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方法文章

晚期糖基化终末产物使类人感觉神经元细胞对辣椒素诱导的钙内流更加敏感

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DOI：

10.3791/68036

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2025年5月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pain and Signaling, Butantan Institute, 2Center of Excellence in New Target Discovery, Butantan Institute, 3Innovation and Development Laboratory, Innovation and Development Center, Butantan Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

胶原蛋白来源的晚期糖基化终末产物（AGEs）增加与疼痛性疾病始终存在关联。在此，我们研究了糖基化是否会使感觉神经元对辣椒素兴奋更为敏感。

摘要

胶原蛋白来源的晚期糖基化终末产物（AGEs）增加与多种疼痛相关疾病持续相关，包括骨关节炎、糖尿病性神经病变和神经退行性疾病。由SH-SY5Y细胞系分化而来的人类类感觉神经元在暴露于AGEs时，会通过释放P物质并上调瞬时受体电位香草素1（TRPV1）的表达而获得促伤害性功能。本研究旨在探讨该受体是否具有功能活性，以及糖基化过程是否使感觉神经元对辣椒素刺激更为敏感。类感觉神经元细胞通过全反式维甲酸和脑源性神经营养因子诱导SH-SY5Y细胞分化获得。使用糖化胶原细胞外基质（ECM-GC）孵育以模拟促伤害性刺激，对照组细胞则孵育于非糖化胶原细胞外基质（ECM-NC）中。采用Fluo-8钙流检测试剂盒评估由辣椒素刺激引发的钙离子内流。结果显示，与正常胶原处理的细胞相比，糖化处理显著增加了钙离子内流量，表明类感觉神经元表达了具有功能活性的TRPV1通道，且糖基化增强了细胞对辣椒素的兴奋性。这些数据表明，AGEs可使类感觉神经元 细胞产生高敏感性，从而触发促伤害性信号通路。综上所述，本研究建立了一个对辣椒素具有功能性响应的细胞模型，可用于筛选治疗疼痛性疾病的潜在候选药物。

引言

糖基化是一种非酶促、不可逆且自发的过程，其中蛋白质（如胶原蛋白）与还原糖分子结合，形成晚期糖基化终末产物（AGEs）。AGEs 可能激活细胞膜受体，触发细胞内信号通路的激活，例如细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）1/2、p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、c-jun 氨基末端激酶（JNKs）、Rho-GTP 酶、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、Janus 激酶/信号转导子和转录激活子（JAK/STAT）以及蛋白激酶 C（PKC），从而增加促炎分子的释放和氧化应激1。糖基化胶原蛋白还会损害细胞外基质的结构和特性，而胶原蛋白来源的 AGEs 水平升高始终与多种疼痛相关疾病相关，包括骨关节炎、糖尿病神经病变和神经退行性疾病2,3。

本课题组先前已证明，SH-SY5Y 细胞系可被分化为类感觉神经元细胞，因为这些细胞表达参与痛觉感知的离子通道，例如钠通道（Nav 1.7、Nav 1.8 和 Nav 1.9）以及瞬时受体电位香草素亚型 1（TRPV1），这些标志物通常存在于外周感觉神经元中4。TRPV1 是一种对钙离子通透的非选择性阳离子通道，可被辣椒素刺激激活。重要的是，当类感觉神经元细胞暴露于糖化胶原基质（ECM-GC）时，会获得促痛觉功能，表现为神经元激活相关转录因子 c-Fos 表达增加，以及广泛参与神经炎症和疼痛过程的神经肽 P 物质释放增多。这些细胞对镇痛药物（如阿片类原型药物吗啡）有反应，可减少 ECM-GC 诱导的 P 物质释放。综上，这些数据表明该模型对促痛觉和抗痛觉分子均具有响应性4,5。

