本方案描述了一种新生仔猪急性肺损伤模型的建立方法，该模型模拟早产肺中发生的早期致病事件，包括表面活性物质不足、高氧暴露、高压通气以及炎症反应，旨在促进对支气管肺发育不良分子触发机制的理解，并推动治疗策略的转化应用。
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摘要
摘要
早产是导致儿童发病和死亡的主要原因。支气管肺发育不良（BPD）是极早产的严重后果，可导致肺部生长异常及长期发育影响。BPD的发病机制是多因素的，主要驱动因素包括机械通气、高氧暴露和炎症反应。目前尚无针对BPD的有效治疗方法。本研究提出了一种可行且可重复的新生仔猪急性肺损伤（ALI）模型，该模型模拟了人类早产儿肺部所面临的临床刺激。这种多因素打击ALI新生仔猪模型结合了表面活性物质耗竭、高氧暴露、高压通气以及气管内给予脂多糖（LPS），可导致氧合功能受损、肺功能紊乱、中性粒细胞浸润引起的炎症反应以及组织学上的肺损伤。该模型的主要优势在于采用了已知可驱动BPD发病的关键有害刺激因素，且易于维护。该模型可产生高度可靠的ALI，符合美国胸科学会（American Thoracic Society）制定的ALI标准。此类大动物模型（如本研究中的仔猪模型）对于理解早期致病因素、识别治疗靶点以及推动临床转化具有重要意义。
引言
极早产是导致五岁前儿童死亡的主要原因1。早产最常见的严重并发症是支气管肺发育不良（BPD），这是一种慢性肺部疾病，其多因素致病机制包括炎症、高氧引起的氧化应激以及呼吸机相关性肺损伤2。这种微环境会损害肺部生长，对早产儿的生长和发育产生长期影响3。目前尚无针对BPD的治疗方法。
最近一项关于间充质基质细胞作为支气管肺发育不良（BPD）潜在治疗方法的系统综述发现，现有的临床前研究数据均来自啮齿类动物4。鉴于啮齿类动物模型来源广泛、使用方便且易于维护，这一现象较为普遍。然而，为了确保针对早产儿的新疗法和在研疗法在转化应用中的成功，开展大动物模型的研究至关重要。许多临床试验因临床前研究不足而失败5，从而延缓了患者治疗手段的开发进程。尽管非人灵长类动物模型是为人类临床试验奠定基础的首选临床前模型，但其存在操作繁琐、成本高昂且不易获得等局限性。相比之下，新生仔猪模型具有显著优势：其用药和设备使用与新生儿护理相似，能够模拟临床新生儿重症监护环境，从而提高向临床转化的可行性。此外，猪肺的免疫系统与人类高度相似6,7,8,9，其Toll样受体4（TLR4）的遗传变异与人类共享超过80%10，巨噬细胞对脂多糖（LPS）具有反应性11,12，并可产生一氧化氮13——这些因素均可能参与人类肺部炎症反应14。此外，来源于猪的肺表面活性物质已被临床证实可用于治疗早产儿急性肺部疾病15。
本方案介绍了一种新型的一天内完成的大型动物多因素急性肺损伤（ALI）模型，该模型在新生仔猪中建立，具有稳定、标准化且可转化的结果，符合美国胸科学会（American Thoracic Society）ALI标准16,17,18。在成年猪中，已有研究通过反复使用生理盐水进行肺灌洗以耗竭表面活性物质，并结合高压通气及后续脂多糖（LPS）或其他毒性物质暴露来诱导肺损伤18。然而，在新生仔猪中类似的模型极为有限19,20。本方案描述了如何在高氧和高压通气条件下，采用改良的表面活性物质耗竭性肺灌洗方法21,22,23诱导肺损伤，随后通过直接向肺内滴注LPS引发炎症反应。该模型可在肺损伤诱导后，对选定的治疗手段进行局部（经气管 - IT）或全身（静脉注射 - IV）给药，并持续监测其效应达5小时。整体框架高度模拟早产儿肺部的病理状态。表面活性物质的耗竭可重现新生儿呼吸窘迫综合征（RDS），其特征为出生时缺乏表面活性物质。该病症常伴随气压伤、萎陷伤以及需要高浓度氧疗和机械通气的氧合障碍。此外，大多数早产儿出生时即处于炎症环境中，原因包括绒毛膜羊膜炎或感染，本仔猪模型通过给予LPS试图复制这些特征。这种多因素ALI模型再现了人类早产肺所面临的相似临床刺激，将为早期支气管肺发育不良（BPD）的致病机制研究以及优化潜在治疗手段的递送策略提供宝贵的见解，促进有效的临床转化24。
方案
所有实验均由经过认证的人员在获得地区动物护理委员会和动物护理与兽医服务部门批准后（方案编号 OHRIe-3731），依照国家和机构相关规定进行（https://ccac.ca/en/guidelines-and-policies/）。本模型使用0–3日龄、雌雄皆有的约克夏、长白和杜洛克混合品种新生仔猪。文中提供了实验全过程的操作步骤详细说明，包括准备、麻醉、液体与药物管理及监测（步骤1-3），手术操作（步骤4），诱导多因素肺损伤前的稳定期（步骤5），诱导多因素肺损伤（步骤7），损伤后的观察与维持通气（步骤6、8），以及最终实施安乐死并结束实验（步骤10）。此外，还提供了一项可选的标准化气管内治疗操作流程（步骤9）。从农场获取动物到实验结束并完成样本采集的总时长约为12–15小时。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 实验准备
- 在仔猪到达前开启并校准监护仪和呼吸机。确保监护仪中已插入存储卡，以便在实验期间持续记录数据。
