鉴于可用于研究人源CART细胞与髓系细胞相互作用的异种移植模型有限，我们建立了 体外 和 体内 利用模型研究人巨噬细胞对CAR-T细胞的影响。研究结果有望推广应用于评估巨噬细胞在肿瘤微环境中的作用，并测试靶向巨噬细胞的免疫疗法。
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摘要
摘要
嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面已取得显著的临床成功。然而，大多数患者在1至2年内出现复发。目前已发现多种导致CART耐药的机制，包括免疫抑制性髓系细胞对T细胞的抑制作用。越来越多的证据表明，肿瘤微环境（TME）中的单核细胞和巨噬细胞会影响CART细胞的功能，导致疗效不佳和临床预后不良。但用于研究人源巨噬细胞与CART细胞相互作用的临床前模型仍十分有限。本文将探讨研究人源巨噬细胞对CART细胞影响的若干方法 体外 和 体内我们描述 体外 共培养模型以证明具有免疫抑制作用的巨噬细胞可抑制CAR-T细胞功能。此外，我们报道了一种异种移植模型，将人巨噬细胞与肿瘤细胞皮下移植至NSG小鼠，用于研究M2样巨噬细胞与CAR-T细胞及肿瘤细胞之间的相互作用。这些模型可用于评估巨噬细胞在肿瘤微环境中的作用，并测试靶向巨噬细胞的癌症免疫疗法。
引言
自体嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法在治疗复发或难治性血液系统恶性肿瘤方面已取得临床成功，由此推动美国食品药品监督管理局（FDA）批准了六种靶向CD19或B细胞成熟抗原（BCMA）的CART产品1尽管CAR-T细胞治疗在初期表现出显著疗效，但大多数患者在治疗后的前1-2年内出现复发2已发现多种CART耐药机制，包括T细胞功能欠佳、抗原逃逸、CART细胞存续能力差，以及由免疫抑制性肿瘤微环境（TME）介导的抑制作用。2,3髓系细胞（如单核细胞和巨噬细胞）通常构成肿瘤微环境（TME）的重要组成部分，并已被证实是其他免疫细胞（包括T细胞）的主要抑制因子。4,5在血液系统肿瘤和实体瘤的临床前模型及临床试验中，已有报道称髓系细胞对CAR-T细胞治疗效果具有不利影响。3,6髓系介导的抑制可能从CAR-T细胞制备过程的初始阶段即开始发生——已有研究表明，起始单采产品中的单核细胞具有抑制作用 离体 CART 扩增7,....
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方案
以下方案遵循梅奥诊所机构审查委员会（IRB）、机构生物安全委员会（IBC）以及机构动物护理和使用委员会方案 A00001767 下比较医学部的指导方针。
1. 人经典单核细胞的制备 体外 研究
- 按照先前所述方法9从健康献血者外周血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。简言之，用含2% FBS的PBS以1:1体积比稀释全血，随后采用密度梯度介质分离PBMCs。
- 根据制造商说明书（材料表），通过阴性磁珠分选法从收获的PBMCs中分离人经典单核细胞（CD14+CD16-）。简言之，用分离缓冲液洗涤适量PBMCs，并根据制造商说明书将细胞重悬于指定体积缓冲液中。使用抗体混合物和磁性微珠标记非经典单核细胞，从流穿液中收集经典单核细胞，而将非单核细胞保留在柱中。
注意：假设经典单核细胞占总PBMCs的5%，据此调整起始PBMCs细胞数量。将剩余PBMCs保存用于步骤1.7中单核细胞群体纯度的验证。经典单核细胞必须始终从未经冻存的新鲜PBMCs中分离。 - 使用细胞计数仪（材料表）计数分离得到的单核细胞数量，并在4 °C下以300 × g离心5分钟。用细胞分离缓冲液重悬细胞，使终浓度达到1 × ....
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结果
本实验方案的目的是建立两种方法 体外 和 体内 研究人类免疫抑制性巨噬细胞与CAR-T细胞相互作用的模型较为有限，这主要是由于两者相互作用的复杂性和动态性，以及现有异种移植模型的不足。根据本方案，分离的人类经典单核细胞将被诱导分化为具有M2样表型并具备免疫抑制功能的巨噬细胞。
为确认分离的人经典单核细胞的纯度，将染色后的样本在流式细胞仪上检测，并通过圈选人CD14阳性细胞进行分析+CD16- 种群（图 3A- B) 成功的单核细胞分离将获得至少90%的CD14+CD16- 从活细胞亲代群体中分离出目标细胞群体。为进行表型鉴定并确认已分化为M2样巨噬细胞，需观察CD163的群体偏移情况低 CD206低 CD163高 或 CD206高 与M2样巨噬细胞相比，M0巨噬细胞的预期表现（
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讨论
CAR-T细胞疗法在治疗部分血液系统恶性肿瘤患者中已显示出多项临床成功，但大多数患者在CAR-T输注后1-2年内出现复发1,2。目前已发现多种潜在的CAR-T耐药机制，其中免疫抑制性髓系细胞在肿瘤微环境（TME）的免疫抑制及后续CAR-T治疗失败中发挥重要作用3,4,5,6,7,8。已有研究对CAR-T细胞进行工程化改造以靶向免疫抑制性巨噬细胞，从而提高整体抗肿瘤疗效5。然而，巨噬细胞介导的CAR-T抑制机制尚未完全阐明。此外，由于在小鼠模型中移植人源巨噬细胞的技术复杂性，目前可用于.......