监测细胞内 Ca2+ 浓度变化对于研究多种细胞过程至关重要。在神经元中，该方法可用于预测神经损伤以及药物的神经保护特性。辣椒素是辣椒中具有刺激性的活性成分，是研究最广泛的 TRPV1 受体激动剂5，也是研究疼痛机制和筛选潜在新型镇痛药的重要工具。先前研究表明，将来自啮齿类动物背根神经节的初级感觉神经元在高糖环境中孵育后，辣椒素诱导的钙内流显著增加6。然而，TRPV1 通道在我们的细胞模型中是否具有功能性活性，以及糖化胶原是否会使类感觉神经元细胞对辣椒素刺激更为敏感（从而可能激活伤害性信号通路），目前尚不清楚。因此，我们旨在建立一种经济高效的方案，利用简单工具实现对类感觉细胞中钙信号的实时监测，同时确保分析的可靠性。本文提供了一套完整的实验流程，帮助研究人员完成将 SH-SY5Y 细胞分化为类感觉神经元细胞的步骤，并介绍如何使其对促伤害性刺激产生敏感化反应。该方法有助于发现新的镇痛或神经保护化合物。

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方案

1. SH-SY5Y 细胞培养及向类感觉神经元细胞的分化

注意 1：本节中的所有步骤均需在层流罩内进行，所有溶液和用品均需无菌。

  1. 首先，通过加入 5 mL 培养基准备一个培养瓶（25 cm2）。
    注意：解冻、扩增和维持该细胞类型时，使用培养基混合液：DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基与 Ham's F12 培养基混合），添加 10% 热灭活胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素。
  2. 然后，从液氮中取出含有 SH-SY5Y 细胞的冻存管并置于冰上。在 37 °C 水浴中解冻细胞约 2 分钟。
  3. 向冻存管中加入 1 mL 完全培养基，将细胞转移至 15 mL 离心管中，再加入 3 mL 完全培养基（DMEM/F12 添加 10% 热灭活胎牛血清），使用移液器反复吸取和排出以混匀细胞悬液。
  4. 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在 290 g 条件下离心。弃去上清液以去除二甲基亚砜（DMSO），DMSO 是一种用于防止细胞冷冻过程中形成冰晶的冷冻保护剂。
  5. 向细胞沉淀中加入 1 mL 培养基，用移液器充分混匀，然后将细胞接种至 25 cm2 培养瓶中进行扩增。将细胞置于 37 °C、5% CO2 湿润环境的培养箱中培养。
    注意：当细胞融合度达到约 80% 时即可使用。进行神经元分化时，建议使用传代次数不超过二十代的 SH-SY5Y 细胞。
  6. 通过将大鼠尾部 I 型胶原溶于无菌 PBS 中稀释，制备细胞外胶原基质（100 µg/mL），并将 1 mL 该溶液加入培养皿（35/10 mm）中进行包被。
  7. 将培养皿置于 37 °C、5% CO2 湿润环境的培养箱中孵育约 1 小时。
  8. 孵育结束后，用无菌 PBS 洗涤培养皿两次，然后使用血球计数板进行细胞计数。
  9. 进行细胞计数时，首先用 5 mL 无菌 PBS 洗涤含有细胞的 25 cm2 培养瓶，以去除所有培养基。然后吸除 PBS，向细胞中加入 3 mL 0.05% 胰蛋白酶，并将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育约 3–5 分钟，以完成细胞脱落。
  10. 之后，将培养瓶从培养箱中取出，向其中加入 6 mL 培养基，将溶液转移至 15 mL 离心管中，在 290 g 条件下离心 5 分钟。
  11. 弃去上清液，用 1 mL 完全培养基将细胞沉淀充分重悬。
  12. 最后，使用血球计数板进行细胞计数。取 20 µL 细胞悬液与 20 µL 台盼蓝混合，取 10 µL 混合液加入血球计数板中，计数未被染成蓝色的活细胞。
  13. 将细胞以 5 × 104 cells/mL 的密度接种于培养皿（35/10 mm）中，使用前述相同的完全培养基，每孔总体积为 1 mL。
  14. 然后，静置 24 小时后开始神经元分化方案。移除原有培养基，更换为 1 mL 添加 2% 热灭活胎牛血清、1% 青霉素-链霉素和 10 µM 全反式维甲酸（RA 10 µM）的 DMEM/F12 培养基。
  15. 48 小时后开始每天更换培养基，连续更换 3 天。将细胞置于 37 °C、5% CO2 湿润环境的培养箱中培养。
  16. 第五天，移除细胞培养基，每孔加入 1 mL 添加人源脑源性神经营养因子（BDNF 50 ng/mL）的无血清培养基。
    注意：已测试不同公司生产的 BDNF（见材料表），其效果相同。
  17. 分化第七天，用无菌 PBS 洗涤细胞一次，即可用于实验的类感觉神经元细胞。若无法立即使用，可加入无血清培养基以维持细胞存活直至使用。
    注意：神经元分化结束时，必须用无菌 PBS 洗涤细胞以去除残留的 BDNF，避免细胞毒性。