- 设置呼吸机参数：吸气峰压（PIP）15 cmH2O，呼气末正压（PEEP）6 cmH2O，吸气流速 8 L/min，呼吸频率（RR）30 次/分钟，吸气时间（Tinsp）0.4 秒，吸入氧浓度（FiO2）1.0，并连接新的通气管路和湿化器。
- 准备无菌手术包、手术巾、耗材（包括药品——参见材料表）、导管以及打印好的病例报告表（CRF）。根据研究团队判断，将手术室温度升高至 25 °C 或更高。将保温毯/水垫加热至 39 °C。准备可随时启用的强制空气加温系统，以备额外体温调节之需。
- 将 1 L 生理盐水袋置于 39 °C 温水浴中，用于制备肺灌洗液。
- 设置药物输注泵（氯胺酮和丙泊酚），并向输液泵中添加新的室温乳酸林格氏液和葡萄糖溶液袋。
- 仔猪在本地农场与母猪同住，直至由研究人员接走前均可自由接触母猪。记录其性别、年龄、 litter 大小及出生时间。
注意：使用经批准的大学运输车辆并由合格驾驶员驾驶，运输过程中须有经验丰富的团队成员全程陪同。仔猪置于一个大型封闭式柔软运输箱内，使其能够安全、自由地活动并以无限制姿势躺卧（必要时可用毛毯包裹热水袋作为热源）。此举可确保仔猪在这一安抚性环境中保持镇静（常会入睡）。运输箱须用安全带固定。团队成员应轻声安抚仔猪，避免噪音，以最大程度降低其应激水平。 - 抵达研究机构后，尽量减少噪音，在将麻醉面罩轻轻置于仔猪面部时应轻柔地固定其身体。
2. 动物准备
注意：本部分包括麻醉的诱导与维持（遵循机构批准的方案）。
- 启动 O2 放置鼻罩时，先不使用异氟烷。待仔猪安静后，开始通入异氟烷，并逐渐增加浓度至3%（约60秒）。密切监测呼吸情况，并据此调整异氟烷用量。
- 确认仔猪无反应性 通过 足趾强力夹捏
- 仔猪失去反应后，称重并测量其体长，以确定合适的药物剂量。
- 注射盐酸丁丙诺啡（0.04 mg/kg） 通过 使用25 G针头通过后肢肌肉注射（IM）途径给予镇痛。
- 将脉搏血氧仪连接至右前蹄（动脉导管前），连接无创血压袖带（直至股动脉插管完成），并连接心电图导联。
- 在双耳插入24 G留置针。连接已用生理盐水冲洗的6" 使用带四通旋塞的延长装置。用压舌板支撑耳部，以避免体位性阻塞。
- 通过插入的耳部导管采集血液，使用经校准的血糖仪按照制造商说明书进行血糖（BG）测量。
- 以5 mL/kg/h的速度开始静脉输注5%葡萄糖溶液（D5W），并根据血糖水平调整输注速度，使血糖（BG）目标维持在4-5 mmol/L。
- 在第二耳缘静脉推注镇痛/麻醉药物。
注意：必须充分了解这些药物的特性和副作用，才能实现其最佳且安全的使用。- 静脉推注稀释后的氯胺酮（10 mg/mL）2 mg/kg，以及静脉推注丙泊酚（10 mg/mL，1%）5 mg/kg，后者分多次小体积推注。需警惕丙泊酚推注后可能出现呼吸暂停。继续谨慎给予丙泊酚小剂量推注（累计总量达5 mg/kg），直至幼猪对足趾强力捏夹刺激无反应，并成功建立持续性丙泊酚输注。
- 停止异氟烷（在开始静脉输注丙泊酚后），并在整个实验剩余过程中持续进行静脉麻醉。
- 根据心率、血压及缩足反射等指标，谨慎调整以下麻醉方案的输注速率，开始持续输注，以达到稳定的手术麻醉深度：
- 静脉注射丙泊酚（10 mg/mL），剂量为10–30 mg/kg/h（相当于1–3 mL/kg/h）。
- 氯胺酮（100 mg/mL），静脉输注，剂量为5-10 mg/kg/h（相当于0.05-0.1 mL/kg/h）。
注意：镇痛/麻醉输液管路应连接至D5W输液的对侧耳缘导管。可能需要调整总液体摄入量和环境温度，以确保适当的生理支持与内环境稳定。
3. 液体、药物和监测
注意：本节介绍如何维持水合作用、葡萄糖供应、镇痛/麻醉，以及确保对实验数据、关注点或问题进行适当审查。
- 确保维持内环境稳定时，总液体（LRS 和 D5W）静脉输注速率通常为 5–8 mL/kg/h。
- 通过耳缘静脉导管以5-10 mL/h的速度输注5%葡萄糖溶液（根据动脉血糖值每小时调整，目标血糖4-5 mmol/L）。
- 通过股静脉导管以1-6 mL/kg/h的速度输注乳酸林格液（LRS），以维持体液稳态。为防止动脉和静脉通路发生凝血，将加压的含肝素生理盐水（NS）输注袋连接至压力传感器，并维持压力在250-300 psi之间。
- 确保在整个手术过程中、开始稳定期（步骤5.1）之前以及诱导肌肉松弛前，维持适当的全身麻醉深度和镇痛效果。
- 监测各项参数（整个实验期间需一人专职负责）。
注意：在预先印制的病例报告表（CFR）中监测并记录生命体征、呼吸机参数、干预措施、采集样本、药物（包括剂量和时间）（参见 补充文件 1在整个实验过程中持续记录。实验结束时，保存来自压力监测仪和呼吸机的连续记录数据，以供后续分析。- 监测血氧饱和度（SpO₂）2确保导管前（右前肢）脉搏氧饱和度监测信号。
- 监测心率（HR）——将心电图导联连接至仔猪。
- 监测体温时，将润滑后的直肠温度计插入直肠3-4厘米深处，并用胶带固定于尾部。通过调节加热垫和室温（25 °C）使仔猪直肠温度维持在38–39 °C。若使用电加热源，需在仔猪与加热垫之间加铺一层额外毯子，以防烫伤。
