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经结膜途径向大鼠视神经注射

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DOI：

10.3791/68048

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2025年4月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Vision Research, University of Iowa, 2Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa

本文内容

摘要

本方案描述了一种采用经结膜入路注射大鼠视神经的独特技术。

摘要

大鼠是研究视神经疾病的重要模型，包括遗传性、创伤性、肿瘤性及自身免疫性等疾病。由于眼眶较小且周围眶内组织血管丰富，对大鼠视神经进行实验操作和注射具有较大挑战性。以往的技术通常采用皮肤切口，这种方法感染风险较高，且需要缝合伤口。本研究旨在描述一种独特、创伤更小且可能更高效的进入大鼠视神经的方法。该方法采用结膜下切口，并结合大鼠脊髓钩来分离视神经，以进行实验性注射。在这些实验中，将腺病毒载体注射入视神经，旨在为未来实现直接基因治疗递送提供技术基础。该技术也可供其他需要进入大鼠视神经开展实验研究的研究人员使用，包括药物递送和视神经损伤研究。

引言

大鼠是研究视神经疾病（包括青光眼、外伤性视神经病变、遗传性视神经病变、脱髓鞘疾病以及视神经肿瘤）的重要实验模型,2,3,4,5,6,7。然而，由于眼眶体积较小且存在丰富的血管性眶内组织，对视神经进行实验性注射和操作往往较为困难。

先前描述的两种用于实验操作大鼠视神经的技术，分别采用眶上入路或侧方经皮入路进入眼眶8,9Raykova 等人描述了通过上眼眶皮肤切口将染色微珠注入视神经的方法8尽管他们的技术是有效的，但它需要 止血以及暴露时对牵引缝线的需求，而采用此入路时这些操作可能更具挑战性8另一组研究人员同样描述了一种通过外侧皮肤切口进入眼眶的方法。他们成功地通过该方法对视神经进行了注射，但需要进行止血和伤口缝合。9尽管这些技术是用于实验研究视神经的有效方法，但二者均需进行皮肤切口，需要止血，并进行伤口缝合。这些步骤存在感染风险，且由于需要缝合伤口，可能延长麻醉时间。8,9,10.

鉴于先前所述技术的局限性，本研究旨在描述一种更高效且创伤更小的视神经暴露方法，以用于实验研究。该方法采用脊髓钩来分离视神经，类似于临床上使用肌钩分离眼外肌及附属眼组织的手术技术。此技术可适用于需要暴露大鼠视神经的多种研究场景，包括药物递送和基因治疗等。

本文描述了一种利用脊髓钩经结膜途径进入大鼠眼眶和视神经以进行实验研究的新方法。

方案

所有动物实验程序均经爱荷华大学机构动物护理和使用委员会办公室批准。本研究由吉尔伯特家族基金会资助（资助编号 913012）。实验使用了4至12周龄、体重100至400 g的雄性和雌性斯普拉格-道利大鼠。所用试剂和设备的详细信息见《材料表》。

1. 麻醉

  1. 使用异氟烷气体吸入法对大鼠进行麻醉。将动物放入诱导室，将蒸发器调节至4%–5%以诱导麻醉，2%–3%用于维持麻醉。
    注意：若需同时使用局部麻醉剂，请遵循机构相关指南。
  2. 在继续操作前，通过评估足底回缩反射是否消失来确认麻醉深度。
  3. 将人工泪液凝胶涂抹于眼表。

2. 定位

  1. 诱导麻醉后，将动物置于加热垫上，保持侧卧位。使用鼻罩维持麻醉状态。
  2. 将眼眶置于手术显微镜下进行定位。

3. 手术暴露

  1. 用有齿镊在颞下象限夹住结膜（图1）。
  2. 使用Westcott剪刀做放射状结膜切口，然后在鼻下象限切开滕囊筋膜（图1）。采用钝性分离法去除覆盖的眶内组织。

4. 视神经的分离

  1. 使用有齿镊将眼球向鼻侧旋转，并让助手将脊髓钩插入颞下象限以分离视神经（图1）。注意避免损伤眶下静脉和眼外肌。
  2. 用棉签或镊子进行钝性分离，去除覆盖的眶内组织和滕氏筋膜 ，以暴露视神经及其鞘膜。

5. 注射

  1. 使用连接至10 µL或1 mL注射器的33 G针头刺入视神经鞘（图1）。
  2. 在直视下将不同浓度的腺相关病毒-eGFP或印度墨水染料注射至视神经内，以确保物质直接注入神经组织。
  3. 为评估AAV-eGFP，注射含有AAV病毒颗粒的10 µL悬液（2 × 1013 载体基因组（vg）/mL，总剂量为2 × 1011 vg）。
    注意：研究人员可根据实验需求注射其他染料或染色剂。

