胶原蛋白来源的晚期糖基化终末产物（AGEs）增加与疼痛性疾病始终存在关联。在此，我们研究了糖基化是否会使感觉神经元对辣椒素兴奋更为敏感。
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方法文章
晚期糖基化终末产物使类人感觉神经元细胞对辣椒素诱导的钙内流更加敏感
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
胶原蛋白来源的晚期糖基化终末产物（AGEs）增加与多种疼痛相关疾病持续相关，包括骨关节炎、糖尿病性神经病变和神经退行性疾病。由SH-SY5Y细胞系分化而来的人类类感觉神经元在暴露于AGEs时，会通过释放P物质并上调瞬时受体电位香草素1（TRPV1）的表达而获得促伤害性功能。本研究旨在探讨该受体是否具有功能活性，以及糖基化过程是否使感觉神经元对辣椒素刺激更为敏感。类感觉神经元细胞通过全反式维甲酸和脑源性神经营养因子诱导SH-SY5Y细胞分化获得。使用糖化胶原细胞外基质（ECM-GC）孵育以模拟促伤害性刺激，对照组细胞则孵育于非糖化胶原细胞外基质（ECM-NC）中。采用Fluo-8钙流检测试剂盒评估由辣椒素刺激引发的钙离子内流。结果显示，与正常胶原处理的细胞相比，糖化处理显著增加了钙离子内流量，表明类感觉神经元表达了具有功能活性的TRPV1通道，且糖基化增强了细胞对辣椒素的兴奋性。这些数据表明，AGEs可使类感觉神经元 细胞产生高敏感性，从而触发促伤害性信号通路。综上所述，本研究建立了一个对辣椒素具有功能性响应的细胞模型，可用于筛选治疗疼痛性疾病的潜在候选药物。
引言
糖基化是一种非酶促、不可逆且自发的过程，其中蛋白质（如胶原蛋白）与还原糖分子结合，形成晚期糖基化终末产物（AGEs）。AGEs 可能激活细胞膜受体，触发细胞内信号通路的激活，例如细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）1/2、p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、c-jun 氨基末端激酶（JNKs）、Rho-GTP 酶、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、Janus 激酶/信号转导子和转录激活子（JAK/STAT）以及蛋白激酶 C（PKC），从而增加促炎分子的释放和氧化应激1。糖基化胶原蛋白还会损害细胞外基质的结构和特性，而胶原蛋白来源的 AGEs 水平升高始终与多种疼痛相关疾病相关，包括骨关节炎、糖尿病神经病变和神经退行性疾病2,3。
本课题组先前已证明，SH-SY5Y 细胞系可被分化为类感觉神经元细胞，因为这些细胞表达参与痛觉感知的离子通道，例如钠通道（Nav 1.7、Nav 1.8 和 Nav 1.9）以及瞬时受体电位香草素亚型 1（TRPV1），这些标志物通常存在于外周感觉神经元中4。TRPV1 是一种对钙离子通透的非选择性阳离子通道，可被辣椒素刺激激活。重要的是，当类感觉神经元细胞暴露于糖化胶原基质（ECM-GC）时，会获得促痛觉功能，表现为神经元激活相关转录因子....