注意：如果无法充分维持体温稳态，可使用额外的加温设备，例如强制空气加温系统（如覆盖在仔猪上方的加温毯）。 - 对于血压，在术前至术后期间使用合适尺寸的袖带进行无创监测，随后测定有创血压，包括平均动脉压（MAP）和中心静脉压（CVP），并记录在病例报告表（CRF）中。
注意：为确保读数准确，动脉和静脉换能器 dome 应放置于心脏水平并调零。 - 在预先规定的时间点进行采血 通过 中心动脉或静脉导管。使用便携式血液分析仪对0.1 mL肝素化动脉血进行血气分析（该仪器至少可检测pH、PCO₂2，PO2，HCO₃⁻3，BE、BG、乳酸、肌酐、Na、K、Cl——需记录于CRF中，以在实验全程管理通气和代谢控制。
- 为后续实验和分析进行生物采样：根据研究目的，在实验方案的关键时间点采集全血、血浆和尿液。同时采集终点样本，包括支气管肺泡灌洗液（BALF）、肺组织及其他组织16,17，根据研究目的的相关性。
- 减少医源性贫血和低血容量
- 缓慢抽取相当于三倍死腔体积的血液至注射器中，暂置一旁，再抽取足够量的血液用于后续实验分析（0.4–1.5 mL）25 例如炎症和氧化应激标志物。根据仔猪的体重、血红蛋白水平和稳定性调整样本体积。
注意：将死腔内的血液回输给动物，并用至少等于采血量（血气分析±未来实验用血）的生理盐水冲洗管路，以清除管内残留血液，减少因血液凝固导致管路堵塞的可能性。
- 缓慢抽取相当于三倍死腔体积的血液至注射器中，暂置一旁，再抽取足够量的血液用于后续实验分析（0.4–1.5 mL）25 例如炎症和氧化应激标志物。根据仔猪的体重、血红蛋白水平和稳定性调整样本体积。
- 减少医源性贫血和低血容量
- 每15-30分钟定期在病例报告表（CRF）中记录所有生命体征和通气参数，在麻醉诱导和手术期间或当仔猪生命体征不稳定时应更频繁地记录。
- 记录从麻醉开始到整个实验过程中药物使用的变化情况，包括给药起止时间及剂量调整。
- 通过定期评估趾部/冠状带夹捏引起的退缩反射，初步判断麻醉深度。一旦达到完全肌肉松弛，通过监测心率和血压持续评估麻醉深度。
- 实验过程中，若无其他说明，应始终维持以下指标：HR：120–180 次/分，MAP：50–80 mmHg，CVP：3–10 cmH₂O2体温：38–39 °C，血糖：4–5 mmol/L，PaCO₂2：35-45 mmHg，调整呼吸频率（最大60次/分钟），潮气量（VT）：7 mL/kg，调整气道峰压（PIP）。
4. 手术步骤（时间：约30-40分钟）
- 手术过程中保持通风。
- 维持呼吸频率为30次/分钟，根据PIP调整目标呼气潮气量至10 mL/kg，保持恒定PEEP为6 cmH₂O2O, Tinsp 0.4 秒和 FiO2 在1.0处。
- 通过标准刷洗技术，在颈部进行首选的无菌皮肤刷洗以建立气管切开术的无菌区域，在腹股沟进行刷洗以建立股血管通路的无菌区域。
- 进行颈部切口。
- 使用手术刀在环状软骨与胸骨上切迹之间（约10 cm）进行颈部皮肤切口。采用钝性分离法游离气管。
- 在气管下方穿入两根12英寸的脐带结扎线。
- 在环状软骨下方，于气管软骨环与气管最前段之间做一个5 mm的切口。插入气管导管（ETT）。在靠近切口的气管上方打第一个结。
- 充气气管导管套囊，轻柔回撤气管导管，直至套囊被固定带阻挡。收紧第一根固定带，并在气管导管上固定第二根固定带。该方法可确保导管尖端位于隆突上方，通过听诊双侧对称呼吸音予以确认。
注意：右侧颅叶支气管起始于气管分叉的近端。若气管插管（ETT）插入过深，需警惕该支气管阻塞。如出现通气困难或突发性变化，应考虑调整导管位置。迷走交感干和喉部神经位于颈部该区域，操作时须小心避免刺激或损伤这些神经。
- 进行腹股沟切口。
- 触诊股动脉，使用手术刀在右侧腹股沟处做一浅表皮肤切口（约8-10 cm）。
- 采用钝性分离法游离股动脉和股静脉。
- 在股动脉和股静脉下方各穿入两根缝线（3.0 丝线），以分离血管26准备待插入的导管。
- 右侧股静脉插管时，提起两条缝线以阻断血流，结扎远端股静脉 到预定的插入位点。
- 完全插入导管，稍向后撤出导丝，结扎远端固定线以固定导管位置。取出导丝，连接已用生理盐水预充的6英寸延长管，延长管末端接三通旋塞阀。
- 在固定导管前，回抽少量血液以确认管路通畅。使用近端缝线结扎固定导管于血管内，防止导管滑脱。
- 将次级管路连接至用于输注维持液体和药物的端口。将主要管路连接至中心静脉压监测端口。
- 对于右侧股动脉插管，采用与步骤 4.2.2.3.1.1 至 4.2.2.3.1.3 中所述静脉插管相同的操作步骤作用于股动脉。
- 将三通旋塞阀的第一个接口连接至有创血压监测装置，并使用外科缝合钉关闭腹股沟和颈部切口。
- 右侧股静脉插管时，提起两条缝线以阻断血流，结扎远端股静脉 到预定的插入位点。
- 进行经耻骨上膀胱穿刺造瘘术以建立尿路通路。
- 膀胱位于下腹部浅层，略偏于矢状面中线左侧。使用无菌技术清洁腹部。
- 插入无菌的18 G血管导管（2") 与腹壁平行，位于最下一对乳头的头侧（脐下5-6 cm），针头指向脐部，同时用一只手在膀胱两侧施加轻微压力，以固定并使其略为增大（关于耻骨上穿刺抽吸的可选操作方案，可参见其他文献）27).
