小时。

4. 共培养体系中抗原特异性增殖的分析

  1. 第11天，将共培养板置于冰上，用力吹打细胞。充分混匀细胞后，转移至1.5 mL微量离心管中。
    注意：共培养的主要检测指标是定量T细胞扩增，因此无需解离巨噬细胞，除非用户计划在同一检测面板中同时分析巨噬细胞上的其他标志物。
  2. 向样本孔中加入200 µL预冷的PBS，用力吹打。将剩余液体转移至同一微量离心管中。
  3. 在显微镜下（10倍物镜）检查各孔，确保悬浮细胞被完全收集。在4 °C条件下，以300 × g离心5分钟，吸除上清液。
  4. 用200 µL FACS缓冲液重悬所有条件下的细胞，并转移至平底96孔板中。在4 °C条件下，以300 × g离心3分钟。小心倾去上清液。
  5. 为每个样本孔配制50 µL含0.3 µL活/死染料（激发波长405 nm）和0.5 µL APC标记的抗人CD317抗体（1 ng/µL；材料表）的FACS缓冲液。向每孔加入50 µL染色液，用移液器轻轻混匀细胞，避免产生气泡。
    注意：此步骤中细胞沉淀可能较大。为确保所有T细胞均被染色，混匀后应检查孔底，确认无残留细胞沉淀。
  6. 室温避光孵育15分钟。每孔加入200 µL FACS缓冲液。在4 °C条件下，以300 × g离心3分钟。小心倾去上清液。
  7. 加入200 µL FACS缓冲液进行洗涤。在4 °C条件下，以300 × g离心3分钟。小心倾去上清液，将细胞重悬于200 µL FACS缓冲液中。
  8. 在流式细胞仪上检测样本。圈选CD3+细胞，并按以下公式计算活CD3+细胞的绝对数量：
    CD3 T细胞计数公式；流式细胞术分析中计算绝对数量的方程。
  9. 使用GraphPad Prism软件绘制各条件下CD3+细胞的绝对数量图。
    注意：与不含M2样巨噬细胞的条件相比，含有M2样巨噬细胞的共培养体系中CD3 T细胞的绝对数量预期显著降低。

5. 转孔系统中M2样巨噬细胞对CART细胞的影响

注意：Transwell 培养板在物理上将 M2 样巨噬细胞与活化的 CART 细胞分隔开，仅允许可溶性分子在两类细胞之间传递，从而使研究人员能够研究巨噬细胞与 CART 细胞之间非接触依赖性相互作用的动态过程（图 1）。

  1. 分离 1 × 106 人经典单核细胞，并通过流式细胞术检测群体纯度，具体步骤如1.1–1.10所述。离心收集1 × 106 300 x 的单核细胞 g 4 °C 下离心 5 分钟，吸除上清液。
    注意：用户可能希望按照步骤 2.5 中所述生成自体 CART 细胞和供体匹配的 UTD 细胞。
  2. 用细胞培养基重悬细胞，使其终浓度为 1 x 106 细胞/mL。加入人重组GM-CSF，使其终浓度为10 ng/mL，并充分混匀。
  3. 将200 µL重悬细胞转移至24孔Transwell板（0.4 µm）的下室，设置3个技术重复。每孔额外加入100 µL细胞培养基，确保孔底完全覆盖。另取3个孔，每孔加入300 µL细胞培养基，作为无巨噬细胞条件（阳性对照）。
  4. 在周围孔中加入 200 µL PBS，以防止细胞培养液蒸发。将细胞在 37 °C 下孵育 7 天。
  5. 第7天，准备1.4 x 106 JeKo-1 肿瘤细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中。以 300 x g 4 °C 下离心 5 分钟，吸除上清液。
  6. 用细胞培养基重悬肿瘤细胞，使其达到终浓度为 2 x 106 细胞/mL。将200 µL肿瘤细胞加入所有样本条件的下层孔中，充分混匀。于37 °C继续孵育24 h。仅含JeKo-1的下层孔作为阳性对照。
  7. 第8天，收获第5.1步中生成的第8天CART和UTD T细胞，并将T细胞重悬于细胞培养基中，调整终浓度为1 × 106 cells/mL
    注意：如果使用异基因CAR-T细胞，用户必须在共培养中加入供体匹配的未转导T细胞，具体操作如步骤3.22所述。
  8. 计数并准备 1.4 x 106 JeKo-1 细胞。将肿瘤细胞转移至 15 mL 离心管中，以 300 x g 4 °C 下孵育 5 分钟。
  9. 吸弃上清液，用细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1 x 106 细胞/mL。将100 µL制备好的T细胞和100 µL肿瘤细胞加入每个上室孔中，涵盖所有样本条件。
  10. 将细胞充分混匀于上室中，37 °C 培养 3 天。
  11. 第11天，混匀上层小室中的细胞，转移至1.5 mL微量离心管中。用200 µL PBS洗涤上层小室，将残留细胞转移至同一微量离心管中。
  12. 300 x g 离心细胞 g 4 °C 下离心 5 分钟，吸除上清液。按照步骤 4.4–4.9 所述进行 T 细胞增殖实验。
    注意：JeKo-1 极化的 M2 样巨噬细胞能够以非接触依赖的方式抑制抗原特异性 T 细胞的增殖。可根据需要测试其他肿瘤模型。