6. 术后步骤

  1. 将结膜复位于角巩膜缘处，以覆盖切口部位，并在结膜上涂抹抗生素软膏（图1）。
  2. 让动物从麻醉中恢复，并监测其是否有任何感染迹象。

7. 染色

  1. 注射后第7天处死动物 通过 CO2 窒息后颈椎脱位11 遵循伦理准则。解剖视神经。
  2. 将视神经固定于4%多聚甲醛中，并用浓度递增的蔗糖溶液冲洗。将冷冻模具包埋于OCT包埋剂与20%蔗糖按2:1配制的溶液中。在液氮中快速冷冻样本，于-80 °C保存，并切片至7 μm厚度。
  3. 在室温下，用免疫细胞化学（IHC）缓冲液和3%牛血清白蛋白封闭视神经冰冻切片30分钟。将切片与用IHC缓冲液稀释的大鼠抗GFP一抗在室温下孵育2小时。
  4. 室温下，将切片在IHC缓冲液中与山羊抗大鼠二抗孵育1小时。在二抗孵育期间，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）对切片进行染色，以显示细胞核。用PBS充分漂洗切片后，使用封片剂封片。

8. 成像

  1. 使用直立式共聚焦显微镜系统对标记的切片进行成像。
  2. 具体而言，使用405 nm紫激光观察DAPI标记，使用488 nm青蓝激光观察GFP。
    注意：不同共聚焦显微镜系统的用户应针对各激光参数（如激光功率、强度/增益、背景/噪声滤波）进行优化。使用20倍物镜采集图像。

结果

使用该技术进行大鼠视神经注射的代表性实验结果如图2所示。在本示例中，采用上述经结膜技术，通过连接10 µL注射器的33 G针头将腺相关病毒-eGFP（AAV-eGFP）注射至大鼠视神经内。这些结果来自一项实验，该实验旨在研究视神经注射技术，最终目标是在神经纤维瘤病1型（NF1）大鼠模型中利用AAV将CRISPR校正递送至视神经。实验中结合使用染料与AAV载体以优化注射技术。动物在视神经注射后7天被处死，随后解剖视神经并用抗GFP抗体标记，以便通过共聚焦显微镜成像，确认物质已成功穿透视神经鞘并进入视神经内部。抗体染色证实了物质成功导入视神经，在共聚焦显微镜下呈现绿色荧光，如图2A所示。在部分病例中，若穿刺未能完全穿透视神经鞘，或存在针道回流，则染色信号出现在视神经鞘边缘而非神经组织内部，如图2C所示。

外科耳部手术步骤序列，共六个步骤，展示去除技术及所用医疗工具。
图1：手术步骤序列。（A）用有齿镊夹住结膜，使用Westcott剪刀进行角膜缘环形切开。（B）打开并钝性分离Tenon筋膜后，在Westcott剪刀辅助下暴露眶部。（C）插入脊髓钩并用于分离视神经。（D）钝性分离覆盖的眶内组织后，使用脊髓钩暴露视神经。（E）使用33 G针头穿刺视神经鞘，将腺病毒或染料注入视神经。（F）将眼球复位于眶内，将结膜重新覆盖于环形切开部位。 请点击此处查看该图的放大版本。

AAV-eGFP and DAPI staining in animal tissue sections; includes optic nerve head and chiasm analysis.
图2: 成功注射 AAV-eGFP（绿色）后 7 天大鼠视神经的代表性荧光共聚焦全景图像，其中载体转导了视交叉附近的神经元. (A视神经核用 DAPI 标记（蓝色）。箭头所示的 ONH 表示视神经头或神经的眶端，而视交叉端标记为“chiasm”。B) 大鼠视神经从眼眶至视交叉段包埋于冷冻切片冰块中的照片。在眼眶后方立即注入墨汁（注射部位以黑色箭头标示），以确定视神经的方位。C) 大鼠视神经在注射 AAV-eGFP（绿色）失败后 7 天的全景荧光图像，其中大部分病毒载体溶液可能已从神经束中溢出，转导了视神经鞘。视神经核用 DAPI 标记（蓝色）。ONH 表示位于神经视网膜后方紧邻的视盘，白色箭头指示注射部位。视交叉及白色箭头指向视交叉方向。比例尺 = 400 μm（A）以及（中的 200 μmC). 请点击此处以查看此图的放大版本。

变量入路
经结膜上方外侧
皮肤切口无有有
结膜切口有无无
显微镜有有有
上眶肌离断无有无
牵引缝线无有有
脊髓钩有无无
皮肤缝合无有有

表1：分离大鼠视神经用于实验研究的现有已发表技术比较。 通过结膜下、上方和侧方入路，对是否需要皮肤切口、结膜切口、手术显微镜、上眶肌横断、牵引缝线、脊髓钩以及皮肤缝合等变量进行比较。