- 确认尿液流出后，用胶带将导尿管固定于腹部以稳定其位置。将一根大孔径的延长管连接至导尿管，远端置于动物下方的50 mL离心管中。
- 进行颈部切口。
5. 稳定化及标准化术后肺复张（时间：约 30-60 分钟）
注意：当所有手术操作完成后，开始进入稳定阶段。在给予肌肉松弛剂之前，必须确保充分的镇痛/麻醉深度，以保证平均动脉压（MAP）和心率（HR）等生命体征处于正常范围，并且无痛觉退缩反射。在整个实验过程中将持续监测 MAP 和 HR，以确保麻醉深度适当。
- 静脉推注罗库溴铵（0.3 mg/kg）通过 耳静脉建立D5W通路后，在肺复张操作前开始持续输注罗库溴铵（5.5 mg/kg/h）以实现肌肉松弛。该输注将持续整个实验过程，以标准化肺灌洗操作并防止与呼吸机不同步。
- 实施标准化的肺复张手法。
- 呼气末正压（PEEP）的逐步增加：从 PEEP 6 cmH₂O 开始2O，升高1 cmH₂O2每分钟调整至PEEP 10 cmH₂O2达到目标后，调整吸气峰压（PIP）以维持潮气量（VT）为10 mL/kg。
- 保持呼气末正压（PEEP）为 10 cmH₂O2O₂ 2分钟，然后恢复至PEEP 6 cmH₂O2以相反的方式进行（如步骤5.2.1所述），同时维持潮气量（VT）为10 mL/kg。
- 当在PEEP 6 cmH₂O条件下，VT稳定于10 mL/kg时2记录呼吸机参数、生理指标，并采集动脉血气（时间点 VT 10 mL/kg 在CRF上。
- 确保 PaO₂2 是 >400 mmHg（肺部健康的动物对高氧的预期反应）。FiO₂2 1.0 用于实验初期阶段，以确保对高氧产生适当反应，并将其作为纳入标准。
- 如果未达到此条件：
- 检查气管插管的位置、呼吸机设置、氧气输送情况以及正确的采血技术。重复进行一次肺复张操作，以确保充分复张。
- 若仍未改善，则应排除该动物并立即实施安乐死（遵循机构批准的方案），原因是肺部可能存在内在问题（由于此前非实验性暴露导致的不健康肺脏，例如在农场期间）。
- 调整呼吸频率以维持 PaCO₂2 35–45 mmHg
- 降低PIP以达到7 mL/kg的VT，同时维持FiO₂2 1.0 和 PEEP 6 cmH₂O2O.
- 稳定后记录 时间点 基线 在CRF表上记录VT 7 mL/kg时的生理参数和样本读数，包括动脉和静脉血气。稳定化标准包括生命体征（同3.2.10步骤）以及血气数值：PaO₂2：400-500 mmHg，PaCO₂2：35-45 mmHg，pH：7.35-7.45，BG：4-5 mmol/L。
6. 对照动物的通气
- 采用容量控制通气，潮气量为 7 mL/kg，PEEP 为 6 cmH2O，吸入氧浓度（FiO2）为 1.0。对照组动物不诱导肺损伤（即不进行表面活性物质耗竭或内毒素滴注）。
- 持续通气约 90 分钟，以匹配实验组动物诱导肺损伤所需的平均时间（参见步骤 7 和 图 1）。此阶段结束后，直接进入步骤 10。
7. 急性肺损伤的诱导（多打击模型）
- 进行表面活性剂去除（时间：1–2 小时）
- 开始肺灌洗前，打开吸引装置并确保其处于可用状态。将灌洗液收集桶放置到位。在动物头部下方及手术台下方放置吸水垫，以收集灌洗过程中漏出和回收的全部液体。
- 称量灌洗前后的棉垫。将呼吸机设置为PEEP 5 cmH₂O。2O，PIP 25 cmH₂O2O，RR 25 次/分，FiO₂2 1.0. 在整个灌洗过程中维持这些压力控制的通气设置。预期在完整灌洗期间潮气量（VT）会下降约35%–45%。
- 断开呼吸回路与气管导管（ETT）的连接，并连接灌洗漏斗装置（参见 补充文件 1).
- 将约30 cm高处的漏斗中的温热等渗盐水（NS）缓慢倒入，向肺内灌注30 mL/kg的NS。
- 通过在肋骨两侧的侧面施加双侧按压来按摩肋骨，以提供机械刺激 "挤压" 帮助将生理盐水推入肺部，并在灌洗装置内循环。每次按摩间隔2-3秒。
注意：避免按摩过快或过慢，以防表面活性物质去除不充分或静脉回流受损。每次灌洗操作时间不得超过30秒。- 将漏斗移至仔猪下方以排出灌洗液。略微松开漏斗与气管导管之间的连接，使液体流入地面的收集桶中。
- 每次主动吸引不超过10秒。在持续胸廓按压以促进液体引流的同时，将吸痰管插入气管导管。监测平均动脉压（MAP）和心率（HR），若任一参数显著下降，应尽早重新连接通气。
- 重新连接呼吸回路。如果气管导管内仍有过多液体，进行第二次吸痰。
- 每次灌洗后，让仔猪恢复至少3分钟，以减少应激和不耐受风险。
- 一旦SpO₂恢复至预设阈值，即开始下一轮灌洗。2 恢复至100%。如果SpO2 未恢复至100%，需检查PaO₂2通过 血气分析一次 SpO₂2 已稳定
- 如果PaO₂2 >100 mmHg——重复肺灌洗（步骤7.1.2–7.1.6）。
- 如果PaO₂2 <100 mmHg——保持灌洗通气设置15分钟，然后重复血气分析。
- 如果PaO₂2 >100 mmHg——继续灌洗，并进入步骤 7.1.6 重新评估损伤范围。
- 确认表面活性物质耗竭损伤已达成，当 PaO₂2 残留物 <100 mmHg 下持续 15 分钟。停止灌洗，进入下一步操作。
- 开始肺灌洗前，打开吸引装置并确保其处于可用状态。将灌洗液收集桶放置到位。在动物头部下方及手术台下方放置吸水垫，以收集灌洗过程中漏出和回收的全部液体。
- 气管内灌注内毒素（时间：15 分钟）
- 制备脂多糖（LPS） 大肠杆菌 (1.5 mg/kg)，用生理盐水稀释至3 mL注射器中的总体积为2 mL。