6. 在NSG小鼠中建立包含人源巨噬细胞和肿瘤的异种移植模型

  1. 分离 1 × 107 人经典单核细胞，并通过流式细胞术确认其纯度，具体步骤见1.1–1.10。以仅移植JeKo-1的NSG小鼠作为对照，以验证M2样巨噬细胞的促肿瘤作用，如图所示。 图2.
    注意：本方案将5 x 10⁶个细胞移植至NSG小鼠体内5 人源巨噬细胞皮下植入。第7天消化脱离后，巨噬细胞回收率约为50%。使用者可据此调整细胞数量，并确保准备额外的细胞。
  2. 将分离的单核细胞在300 x g下离心 g 4 °C 下离心 5 分钟，吸除上清液。用细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度至 1 × 106 cells/mL
  3. 加入人重组GM-CSF，使其终浓度为10 ng/mL，并充分混匀。将单核细胞转移至T25组织培养瓶中，在37 °C条件下培养7天。
  4. 第7天，在冰上每10分钟剧烈吹打细胞一次，并在显微镜下观察细胞，直至大多数巨噬细胞脱落。将细胞转移至预冷的15 mL离心管中，用预冷的PBS洗涤培养瓶以松动残留细胞，并将洗下的细胞合并至同一离心管中。
  5. 使用细胞计数仪对细胞进行计数。以 300 x g 离心细胞 g 4 °C 下离心 5 分钟，吸除上清液。
  6. 用 5 mL 冰冷的 PBS 洗涤并重悬细胞。在 300 x g 4 °C 下离心 5 分钟，吸除上清液。
  7. 将细胞重悬于预冷的 PBS 中，调整细胞浓度至 2 x 10⁶ 个/mL7 细胞/mL。将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中，置于冰上保存。
  8. 制备 1.5 × 107 荧光素酶+ JeKo-1 细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
    注意：由于注射的细胞数量较少，必须使用生物发光成像（BLI）来监测肿瘤负荷。皮下注射所用的巨噬细胞和肿瘤细胞数量可根据需要按比例增加。若注射后肿瘤可通过游标卡尺观察并触及，则可改用野生型肿瘤细胞。
  9. 300 x g 离心细胞 g 4°C 下离心 5 分钟，吸除上清液。用预冷的 PBS 重悬细胞，调整细胞浓度至 4 × 10⁶7/mL
  10. 将相同体积的巨噬细胞和肿瘤细胞转移至另一新的1.5 mL微量离心管中，充分混匀。向混合细胞悬液中加入等体积的溶解基底膜基质，冰上充分混匀。
    注意：基底膜基质需在冰上过夜解冻，以防止凝固。此时，每100 µL细胞溶液含有5 x 105 巨噬细胞和 1 x 106 JeKo-1 悬浮于基底膜基质中，所用细胞数量比例与之前相同 体外 M2样巨噬细胞分化方案
  11. 作为对照，将剩余的制备好的JeKo-1细胞用相同体积的预冷PBS转移至新的1.5 mL离心管中，加入与细胞悬液等体积的基底膜基质，冰上充分混匀。
  12. 准备10只6-8周龄的雌性和雄性NOD-SCID-γ-/-（NSG）小鼠（约20 g），使用2.5%异氟烷进行吸入麻醉。通过啮齿类动物吸入麻醉装置引入异氟烷麻醉，将气化的异氟烷输送至麻醉室以及带有鼻罩的加热平台。