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方案
1. SH-SY5Y 细胞培养及向类感觉神经元细胞的分化
注意 1：本节中的所有步骤均需在层流罩内进行，所有溶液和用品均需无菌。
- 首先，通过加入 5 mL 培养基准备一个培养瓶（25 cm2）。
注意：解冻、扩增和维持该细胞类型时，使用培养基混合液：DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基与 Ham's F12 培养基混合），添加 10% 热灭活胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素。 - 然后，从液氮中取出含有 SH-SY5Y 细胞的冻存管并置于冰上。在 37 °C 水浴中解冻细胞约 2 分钟。
- 向冻存管中加入 1 mL 完全培养基，将细胞转移至 15 mL 离心管中，再加入 3 mL 完全培养基（DMEM/F12 添加 10% 热灭活胎牛血清），使用移液器反复吸取和排出以混匀细胞悬液。
- 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在 290 g 条件下离心。弃去上清液以去除二甲基亚砜（DMSO），DMSO 是一种用于防止细胞冷冻过程中形成冰晶的冷冻保护剂。
- 向细胞沉淀中加入 1 mL 培养基，用移液器充分混匀，然后将细胞接种至 25 cm2 培养瓶中进行扩增。将细胞置于 37 °C、5% CO2 湿润环境的培养箱中培养。
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结果
SH-SY5Y 细胞向类感觉神经元的分化
高内涵筛选图像表明，神经元分化方案可改变 SH-SY5Y 细胞的形态。类感觉神经元细胞（已分化细胞）呈现出圆形的细胞体，并延伸出广泛的神经丝网络。它们形成更细长的神经突，与其他邻近神经元相连接，符合成熟神经元的特征（图 3）4。重要的是，与未分化的 SH-SY5Y 细胞相比，这些细胞中 TRPV1 的表达水平显著升高（图 4）。
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讨论
伤害性感受器是一类特殊的感觉神经元亚群，介导疼痛感知。这些细胞表达电压门控和配体门控离子通道，例如TRPV1，其激活可导致钙离子内流以及神经肽和神经递质的释放，从而调控伤害性信号的传递。本文描述了一种将SH-SY5Y细胞分化为类感觉神经元细胞的实验方案，用于评估辣椒素诱导的钙离子内流8,9。重要的是，我们发现，在模拟促伤害性环境的糖化胶原条件下，辣椒素诱导的钙离子内流显著增强，证实TRPV1通道具有功能活性，且晚期糖基化终产物（AGEs）可能通过增强通道对有害刺激的反应性而使其致敏。
评估感觉神经元中的钙离子内流一直是筛选镇痛候选药物的有效工具10。在分子钙离子指示剂的设计方面已取得进展，开发出了如Fluo-8等稳定的钙敏荧光染料。Fluo-8（免洗涤法）相较于其他荧光染料具有多项优势，包括更高的荧光亮度、可在室温下操作，并对较低浓度的钙离子表现出更高的灵敏度。在本实验方案中，辣椒素通过头皮静脉输液套件施加。此前，我们.......
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披露
MCB、AMCT 和 VOZ 拥有用于鉴定参与骨关节炎疼痛的分子实体的方法专利（BR102018008561-1）。
致谢
本工作由圣保罗州研究基金会（FAPESP）资助，资助编号为 2015/50040-4 和 2020/13139-0，圣保罗研究基金会与葛兰素史克，FAPESP 2022/08417-7 和 2024/04023-0。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 全反式维甲酸 | Tocris | 695 | |
| BDNF | Tocris | TOCR-2837 | |
| BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 | |
| 蝶形23GA无菌针头 | Beckton Dickinson Asepto | 38833814 | 头皮静脉套件 |
| 辣椒素 | Sigma-Aldrich | M2028 | |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 12500062 | 基础培养基 |
| D-核糖 | Sigma-Aldrich | R7500 | |
| D-苏阿糖 | Sigma-Aldrich | T7392 | |
| Fluo-8 钙流检测试剂盒 | Abcam | ab112129 | 无需洗涤 |
| 热灭活胎牛血清 | Gibco | A5670801 | |
| 高内涵筛选 | Molecular Devices | ||
| LASX 软件 | Leica Microsystems | 显微镜软件 | |
| Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | 共聚焦显微镜 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140130 | |
| 培养皿（35/10 mm） | Greiner bio-one | 627965 | |
| 大鼠尾部I型胶原蛋白 | Corning | 354236 | |
| SH-SY5Y | Merck | 94030304-1VL | 神经母细胞瘤细胞系 |
参考文献
- Bierhaus, A., et al. Understanding RAGE, the receptor for advanced glycation end products. J Mol Med. 83 (11), 876-886 (2005).
- Hudson, B. I., et al. Blockade of receptor f....
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重印与许可