注意：根据潜在的品系依赖性效应差异，选择适当的品系和剂量。 - 在最后一次肺灌洗后等待15分钟，然后将仔猪置于仰卧位，经气管内（IT）给予LPS。
- 通过以下步骤改善塌陷肺组织中脂多糖（LPS）的均匀分布：
- 将标准气管导管末端替换为Y型端口适配器，以实现通气与脂多糖给药同时进行 通过 通过带阀门的侧端口插入导管。
- 施加10 cmH₂O的呼气末正压（PEEP）2O₂ 持续1分钟。调整PIP以维持潮气量（VT）为7 mL/kg，并将呼吸频率（RR）设定为40次/分钟。
- 通过侧孔将导管插入气管导管（ETT），至预先测量的深度，使导管尖端超出ETT 1-2 mm。
- 通过导管注射LPS。随后用1 mL生理盐水冲洗导管，再注入9 mL空气栓，以确保完全输送。
- 移除导管并关闭侧端口。
- 继续以10 cmH₂O的呼气末正压（PEEP）进行通气2O（在给予LPS后3分钟内调整PIP以维持VT为7 mL/kg）。
- 断开呼吸机管路与气管导管（ETT）连接，持续30秒，以逆转肺组织可能发生的非预期性复张。
- 断开连接时，调整呼吸机参数至 FiO2 0.5，PEEP 6 cmH₂O2O，调整PIP以维持潮气量为7 mL/kg，并将呼吸频率增加至40–60次/分钟，以达到目标PaCO₂水平2 35-45 mmHg。
- 当潮气量稳定在7 mL/kg时，记录 0小时时间点 生理指标测量并完成病例报告表（CRF）。根据 PaCO₂ 调整呼吸频率（RR）2 来自血气分析。
- 制备脂多糖（LPS） 大肠杆菌 (1.5 mg/kg)，用生理盐水稀释至3 mL注射器中的总体积为2 mL。
8. 观察期间的通气（时间：约6小时）
- 切换至容量控制通气模式，FiO2 设为 0.5，PEEP 设为 6 cmH2O。根据需要调整 PIP，以维持潮气量（VT）在 7 mL/kg（无需设定 PIP 上限）。调整呼吸频率（RR），最高可达 60 次/分钟，以维持正常的动脉血二氧化碳分压（PaCO2）。
- 在实验剩余时间内，每小时通过血气分析指导呼吸频率的调整。持续调整 PIP 以维持潮气量（VT）在 7 mL/kg。
- 在整个 6 小时观察期内，对对照组和多因素损伤组动物均采用相同的通气参数（见图 1）。
9. 治疗步骤 - 可选（时间：约10-20分钟）
- 对于潜在的干预研究，给予治疗剂 通过 一种具有临床相关性的给药途径，如气管内（IT）、静脉内（IV）、皮下、肌肉或鼻内给药。根据实验设计选择治疗时机。若不给予治疗，则跳至第10步。以下提供气管内给药的示例：
- 将仔猪置于右侧卧位。
- 维持 PEEP 为 6 cmH₂O2O. 调整气道峰压（PIP）以达到 7 mL/kg 的潮气量（VT）。
- 将导管插入带瓣膜的侧端口至预定长度（如步骤7.2.3.3所述）。注入预定干预剂量或体积的一半，随后推注1 mL生理盐水（NS）和9 mL空气。总注入体积应限制在2.5 mL/kg以内，以尽量降低推注后发生通气阻塞的风险。
- 用盖子密封带阀门的侧端口，以防止通气泄漏。
- 将仔猪重新置于左侧卧位，并重复步骤9.1.3–9.1.4。
- 将仔猪恢复至仰卧位。调整吸气峰压（PIP），以维持潮气量（VT）在7 mL/kg。
- 按照步骤8所述继续通气。
10. 安乐死及实验终止
- 在观察期通气6小时后，进行最终的生理记录和样本采集（步骤8）。
- 通过静脉注射戊巴比妥钠（120 mg/kg，240 mg/mL）进行快速推注，实施动物安乐死（遵循机构批准的方案）。
- 通过确认生命体征消失（心跳、血压和呼吸）来确保动物死亡。使用听诊器听诊心率和呼吸音的缺失，以确认死亡。进一步通过心脏和肺组织的终末组织取样来确认死亡。
- 采集组织样本和体液，用于后续的生化、分子和/或组织学分析14,17，以备将来实验使用。
- 保存监护设备和呼吸机中的所有数据，确保备份文件已上传至本地驱动器和共享驱动器，并关闭所有设备。
- 按照当地政策处理所有锐器/生物危害性材料。
- 使用首选的消毒剂清洁所有表面。
- 清洗所有器械，并过夜晾干。
结果
该模型的终点指标符合美国胸科学会（American Thoracic Society）关于急性肺损伤（ALI）的标准（满足以下4项中的至少3项），包括生理学、组织学、炎症反应以及肺泡-毛细血管屏障功能的改变16,17。根据具体研究需求，各研究团队在采用该模型时可酌情增加其他终点指标。中度肺损伤定义为动脉血氧分压与吸入氧浓度比值（PaO2/FiO2，又称P/F比值）< 200 mmHg，重度肺损伤为< 100 mmHg17。氧合指数（OI）按以下公式计算：OI =（平均气道压（mAWP）× %O2）/PaO2，OI值在8–16之间被归类为中度损伤28。与对照组动物相比，多因素打击模型动物表现出中至重度肺损伤，表现为氧合指数受损、P/F比值降低以及呼吸系统顺应性下降（图2）。采用五项指标组织学评分系统评估，可见明显的组织学损伤表现16,17（图3），包括肺泡腔和间质中性粒细胞浸润、气道内出现富含蛋白的碎片以及肺泡间隔增厚。支气管肺泡灌洗液（BALF）中中性粒细胞增多，同时肺组织内白细胞介素-6（IL-6）细胞因子水平升高，提示存在显著的炎症反应（图4）。