  13. 将小鼠放入麻醉室中麻醉1-2分钟。当小鼠失去姿势和翻正反射后，将其转移至加热载物台上的鼻罩中18在整个操作过程中将小鼠置于加热台上。为小鼠双眼涂抹眼膏，以防止麻醉期间因眨眼反射消失导致角膜损伤。
  14. 小心剃除每只小鼠右侧 flank 部的毛发，以暴露皮肤，操作前需确保小鼠已麻醉。用 0.5 mL 注射器吸取 100 µL JeKo-1-巨噬细胞混合液，并仔细去除溶液中的气泡。
  15. 用手小心提起暴露的皮肤，将针头插入提起的区域。用针头持续提起皮肤，并用一根手指按压注射部位。针头插入后尽量避免移动，以防止意外穿刺和细胞泄漏。
  16. 缓慢将细胞注入皮下层，小心拔出针头。对全部10只NSG小鼠进行皮下注射，其中5只小鼠同时接受JeKo-1细胞和巨噬细胞，另外5只小鼠仅接受JeKo-1细胞。
  17. 制备 D-荧光素材料表) 配制成 15 mg/mL 的浓度。用 0.5 mL 注射器吸取 200 µL D-荧光素钠，每只小鼠腹腔注射。
  18. 将麻醉后的小鼠置于成像台上，在注射D-荧光素钠10分钟后进行生物发光成像（BLI），对每只小鼠进行成像并记录作为基线（第0天）肿瘤负荷。随后将小鼠放回笼中。
    注意：在成像操作后，必须确保麻醉的小鼠在恢复意识并能够维持胸卧位之前，始终有人看护，不得无人看管。
  19. 每周通过生物发光成像（BLI）监测肿瘤负荷两次，直至达到实验终点或人道终点。当肿瘤体积达到或超过 2000 mm³ 时，视为达到总体生存终点。3，由以下公式计算得出：
    Tumor volume calculation, formula: Width*Length*Height/2; mathematical expression.
    注意：肿瘤监测的时长可根据实验目的和所需的检测指标进行调整。由于肿瘤在最初2-3周内体积极小，建议使用生物发光成像（BLI）来评估肿瘤负荷。当肿瘤生长至可用游标卡尺测量并肉眼可见时，建议同时采用BLI和游标卡尺测量，以实现更准确的肿瘤分析。
  20. 为研究嵌合抗原受体T细胞（CART19）与自体人源巨噬细胞在NSG小鼠体内的相互作用，制备并移植人源巨噬细胞 离体-按照步骤6.1-6.16所述方法获得已分化的人巨噬细胞。在步骤6.1中，按照此前所述的8天CAR-T细胞制备方案，从同一血液供体分离自体T细胞9,13,14.
    注意：每只NSG小鼠接受2 x 106 CART19细胞。用户应至少生成2 x 107 用于治疗10只小鼠的CART细胞。CART细胞在第8天进行冷冻保存，待皮下注射5天后JeKo-1/巨噬细胞在小鼠体内成功植入后再行使用。
  21. 在肿瘤细胞/巨噬细胞注射后第5天，根据步骤6.17–6.18所述方法，基于生物发光成像（BLI）对小鼠进行随机分组。按照步骤3.22所述方法解冻并制备CAR-T细胞。用PBS洗涤CAR-T细胞，并在300 × g条件下离心沉淀细胞 g 4 °C 下孵育 5 分钟。
  22. 将CART细胞重悬于PBS中，使其最终浓度达到2 x 107 细胞/mL。用0.5 mL注射器吸取100 µL制备好的CART细胞，通过尾静脉静脉注射至每只荷瘤小鼠体内。
  23. 每周通过生物发光成像（BLI）监测一次肿瘤负荷，持续4周。
    注意：由于移植的人源巨噬细胞具有免疫抑制功能，预计在注射 JeKo-1/巨噬细胞的小鼠中，CAR-T 细胞的抗肿瘤活性会减弱，且肿瘤负荷更高。