2. 糖基化胶原蛋白与糖基化过程

注意：本节所有步骤均须在层流罩内进行，所有溶液和用品必须为无菌状态。

  1. 通过将大鼠尾部I型胶原纤维状态（3.89 mg/mL）与200 mM D-核糖、160 mM D-葡萄糖和200 mM D-赤藓糖在4 °C下孵育7天，制备胶原糖基化样品。
    注意：为制备糖基化胶原，需根据糖类的分子量称重，并将其与大鼠尾部I型胶原纤维状态（3.89 mg/mL）混合。
  2. 将感觉样神经元细胞培养物在不含血清和抗生素补充的DMEM/F12培养基中，分别与糖基化胶原细胞外基质（ECM-GC, 100 µg/mL）或正常胶原细胞外基质（ECM-NC, 100 µg/mL）共同孵育24小时。

3. 钙离子内流检测

  1. 对于钙离子内流，使用钙离子通量检测试剂盒，并根据制造商说明书配制溶液，具体步骤如下。
  2. 首先，通过将 2 µL Fluo-8 原液加入 998 µL 1× 检测缓冲液（HBSS 缓冲液与 10× Pluronic F127 Plus 的混合液）中，配制 1 mL 的 Fluo-8 染料负载溶液。
    注意：该工作液在室温（RT）下至少可稳定保存 2 小时。
  3. 随后，将 250 µL 上述溶液加入已预先分化并用 ECM-NC 或 ECM-GC 处理过的每孔感觉样神经元细胞培养皿中，在 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中孵育 30 分钟。然后将培养皿从孵箱中取出，在室温下避光放置 30 分钟。
    注意：若孵育时间超过 2 小时，该溶液可能产生细胞毒性。在孵育期间配制辣椒素溶液。

4. 辣椒素诱导

注意：使用辣椒素（一种 TRPV1 激动剂）诱导细胞内钙离子流入。

  1. 称取辣椒素，用1%乙醇和超纯水溶解并稀释。然后配制浓度为2 µM的溶液，并用超纯水进一步稀释。
    注意：辣椒素溶液必须在使用当天配制。应先用乙醇溶解辣椒素，再用水稀释；否则会出现沉淀。
  2. 向每个35/10 mm培养皿中加入250 µL的2 µM辣椒素溶液，使终浓度为1 µM。
    注意：辣椒素储备液的浓度为2 µM，以确保更好的分散性，避免出现孤立的荧光峰。

5. 钙离子内流成像与共聚焦显微镜分析

注意：使用配备20倍/0.75数值孔径物镜和488 nm激发激光（0.5%强度）的共聚焦显微镜进行成像。发射光在520 nm处检测。细胞在xy轴方向（512 × 512像素）上以600 Hz的速度进行时间序列（t）扫描，采集间隔为433 ms，总采集时间为5分钟。为利用显微成像软件维持细胞的生理状态，成像过程在37 °C下进行。