图1：新生仔猪急性肺损伤实验流程图。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：通过本方案中描述的多因素打击损伤模型，观察到中度至重度急性肺损伤（ALI）。（A,B）与对照组（蓝线）相比，本研究所建立的多因素打击模型（红线）表现出氧合指数升高（8–12之间）以及较低的PaO2/FiO2（P/F）比值，符合中度至重度肺损伤特征。（C）多因素打击动物模型的肺功能受损，表现为呼吸系统顺应性降低超过>50%。动物数量（N）：对照组（N = 5），多因素打击组（LPS血清型O55:B5，1.5 mg/kg）（N = 3）。所有数据以均值±标准差表示。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：多因素急性肺损伤模型表现出异质性的组织学损伤。（A,B）肉眼可见多因素损伤肺组织出现斑片状肺损伤，主要累及肺的后部中央区域。（C,D）苏木精-伊红（H&E）染色肺组织切片的代表性图像（100倍放大），显示多因素损伤肺组织中肺泡腔和间质内中性粒细胞浸润，并伴有肺泡壁和间隔增厚。（E,F）H&E染色肺组织切片的代表性图像（400倍放大），突出显示多因素损伤肺组织中肺泡结构完整性受损、中性粒细胞浸润以及肺泡腔内碎片沉积。蓝色方框表示（E,F）中放大区域。黑色标尺代表100 mm（C,D）和50 mm（E,F）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：多因素打击模型在急性肺损伤（ALI）后表现出炎症反应。（A）在诱导肺损伤（多因素打击）6小时后，支气管肺泡灌洗液（BALF）中中性粒细胞浸润显著，中性粒细胞占总细胞比例超过75%，高于对照组动物。（B）在诱导ALI后6小时，支气管肺泡灌洗液（BALF）中促炎细胞因子IL-6水平升高；（C）肺组织中的IL-6水平亦升高。由于分析时间点可用材料的限制，动物数量（N）有所差异。对于BALF（B）采用酶联免疫吸附测定法（ELISA），而对于肺组织（C）则采用多重激光微球技术进行检测。所有数值均以均值±标准差（SD）表示。请点击此处查看该图的放大版本。
补充文件1：新生仔猪急性肺损伤模型病例监测表。 请点击此处下载该文件
讨论
新生仔猪急性肺损伤模型是一种多因素打击模型，包括通过肺灌洗清除表面活性物质（模拟导致肺不张性损伤的呼吸窘迫综合征）、高浓度氧暴露（导致活性氧产生）、机械通气（压力/容量性损伤），以及经气管给予脂多糖（LPS）作为炎性刺激，从而模拟早产儿支气管肺发育不良（BPD）发病机制中涉及的多种因素2在表面活性物质耗竭过程中，有意提高压力和氧气浓度以促成损伤。暴露于FiO2为1.0的高氧环境约持续3小时，在诱导肺损伤阶段（表面活性物质耗竭灌洗和内毒素注入）期间，高压力作用时间约为90分钟。复苏期间吸入高浓度氧气（高FiO₂）2 0.9 与低 FiO₂2 0.3）的极早产婴儿中，氧化应激和炎症水平更高，且暴露于高氧环境的时间少于1小时29在仔猪模型中，表面活性物质耗竭后，肺部会塌陷并导致肺不张，维持肺泡开放的能力下降，从而影响适当的通气和氧合。因此，即使在观察期降低了呼吸机参数设置，由于表面活性物质的清除，仍需要更高的压力才能达到7 mL/kg的潮气量。随着时间推移，肺部可逐渐重新产生表面活性物质，持续发生的损伤过程可能随之减轻。然而，这种新型的新生仔猪急性肺损伤（ALI）模型显示恢复程度有限图2肺功能（顺应性）和氧合（PF比值）在诱导肺损伤后6小时观察期内的变化。该模型 closely 模拟了极早产儿出生后最常面临的初始状况，因此对转化研究具有高度相关性。该模型可产生中度（100–200 mmHg）至重度（<100 mmHg）的急性肺损伤，由P/F比值定义28脂多糖（LPS）诱导的炎症效应在损伤后1至2小时达到峰值30该模型可作为支架供其他研究团队使用，通过调整观察时长或处理方式以适应其研究计划。
方案中的关键步骤
尽管高度重视可及性，这一大型动物模型仍然十分复杂，需要一支技术娴熟的团队通力协作才能完成实验。该实验方案中存在若干关键步骤，需格外谨慎。这些注意事项对于确保这一复杂实验体系的成功至关重要。
动物的运输
过早脱离母体对动物而言可能是一段极度应激的时期，可能导致其无法维持心血管稳定，并在运输过程中发生死亡风险。然而，本文所述的运输方案（见步骤3）可使动物保持非常平静的状态（部分个体甚至入睡），从而能够顺利开展全部实验。尽管难以就最长运输时间提出明确建议，但根据我们的经验，仔猪可舒适耐受约60分钟的运输过程。
通气优化
呼吸机需要设置为补偿管路顺应性，以确保将全部潮气量输送至肺部。这一点在表面活性物质耗竭期间尤为重要，因为如果潮气量损失到管路中，仔猪可能会出现血流动力学不稳定。研究人员需要确认所用的呼吸机能够为新生儿提供适当的潮气量输送。成人用呼吸机通常无法达到合适的新生儿潮气量。PIP用于维持呼气潮气量值（本方案中使用7 mL/kg，此前已有文献报道14,19,20,21,31,32，肺灌洗期间除外——见下节）。在给予LPS或任何经气管治疗时，标准化使用带单向侧端口的气管插管-接头适配器，可避免断开呼吸管路，从而维持气道压力。
术后标准化肺复张策略
在准备阶段和手术过程中，仔猪肺部可能发生肺不张。在给予肌肉松弛剂后，应实施一次"肺复张"操作，以确保肺部充分通气33。完成肺复张操作后，动脉血氧分压预期应超过400 mmHg，这是健康开放肺在正常高氧反应下的表现。若未达到该水平，研究人员需考虑是否因实验条件未优化导致肺复张不充分，或仔猪本身存在基础疾病（例如，若仔猪来源于可能存在未知暴露因素的农场）。本方案允许针对前一种情况重新执行一次肺复张操作，以确认是否可达目标值。若再次未能达到PaO₂为400 mmHg，则应考虑将该动物排除，因其可能存在的基础疾病会不恰当地影响实验结果。
充足的液体和代谢稳态至关重要