通过免疫荧光染色确认移植的人巨噬细胞的M2样表型

  1. 为了通过免疫荧光染色确认第6步中所述的由JeKo-1诱导的移植人巨噬细胞M2样表型，请遵循步骤6.1–6.19，并将注射的巨噬细胞和荧光素酶+ JeKo-1细胞数量分别扩大至每只NSG小鼠5 × 106 个细胞和1 × 107 个细胞。
    注意：操作者应确保每只小鼠的最终注射体积为100 µL。
  2. 第7天，通过CO2（将流速计设定为3.5 L/min，持续5分钟，或直至动物死亡）对NSG小鼠实施安乐死，进行颈椎脱位，并如前所述确认角膜反射消失19。将小鼠置于工作台面，肿瘤面朝上。在肿瘤部位喷洒70%乙醇，使用剪刀和镊子小心剥离移植的肿瘤组织。
  3. 将肿瘤组织转移至装有20–30 mL 4%多聚甲醛的50 mL锥形管中，按先前所述方法进行固定20。根据已发表的方案20，对肿瘤组织进行冷冻保存并制备冷冻切片，用于免疫荧光染色。
  4. 使用与AF546偶联的小鼠抗人CD206抗体（1:50）和与AF647偶联的兔抗人iNOS抗体（1:100），在免疫荧光染色缓冲液中稀释后对肿瘤组织切片进行染色，随后进行细胞核染色和封片，操作如前所述21。
    注意：为获得最佳染色效果，操作者应根据实际情况进行抗体滴定，尤其是在使用不同肿瘤细胞系时。
  5. 使用共聚焦显微镜在40倍物镜下采集免疫荧光图像。为确认移植的人巨噬细胞是否形成M2样表型，应观察到人CD206的表达以及人iNOS的极少表达。

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结果

本实验方案的目的是建立两种方法 体外 和 体内 研究人类免疫抑制性巨噬细胞与CAR-T细胞相互作用的模型较为有限，这主要是由于两者相互作用的复杂性和动态性，以及现有异种移植模型的不足。根据本方案，分离的人类经典单核细胞将被诱导分化为具有M2样表型并具备免疫抑制功能的巨噬细胞。

为确认分离的人经典单核细胞的纯度，将染色后的样本在流式细胞仪上检测，并通过圈选人CD14阳性细胞进行分析+CD16- 种群（图 3A- B) 成功的单核细胞分离将获得至少90%的CD14+CD16- 从活细胞亲代群体中分离出目标细胞群体。为进行表型鉴定并确认已分化为M2样巨噬细胞，需观察CD163的群体偏移情况低 CD206低 CD163高 或 CD206高 与M2样巨噬细胞相比，M0巨噬细胞的预期表现（

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讨论

CAR-T细胞疗法在治疗部分血液系统恶性肿瘤患者中已显示出多项临床成功，但大多数患者在CAR-T输注后1-2年内出现复发1,2。目前已发现多种潜在的CAR-T耐药机制，其中免疫抑制性髓系细胞在肿瘤微环境（TME）的免疫抑制及后续CAR-T治疗失败中发挥重要作用3,4,5,6,7,8。已有研究对CAR-T细胞进行工程化改造以靶向免疫抑制性巨噬细胞，从而提高整体抗肿瘤疗效5。然而，巨噬细胞介导的CAR-T抑制机制尚未完全阐明。此外，由于在小鼠模型中移植人源巨噬细胞的技术复杂性，目前可用于...