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披露
SSK 是 CAR 免疫治疗领域多项专利的发明人，这些专利已授权给诺华（通过梅奥诊所、宾夕法尼亚大学与诺华之间的协议）、MustangBio（通过梅奥诊所）和 Sendero（通过梅奥诊所）。RLS 和 SSK 是 CAR 免疫治疗领域多项专利的发明人，这些专利已通过梅奥诊所授权给 Humanigen。KY、RLS、TH、BK、ES 和 SSK 是 CAR 免疫治疗领域多项专利的发明人，这些专利已通过梅奥诊所授权给 Immix。SSK 收到来自 Kite、Gilead、Juno、BMS、诺华、Humanigen、MorphoSys、Tolero、Sunesis/Viracta、LifEngine Animal Health Laboratories Inc.、Incyte 和 Lentigen 的研究资助。SSK 参与了 Kite/Gilead、Humanigen、Juno/BMS、Capstan Bio 和诺华的顾问会议。SSK 曾在 Humanigen 和 Carisma 的数据安全与监查委员会任职。SSK 曾担任 Torque、Calibr、诺华、Capstan Bio、Carisma 和 Humanigen 的顾问。
致谢
本研究部分由梅奥诊所综合癌症中心（SSK）、梅奥诊所个体化医学中心（SSK）、梅奥诊所再生生物治疗中心（SSK）、美国国立卫生研究院资助项目R37CA266344-01（SSK）以及美国国防部资助项目CA201127（SSK）提供资金支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mL 注射器 | Fisher Scientific | 329461 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Eppendorf | 1415-2508 | |
| 15 mL 锥形管 | Corning Life Sciences | 352097 | |
| 24孔Transwell小室（0.4 μm） | Corning Life Sciences | 3397 | |
| 50 mL 锥形管 | Corning Life Sciences | 352098 | |
| APC/Cy7标记的抗人CD206抗体 | Biolegend | 321119 | 流式抗体 |
| APC标记的抗人CD14抗体 | Biolegend | 325607 | 流式抗体 |
| APC标记的抗人CD3抗体 | Biolegend | 344811 | 流式抗体 |
| autoMACS冲洗液 | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | 经典单核细胞分离缓冲液 |
| 基底膜基质 | Corning Life Sciences | CLS356237 | 溶解态基底膜基质 |
| 细胞培养基 | X-VIVO 15无血清造血细胞培养基中含10%人AB血清和1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺 | ||
| 人经典单核细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-117-337 | |
| CytoFLEX系统 B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | 流式细胞仪 |
| D-荧光素 | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| D-PBS（杜氏磷酸盐缓冲液） | Gibco | 14190250 | |
| 眼膏 | ThermoFisher | 19-090-832 | |
| FACS缓冲液 | PBS中含2%胎牛血清和1%叠氮化钠 | ||
| 胎牛血清 | Corning Life Sciences | 35-011-CV | |
| 平底96孔板 | Corning Life Sciences | CLS3997 | |
| 热灭活混合人AB血清 | Innovative Research | 4931 | |
| 人TruStain FcX（Fc受体阻断液） | Biolegend | 422301 | |
| 异氟烷液体 | Piramal Pharma Limited | 66794-017-10 | |
| IVIS Spectrum活体成像系统 | PerkinElmer | 124262 | |
| JeKo-1细胞系培养基 | RPMI-1640培养基中含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺 | ||
| 活/死可固定Aqua死细胞染色试剂盒（适用于405 nm激发） | Invitrogen | L34966 | |
| LS柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 阴性磁珠分选 |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07811 | 密度梯度介质 |
| MACS BSA储存液 | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | 经典单核细胞分离缓冲液 |
| AF546标记的小鼠抗人CD206抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376232 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 小鼠 | Jackson Laboratory | 5557 | |
| PE标记的抗人CD16抗体 | Biolegend | 302007 | 流式抗体 |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100倍浓度），液体 | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP标记的抗人CD163抗体 | Biolegend | 333625 | 流式抗体 |
| AF647标记的兔抗人iNOS抗体 | Proteintech | CL647-18985 | |
| 重组人GM-CSF | Stemcell Technologies | 78015 | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875093 | |
| SepMate-50 IVD | Stemcell Technologies | 85450 | 通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 |
| 叠氮化钠，5%（w/v） | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| 组织培养处理的48孔板 | Corning Life Sciences | 3548 | |
| Vi-cell XR细胞活力分析仪 | Beckman Coulter | 细胞计数仪 | |
| X-VIVO 15无血清造血细胞培养基 | Lonza | 04-418Q |
参考文献
- Yun, K., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Who wins the combat, CAR or TCR. Leukemia. 37 (10), 1953-1962 (2023).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. New England J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017). ....
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