这将限制与脱水和代谢控制不良相关的重要的混杂因素影响。这些足月新生仔猪通常产自较大的窝仔数，因此并非所有个体都有均等的哺乳机会。因此，在用于实验前，它们可能已暴露于一定程度的产后脱水。提供每小时5-8 mL/kg的总液体摄入量足以维持良好的血管内血容量14,34。代谢控制的维持应确保血糖水平在4-5 mmol/L之间（此为新生仔猪正常的生理范围35,36）。高乳酸血症是反映氧输送不足的另一项指标，也可能在缺氧发生前提示血管内液体容量偏低。充分的液体治疗方案和充分水化的动物能够在肺泡表面活性物质耗竭灌洗过程中保持心血管稳定，并不会引发严重酸中毒。血红蛋白及其他生化参数的参考值因年龄和物种而异37,38。较低的血红蛋白水平可能影响氧合状态，因此需要优化并谨慎进行采血39,40。每次采血后均需以等体积的生理盐水（NS）进行补充。通过监测血液电解质、尿素和肌酐水平来评估液体治疗方案是否充分。
在肺灌洗过程中留出足够的恢复时间
肺灌洗过程中，每次灌洗之间必须留出至少3-5分钟的重要恢复窗口期，以确保充分的静脉回流，避免发生危险的肝脏充血41、肝出血及右心衰竭。该现象在实验队列中的少数动物中被观察到。恰当且主动的液体管理对于维持临床稳定性至关重要。通过为该仔猪模型重建一个小型重症监护环境，由一名临床医生、新生儿科医生或高级兽医技术人员来促进团队成员之间的知识转化，以识别重要情况并制定相应的应急预案，显得尤为关键。
推荐的故障排除方法
在整个手术和实验过程中，仔猪将处于全身麻醉和镇痛状态。实验全程需由专人负责监测仔猪状况。每只动物对麻醉药物的敏感性和反应均存在个体差异。在麻醉诱导后立即进行生命体征监测以及每小时一次的血气分析至关重要，这不仅可评估麻醉深度和代谢稳定性，还可根据需要进行必要的体格评估。达到表面活性物质耗竭所需的肺灌洗次数（6至20次）及相应时间（28至115分钟）存在差异。
麻醉诱导、稳定及手术过程中可能出现的问题及解决方案：（1）若发生呼吸暂停，必须关闭麻醉气体，并通过面罩加压通气支持呼吸，直至自主呼吸恢复；（2）若出现低血容量征象 通过 当出现心率增快、平均动脉压（MAP）降低或中心静脉压（CVP）降低时，应给予10 mL/kg的生理盐水快速输注，并考虑增加维持液的输注速率。（3）当低血压伴MAP下降至30–40 mmHg，且液体快速输注后未见改善时，必须减慢或停止麻醉泵入，并在10–15分钟后重新评估灌注状态和低血压情况。应进行血气分析以检测血红蛋白水平，评估是否存在可能的内出血。（4）若呼吸系统症状提示气胸（急性血氧饱和度下降或心动过缓） >20%）时，立即对仔猪实施安乐死。
局限性
本模型代表了一种在大型动物模型中建立的短期（6小时）新生儿急性肺损伤（ALI）。导致支气管肺发育不良（BPD）的损伤慢性过程是需要考虑的重要因素。该模型可能无法完全模拟疾病发生机制中的这一方面，且关于肺损伤在6小时之后进展的数据仍不明确。尽管如此，该模型的一致性为其进一步优化（如延长观察时间或修改实验方案）提供了坚实基础，具有较高的可拓展性，便于各研究团队根据需求加以应用。尽管在设计该大型动物模型时已着重考虑其可及性与可行性，但实验的顺利实施仍需具备特定的技术能力，包括临床专业知识、扎实的生理学基础，以及应对快速病情变化或恶化的能力。 通过 药物/输注等操作在早期阶段的实施和顺利完成过程中是必需的。掌握这一系列技能后，可将其传授给团队成员，以确保模型在后续时间内的持续维护。此外，由已建立良好沟通与协作关系的兽医技术人员、实验室技术人员以及高年级研究生组成的团队，能够确保实验各个组成部分得到妥善覆盖。在工作流程得到优化的情况下，预计至少需要三名团队成员共同参与，才能完成从开始到结束的整个实验过程。
意义及其潜在应用
临床转化依赖于临床前阶段扎实的基础研究。然而，许多临床试验因临床前模型与人体生理之间的不匹配而失败，这凸显了使用与人类密切相关的大型动物模型以增强转化潜力的重要性。建立一种新的新生仔猪肺损伤模型，对于更好地理解早期致病事件、促进早产儿肺部支气管肺发育不良（BPD）的发生发展具有关键意义。本研究所提出的模型高度模拟了早产儿出生后最初几天在重症监护环境下的多种关键因素（高氧暴露、高压力通气以及表面活性物质缺乏）。这一新型的多因素新生仔猪模型将为深入理解BPD早期致病机制提供宝贵见解，推动治疗候选药物的研究，并优化其治疗递送策略，从而促进有效的临床转化。该模型将成为开展合作研究的理想载体，为从安全性到有效性等各类概念验证研究提供假设检验框架，并促进新知识的产生。作为未来临床试验的基础，该模型将显著推动针对早产儿急性肺损伤的临床转化研究进展。
披露
其余所有作者均无竞争利益需要声明。
致谢
我们感谢多伦多病童医院的 Martin Post 博士，他慷慨地借给我们一台新生儿呼吸机，该设备在本项目中一直使用。我们还要感谢渥太华大学心脏研究所动物护理与兽医服务部门的 Dan DeVette 及其团队，在本模型开发过程中提供的所有协助。本工作得到了 CHEO CHAMO 创新基金、干细胞网络、Princess Lovisa 协会 [HKH Kronprinsessan Lovisas förening]、David 和 Astrid Hagelén 基金会以及瑞典心脏肺脏基金会的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #10 手术刀片 | 皮肤切口 | ||
| 1 ml 注射器 | BectonDickson | BD309659 | 滑动接头 |
| 10 ml 注射器 | BectonDickson | BD302995 | 用于动脉和静脉通路的冲洗注射器 |
| 18 G 留置针 | Insyte | 膀胱插管 | |