  1. 准备一支含有 250 µL 2 µM 辣椒素溶液的注射器（在培养板中的终浓度为 1 µM），并将其连接至头皮静脉套管针——23 GA 无菌蝶形针。使用实验台支架和夹具固定注射器。
  2. 将培养皿置于显微镜载物台上，极其小心地将头皮针插入培养皿中，避免针头接触皿底，针尖不应浸入液体中。
    注意：可使用胶带固定头皮针的位置。
  3. 选择一个细胞数量适中的视野（超过 20 个细胞），使用明场光源调节焦距。
  4. 启动实时 模式，使用 488 nm 激光，并调节焦距和照明参数。
  5. 开始采集记录，在基线期（t = 0 至 t = 60 秒）结束后，加入 250 µL 2 µM 辣椒素溶液，并轻柔推动注射器活塞，以刺激细胞内钙离子流入。
    注意：每孔板的最终记录采集时间约为 300 秒。

6. 后处理/数据分析

  1. 使用显微镜软件的定量模式进行细胞分析。首先，分析辣椒素刺激前后出现荧光尖峰的细胞。
  2. 在每个有反应的细胞（即辣椒素刺激后显示荧光尖峰的细胞）中创建感兴趣区域（ROI）。请确保如上所示（图1）将ROI绘制在整个细胞区域内。
  3. 将数据导出为逗号分隔值（CSV）文件，用于后续分析。
  4. 或者，使用免费软件FIJI7（https://fiji.sc）进行分析。
    1. 要打开图像文件，请通过选择 文件 > 导入 > Bio-Formats 使用Bio-Formats插件，并选择相应文件。
  5. 接着，使用放大镜工具放大图像，并使用自由选择工具在有反应的细胞周围绘制感兴趣区域（ROI）。
  6. 每绘制一个ROI后，按下T键将其添加到ROI管理器中。对所有感兴趣的细胞重复此操作（图2）。
  7. 所有ROI添加完成后，进入ROI管理器窗口，选中所有ROI，然后在主菜单中选择 分析 > 设置测量值。
  8. 然后返回ROI管理器，选择 更多 > 多重测量，以测量所有帧中的荧光强度。结果将显示在一个新窗口中；通过选择 文件 > 另存为 将其导出为CSV文件。
    注意：CSV文件可在Excel、Google Sheets和GraphPad软件中进行分析。使用公式 ΔF/F0 = (F(t) - F0)/F0 将Fluo-8钙通量检测试剂盒获得的荧光强度值转换为钙内流变化的相对度量。其中，F0 表示基线荧光强度，计算方式为辣椒素刺激前 t = 0 s 至 t = 60 s 期间采集图像的平均强度；F(t) 为刺激后观察到的最大荧光强度值，用于评估钙内流峰值。该方法突出了相对于基线的荧光增强，ΔF/F0 的升高表明细胞内钙水平上升。

荧光显微镜分析、图像分割；通过软件界面突出显示细胞结构。
图1：在LAS X软件中用于钙离子内流分析的选定细胞中感兴趣区域（ROI）示例。（A）LAS X软件在定量模式下的操作界面。粉红色矩形框标示定量选项卡，黄色矩形框标示绘制折线工具，青色矩形框标示缩小和放大工具。（B）采集的视野（FOV）。（C）放大视野以便在完整细胞中绘制感兴趣区域（ROI）。请点击此处查看该图的高清版本。

显微镜图像，荧光分析与ROI选区，神经细胞学数据处理软件。
图 2：在FIJI软件中为钙离子内流分析选择细胞内感兴趣区域（ROI）的示例。（A）FIJI软件界面，显示主菜单与工具栏。红色方框标注的是放大镜工具，绿色方框标注的是自由手绘选区工具。（B）放大后的视野（FOV），其中绘制了感兴趣区域（ROI）。（C）ROI管理器窗口。请点击此处查看该图的高清版本。