讨论

本文介绍了一种无需皮肤切口即可获取大鼠视神经以进行实验研究的新方法。由于无需切开皮肤且操作步骤较其他技术更少，该方法具有操作高效以及降低感染和出血风险的潜在优势8,9。该技术还采用了一种新颖的方法，即使用大鼠脊髓钩分离视神经，以避免对神经及周围组织造成损伤。

该技术的关键步骤包括：制作足够大的角膜缘切口以进入结膜下间隙，使用脊髓钩分离视神经，以及使用细针穿刺视神经鞘并将物质注入视神经。操作时需注意旋转脊髓钩以充分分离神经。当视神经未能清晰暴露时，可能需要多次插入钩子以确保神经被成功分离，此时可使用棉签轻轻去除神经鞘周围的结缔组织，以改善视野。在体型较大、眶内脂肪较多的动物中，该技术的暴露难度可能更高。在这些情况下，由助手协助牵拉周围组织以获得充分暴露会有所帮助。注射过程中必须直接观察视神经，确保针头垂直穿过神经鞘，这有助于提高注射的成功率。

该技术基于 Raykova 等人以及 Hallas 和 Wells 之前的研究所建立8,9。Raykova 等人描述了通过上方入路接触大鼠视神经的方法，即在眶缘上方做皮肤切口并横断上眶肌8。尽管该方法可暴露视神经，但需横断一条眼外肌，出血风险较高，且需缝合皮肤切口。类似地，Hallas 和 Wells 描述了一种通过侧方入路进入大鼠眼眶以到达视神经的方法9。他们采用侧方皮肤切口，随后做结膜侧方切口，并使用牵拉缝线旋转眼球以暴露视神经9。与上方入路相似，该技术涉及皮肤切口，因而需要伤口闭合，且存在较高的感染和出血风险8,9。本文所介绍的经结膜技术避免了皮肤和肌肉切口的需要，从而降低了出血和感染的风险，并因无需缝合皮肤切口而提高了操作效率。该手术造成动物痛苦极小，耐受性良好，且无需长期使用镇痛或抗炎药物。经结膜技术与先前发表的技术在表1中进行了比较和对照。

本研究中所介绍技术的局限性包括：使用脊髓钩分离视神经存在一定的学习曲线，但一旦掌握，该技术可实现高效且无创的神经分离。操作显微镜的使用经验对于该技术至关重要。尽管存在学习曲线，但由于步骤较少且无需缝合伤口，相较于其他已发表的方法，该技术更易于掌握8,9。必须仔细进行钝性解剖以暴露视神经及其鞘膜，因为邻近血管和肌肉组织可能发生出血。在体型较大的大鼠中，由于眼眶内脂肪/组织增多，暴露较大范围的视神经可能更为困难，但通过细致操作，通常可通过钝性解剖去除这些组织，从而改善神经的可视化效果。未来的研究可进一步探讨该技术在其他模型系统（如小鼠）中的应用，并可直接比较其在视神经暴露方面的手术效率与其他技术的差异。

该技术可供其他需要对大鼠视神经进行实验研究的科研团队使用。本研究所展示的实验是更大规模项目的一部分，旨在开发在1型神经纤维瘤病（NF1）大鼠模型中向视神经递送CRISPR基因校正的方法。该项目的最终目标是寻找能够直接向NF1患者视神经递送基因治疗的途径，以预防威胁视力的视神经胶质瘤的发生12。在本研究中，向视神经注射了印度墨水染料或AAV-eGFP载体，以确认物质可被成功递送至视神经，并证明该载体能够穿透视神经组织。

该技术可被其他研究者更广泛地应用，因为可能需要进入视神经或注射新型治疗药物，以治疗多种威胁视力的疾病，包括视神经肿瘤、Leber遗传性视神经病变等退行性疾病、外伤性视神经病变、青光眼以及视神经炎等自身免疫性疾病13,14。例如，Singh 等人描述了将 C6 胶质瘤细胞注射到大鼠视神经中，通过皮肤切口进入神经，建立神经纤维瘤病1型的模型3；Kwon 等人采用侧方皮肤入路进入视神经，用于研究视神经受压及干细胞介导的再生6；Negishi 等人则进入大鼠视神经以植入施万细胞移植物，作为视神经再生的模型15。本文所介绍的技术可为上述这类需要进入大鼠视神经以回答多种实验问题的研究，提供一种更高效且更安全的方法。