| 20 ml 注射器 | BectonDickson | BD302830 | 必要时用于液体推注 |
| 22 G 皮下注射针头 | BectonDickson | 用于填充注射器 | |
| 24 G 留置针 | Insyte | 160465 | 耳缘静脉、股动脉和股静脉通路 |
| 25 G 皮下注射针头 | BectonDickson | 肌内（IM）注射布托啡诺 | |
| 3 ml 注射器 | BectonDickson | 用于药物注射及清除监测导管死腔 | |
| 3-0 丝线结扎线 | Ethicon | A304H | 用于固定动脉和静脉导管 |
| 四通接头 | Discofix, Braun | D500456020 | 连接至输液和监测管路，用于冲洗和取样 |
| 6" 延长管 | SAI Infusion Technologies | Ext-6 | 连接至静脉/动脉通路 |
| 60" 延长管 | BBV6223 | 用于药物输注管路 | |
| AirLife Neo-Verso Y 型气道连接器（用于气管插管） | Vyaire | CSC300 | 用于经气管给药 |
| 布托啡诺，0.3 mg/mL | CDMV | 128140 | 作为镇痛药进行肌内推注 |
| 葡萄糖，5% | Baxter | JB0063 | 维持血糖水平 |
| 一次性手术巾 | 3M | 3M1050 | 无菌手术区域覆盖巾 |
| 心电图电极 | 3M | 220790 | 一次性心电图电极 |
| 气管插管（ETT）给药导管 | |||
| 气管插管 3.5 | Teleflex | 5-10107 | 用于气管造口术 |
| 肾上腺素，1 mg/mL | Hospira | 07541L01 | 必要时用无菌生理盐水稀释至 0.1 mg/mL 用于复苏 |
| Epoc 血气分析仪 | Siemens | 10736398 | 配备 NXS 主机的 Epoc 血气分析系统 |
| Epoc 样本卡 | Siemens | BD309659 | 血气检测盒 |
| 福尔马林，10% 缓冲液 | Fisher Scientific | SF100-4 | 肺组织固定 |
| 加热垫 | Kent Scientific | TPZ-814EA | 水循环毯 |
| 静脉（IV）输液泵 × 3 | Sigma Aldrich | Z401358 | 用于输注氯胺酮/丙泊酚和罗库溴铵 |
| 氯胺酮，10 mg/mL | Vetoquinol | 112170 | 持续输注（用无菌生理盐水稀释）通过注射泵维持麻醉 |
| 氯胺酮，100 mg/mL | Vetoquinol | 112170 | 用于全身麻醉诱导推注，以及通过注射泵维持麻醉 |
| 乳酸林格氏液 | Baxter | JB2323 | 维持血容量 |
| 灌洗设备：漏斗、三通接头、ETT 接头、4 英尺导管 | n/a | n/a | 自制灌洗导管 |
| 脂多糖 LPS（O55:B5），100 mg | Sigma-Aldrich | L2880-100mg | 二次打击肺损伤模型 |
| MR850 呼吸湿化器 | Fisher and Paykel | MR850JXX* | |
| 戊巴比妥钠（Euthanyl），240 mg/mL | Vetoquinol | 381 | 静脉推注用于人道安乐死 |
| 压力传感器 | McCarthy Veterinary Supplies | V6402 | 用于 Surgivet 系统的动脉/静脉压监测 |
| 丙泊酚，10 mg/mL | 用于全身麻醉诱导推注，以及通过注射泵维持麻醉 | ||
| 脉搏血氧仪 | Maismo | NEOPT-500 | |
| 罗库溴铵，10 mg/mL | Auropharma | 2498820 | 手术后及肺损伤诱导前使用，随后进行持续输注 |
| 生理盐水，0.9% | Baxter | JB1324 | 用于冲洗血路及血容量复苏 |
| 无菌水 | n/a | n/a | 用于呼吸机湿化器 |
| 吸引导管 10 CH/25 cm | Mediplast | 608810251 | 用于肺叶支气管肺泡灌洗 |
| 吸引导管 6 CH/40 cm | Mediplast | 60880640 | 灌洗过程中清除多余生理盐水 |
| 手术器械：手术刀柄、蚊式钳、持针钳、梅兹钳、缝合钉、手术剪、牵开器、纱布、不锈钢碗 | N/A | N/A | 已高压灭菌的手术包 |
| Surgivet：无创血压袖带、温度探头 、2× 有创血压、心电图、脉搏血氧仪 | McCarthy Veterinary Supplies | v9203 | 包含：无创血压袖带（NIBP）、体温计、2× 有创血压（BP）、心电图（ECG）和脉搏血氧仪 |
| 注射泵 × 3 | 麻醉泵 | ||
| 胶带 | 固定耳缘静脉通路 | ||
| 脐带夹线 | Ethicon | 用于固定气管内导管于气管内 | |
| 呼吸机（Servo-I） | Getinge | 需具备新生儿通气设置以实现合适的潮气量 | |
| 呼吸回路 | Fisher and Paykel | RT265 | 带湿化器 |
| Vorse 管路阻断钳 | n/a | n/a | 灌洗过程中阻断导管 |
参考文献
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