7. 故障排除

  1. 如果图像失焦，请尝试以下操作：
    1. 检查胶带的粘附情况；若胶带松动，可能导致针头移位并影响焦距。
    2. 使用额外胶带重新固定针头，以增强稳定性。
    3. 更换标准针头。使用预弯牙科针头可改善在培养板上的对准效果。
  2. 如果细胞信号出现饱和，请尝试以下步骤：
    1. 降低激光强度和增益设置。
    2. 核对试剂孵育时间。若超过生产商推荐时长，可能导致信号饱和，从而干扰钙离子内流的检测。
  3. 请参考以下其他建议进行故障排查：
    1. 定期校准：确保成像设备定期校准，以维持聚焦精度和信号检测质量。
    2. 记录变更：记录对实验方案所做的任何调整，以便后续参考并有助于问题排查。
    3. 动态调整：若问题持续存在，可考虑测试不同浓度的试剂或采用其他信号检测方法。

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结果

SH-SY5Y 细胞向类感觉神经元的分化
高内涵筛选图像表明，神经元分化方案可改变 SH-SY5Y 细胞的形态。类感觉神经元细胞（已分化细胞）呈现出圆形的细胞体，并延伸出广泛的神经丝网络。它们形成更细长的神经突，与其他邻近神经元相连接，符合成熟神经元的特征（图 3）4。重要的是，与未分化的 SH-SY5Y 细胞相比，这些细胞中 TRPV1 的表达水平显著升高（图 4）。

SH-SY5Y 细胞分化；β III 微管蛋白/DAPI 染色比较；荧光显微镜<...

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讨论

伤害性感受器是一类特殊的感觉神经元亚群，介导疼痛感知。这些细胞表达电压门控和配体门控离子通道，例如TRPV1，其激活可导致钙离子内流以及神经肽和神经递质的释放，从而调控伤害性信号的传递。本文描述了一种将SH-SY5Y细胞分化为类感觉神经元细胞的实验方案，用于评估辣椒素诱导的钙离子内流8,9。重要的是，我们发现，在模拟促伤害性环境的糖化胶原条件下，辣椒素诱导的钙离子内流显著增强，证实TRPV1通道具有功能活性，且晚期糖基化终产物（AGEs）可能通过增强通道对有害刺激的反应性而使其致敏。

评估感觉神经元中的钙离子内流一直是筛选镇痛候选药物的有效工具10。在分子钙离子指示剂的设计方面已取得进展，开发出了如Fluo-8等稳定的钙敏荧光染料。Fluo-8（免洗涤法）相较于其他荧光染料具有多项优势，包括更高的荧光亮度、可在室温下操作，并对较低浓度的钙离子表现出更高的灵敏度。在本实验方案中，辣椒素通过头皮静脉输液套件施加。此前，我们...

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披露

MCB、AMCT 和 VOZ 拥有用于鉴定参与骨关节炎疼痛的分子实体的方法专利（BR102018008561-1）。

致谢

本工作由圣保罗州研究基金会（FAPESP）资助，资助编号为 2015/50040-4 和 2020/13139-0，圣保罗研究基金会与葛兰素史克，FAPESP 2022/08417-7 和 2024/04023-0。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
全反式维甲酸Tocris695
BDNFTocrisTOCR-2837
BDNFSigma-AldrichB3795
蝶形23GA无菌针头Beckton Dickinson Asepto38833814头皮静脉套件
辣椒素Sigma-AldrichM2028
D-葡萄糖Sigma-AldrichG5767
DMEM/F12Gibco12500062基础培养基
D-核糖Sigma-AldrichR7500
D-苏阿糖Sigma-AldrichT7392
Fluo-8 钙流检测试剂盒Abcamab112129无需洗涤
热灭活胎牛血清GibcoA5670801
高内涵筛选 Molecular Devices
LASX 软件Leica Microsystems显微镜软件
Leica TCS SP8Leica MicrosystemsLeica TCS SP8共聚焦显微镜
青霉素-链霉素Gibco15140130
培养皿（35/10 mm）Greiner bio-one627965
大鼠尾部I型胶原蛋白Corning354236
SH-SY5YMerck94030304-1VL神经母细胞瘤细胞系

参考文献

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