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披露

SSK 是 CAR 免疫治疗领域多项专利的发明人，这些专利已授权给诺华（通过梅奥诊所、宾夕法尼亚大学与诺华之间的协议）、MustangBio（通过梅奥诊所）和 Sendero（通过梅奥诊所）。RLS 和 SSK 是 CAR 免疫治疗领域多项专利的发明人，这些专利已通过梅奥诊所授权给 Humanigen。KY、RLS、TH、BK、ES 和 SSK 是 CAR 免疫治疗领域多项专利的发明人，这些专利已通过梅奥诊所授权给 Immix。SSK 收到来自 Kite、Gilead、Juno、BMS、诺华、Humanigen、MorphoSys、Tolero、Sunesis/Viracta、LifEngine Animal Health Laboratories Inc.、Incyte 和 Lentigen 的研究资助。SSK 参与了 Kite/Gilead、Humanigen、Juno/BMS、Capstan Bio 和诺华的顾问会议。SSK 曾在 Humanigen 和 Carisma 的数据安全与监查委员会任职。SSK 曾担任 Torque、Calibr、诺华、Capstan Bio、Carisma 和 Humanigen 的顾问。

致谢

本研究部分由梅奥诊所综合癌症中心（SSK）、梅奥诊所个体化医学中心（SSK）、梅奥诊所再生生物治疗中心（SSK）、美国国立卫生研究院资助项目R37CA266344-01（SSK）以及美国国防部资助项目CA201127（SSK）提供资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5 mL 注射器Fisher Scientific329461
1.5 mL 微量离心管Eppendorf1415-2508 
15 mL 锥形管Corning Life Sciences352097
24孔Transwell小室（0.4 μm）Corning Life Sciences3397
50 mL 锥形管Corning Life Sciences352098
APC/Cy7标记的抗人CD206抗体Biolegend321119流式抗体
APC标记的抗人CD14抗体Biolegend325607流式抗体
APC标记的抗人CD3抗体Biolegend344811流式抗体
autoMACS冲洗液Miltenyi Biotec130-091-222经典单核细胞分离缓冲液 
基底膜基质Corning Life SciencesCLS356237溶解态基底膜基质
细胞培养基X-VIVO 15无血清造血细胞培养基中含10%人AB血清和1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺
人经典单核细胞分离试剂盒Miltenyi Biotec130-117-337
CytoFLEX系统  B5-R3-V5Beckman CoulterC04652流式细胞仪
D-荧光素Gold BiotechnologyLUCK-1G
D-PBS（杜氏磷酸盐缓冲液）Gibco14190250 
眼膏ThermoFisher19-090-832
FACS缓冲液PBS中含2%胎牛血清和1%叠氮化钠
胎牛血清Corning Life Sciences35-011-CV
平底96孔板Corning Life SciencesCLS3997
热灭活混合人AB血清 Innovative Research4931
人TruStain FcX（Fc受体阻断液）Biolegend422301
异氟烷液体  Piramal Pharma Limited66794-017-10
IVIS Spectrum活体成像系统PerkinElmer124262
JeKo-1细胞系培养基RPMI-1640培养基中含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺
活/死可固定Aqua死细胞染色试剂盒（适用于405 nm激发）InvitrogenL34966
LS柱Miltenyi Biotec130-042-401阴性磁珠分选
LymphoprepStemcell Technologies07811密度梯度介质
MACS BSA储存液Miltenyi Biotec130-091-376经典单核细胞分离缓冲液 
AF546标记的小鼠抗人CD206抗体 Santa Cruz Biotechnologysc-376232
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 小鼠Jackson Laboratory 5557
PE标记的抗人CD16抗体Biolegend302007流式抗体
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100倍浓度），液体Gibco10378-016
PerCP标记的抗人CD163抗体Biolegend333625流式抗体
AF647标记的兔抗人iNOS抗体 ProteintechCL647-18985
重组人GM-CSFStemcell Technologies78015
RPMI-1640培养基Gibco11875093
SepMate-50 IVDStemcell Technologies85450通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 
叠氮化钠，5%（w/v）Ricca Chemical7144.8-16
组织培养处理的48孔板Corning Life Sciences3548
Vi-cell XR细胞活力分析仪Beckman Coulter细胞计数仪
X-VIVO 15无血清造血细胞培养基Lonza04-418Q

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