总之，本研究证明了采用小规格针头方法进入视神经的有效性，并能够在无需皮肤切口的情况下穿透神经鞘膜。代表性图像显示，腺病毒载体成功穿透了视神经。该技术可应用于再生医学、肿瘤学以及遗传性视网膜疾病中的多种视神经相关实验。

致谢

作者感谢Gilbert Family Foundation对本项目的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）MilliporeSigmaD95421:10,000 稀释，用于冰冻切片染色
AAV 病毒颗粒VectorbuilderN/A用于视神经注射的载体
Aqua-Mount 封片剂ThermoFisher Scientific14-390-5用于冰冻切片染色后的封片
牛血清白蛋白 Research Products International Corp9048-46-8用于冰冻切片染色过程
山羊抗大鼠 Alexa Fluor 488 Thermo Fisher ScientificA-110061:1,000 稀释，用于冰冻切片染色
异氟烷气体Primal Healthcare66794-017-10用于麻醉的气体
Leica TCS SPE 直立共聚焦显微镜系统 Leica MicrosystemsN/A共聚焦显微镜
鲁尔锁注射器BD309628用于注射
Microm HM505E 冰冻切片机 MicromM-HM360 fom Marshall Scientific用于组织切片
大鼠抗GFP抗体 BioLegend3380021:500 稀释，用于冰冻切片染色
脊髓钩F.S.T10162-12用于分离视神经的钩状工具
十微升注射器HamiltonCAL 803901用于注射
33 号针头JBPJBP3308B用于注射
Tissue-Tek OCT 包埋剂 VWR International25608-930用于冰冻模具处理
有齿镊Bausch and LombE1809用于夹持结膜
Westcott 弯曲肌腱剪Bausch and LombE3323-R用于制作结膜切口

参考文献

  1. Korn, P., et al. Evaluation of the neuroprotective effects of methylprednisolone and surgical decompression in a rodent model of traumatic optic neuropathy. Curr Eye Res. 47 (3), 461-467 (2022).
  2. Lim, J. Y., Utzschneider, D. A., Sakatani, K., Kocsis, J. D. The attenuation of GABA sensitivity in the maturing myelin-deficient rat optic nerve. Brain Res Dev Brain Res. 72 (1), 15-20 (1993).
  3. Singh, D., Dromel, P. C., Perepelkina, T., Baranov, P., Young, M. C6 cell injection into the optic nerve of long-evans rats: A short-term model of optic pathway gliomas. Cell Transplant. 29, 963689720964383(2020).
  4. Schwaner, S. A., Feola, A. J., Ethier, C. R. Factors affecting optic nerve head biomechanics in a rat model of glaucoma. J R Soc Interface. 17 (165), 20190695(2020).
  5. Ellouze, S., et al. Optimized allotopic expression of the human mitochondrial ND4 prevents blindness in a rat model of mitochondrial dysfunction. Am J Hum Genet. 83 (3), 373-387 (2008).
  6. Kwon, H., Park, M., Nepali, S., Lew, H. Hypoxia-preconditioned placenta-derived mesenchymal stem cells rescue optic nerve axons via differential roles of vascular endothelial growth factor in an optic nerve compression animal model. Mol Neurobiol. 57 (8), 3362-3375 (2020).
  7. Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. J Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).
  8. Raykova, K., Jones, M. V., Huang, H., Hoffman, P. F., Levy, M. Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve. J Vis Exp. (99), e52249(2015).
  9. Hallas, B. H., Wells, M. R. A novel technique for mulitple injections into the mamallian optic nerve. Kopf Carrier. 54, 1-10 (2000).
  10. Yan, F., et al. Partial optic nerve transection in rats: A model established with a new operative approach to assess secondary degeneration of retinal ganglion cells. J Vis Exp. (128), e56272(2017).
  11. Han, I. H., et al. Biocompatibility of human induced pluripotent stem cell-derived retinal progenitor cell grafts in immunocompromised rats. Cell Transplantation. 31, 1-25 (2022).
  12. Tang, Y., Gutmann, D. H. Neurofibromatosis Type 1-associated optic pathway gliomas: Current challenges and future prospects. Cancer Manag Res. 15, 667-681 (2023).
  13. Pan, T., et al. Implantation of biomimetic polydopamine nanocomposite scaffold promotes optic nerve regeneration through modulating inhibitory microenvironment. J Nanobiotechnol. 22 (1), 683(2024).
  14. Gokoffski, K. K., Peng, M., Alas, B., Lam, P. Neuro-protection and neuro-regeneration of the optic nerve: recent advances and future directions. Curr Opin Neurol. 33 (1), 93-105 (2020).
  15. Negishi, H., Dezawa, M., Oshitari, T., Adachi-Usami, E. Optic nerve regeneration within artificial Schwann cell graft in the adult rat. Brain Res Bull. 55 (3), 409-419 (2001).

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