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方法文章

一种用于定量评估皮下脓肿中手术植入物上生物膜形成的独特小鼠模型

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DOI：

10.3791/68067

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2025年6月6日

 ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Orthopaedic Trauma Institute (OTI), University of California, San Francisco (UCSF), 2Rosies Base, LLC, 3Department of Neurological Surgery, Weill Institute for Neurosciences, Brain and Spinal Injury Center (BASIC), University of California, San Francisco (UCSF)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种独特的植入物相关感染实验模型，可在单只小鼠体内于相同条件下同时孵育两个植入物与细菌。该模型还可利用优化的比较分析方法，精确评估植入物表面的生物膜形成情况，展示了评价生物材料抗菌性能的先进实验技术。

摘要

为了开发具有抗菌性能的新型生物材料用于骨科手术，建立一种能够紧密模拟病理状态的植入物相关感染实验动物模型至关重要。此外，还需通过与对照样本的定量比较，评估材料表面生物膜的形成情况。然而，目前的动物模型通常为每只动物仅植入一种材料，由于个体间感染状态存在异质性，可能导致实验结果不一致。同时，准确量化材料表面生物膜的形成也面临挑战。 体内 仍然具有挑战性，且研究结果可能缺乏可靠性。为解决这些问题，本研究展示了一种独特的与植入物相关感染的小鼠模型，可在单只小鼠体内封闭环境中同时孵育两个植入物与细菌，形成包裹性皮下脓肿。首先在背部皮肤下构建一个成熟的气囊，随后将两根不锈钢丝连接并置入气囊内，接着接种细菌 Xen 36，一种生物发光菌株的 金黄色葡萄球菌接种后14天，导线周围已形成皮下脓肿。采用优化方法将生物膜从每根导线表面彻底清除，并对溶解后的细菌悬液进行精确测定，以评估植入物上的生物膜形成情况、测定菌落形成单位，并进行定量聚合酶链式反应分析。通过利用 lux 生物发光细菌操纵子的相对表达水平 luxA 并使用16S rRNA测定每根导线上生物膜内的细菌载量。这种经过优化的比较分析方法可在单个小鼠模型内、在一致的感染条件下精确评估两根导线上生物膜的形成情况，有助于推动具有抗菌性能的生物材料的研发。

引言

与植入物相关的感染在临床实践中仍然是一个重大挑战，因为在骨科手术中，尽管手术技术和植入物设计不断进步，这类感染仍可能导致较高的发病率和死亡率1。尽管由于手术室环境中无菌控制的现代标准以及围手术期抗生素预防的适当方案，与手术植入物相关的感染发生率已显著降低，但初次手术中植入物相关感染的发生率仍为2%–5%2。

植入物相关感染的主要潜在机制是在植入物表面形成生物膜，这种生物膜可保护微生物免受抗生素和免疫系统的攻击，从而使感染难以根除3,4。由于细菌在植入物表面的黏附是生物膜形成的初始阶段的关键步骤，因此减少细菌黏附及其后续的生物膜形成是降低植入物相关感染风险的重要策略。尽管多种植入物技术已具备抗菌性能，但由于细胞毒性、过敏等不良事件，其在临床上尚未得到广泛应用5,6,7,8。因此，临床上仍迫切需要兼具安全性、有效性、稳定性和耐久性的抗菌植入物，以降低植入物相关感染的风险。具有抗菌性能的植入物的研发有望推动外科技术进步，从而解决上述问题。

使用小型动物模型评估各种生物材料的抗菌性能，在推进至大型动物模型和临床试验之前至关重要9大量研究表明，使用含有生物发光基因的细菌建立适用于植入物相关感染的鼠类模型是可行的 luxABCDE 操纵子10,11,12,13,14,15尽管这些模型能够加速抗菌植入物或相关技术的研发，但仍存在某些局限性。首先，通常需要高级的专业技术和专用设备（如X射线或专用成像系统），才能直接且准确地评估小鼠模型中植入物上的细菌负荷。其次，虽然采集的植入物通常可在每只动物的单一感染部位评估一个独立的植入物，但个体之间的感染状况和免疫反应可能存在差异，从而可能导致比较评估结果的变异性。因此，在比较不同生物材料的抗菌效果时 在体内在统一条件下植入并接种细菌，更有利于解决这些问题。此外，必须优化现有方法，充分利用动物模型和所用细菌的特性，进行具有可重复性和准确性的定量评估。

本研究提出了一种新颖的实验方法 体内 可实现精确测量的植入物相关感染模型，通过比较个体间和个体内分析方法，在单个小鼠模型中评估两种植入物表面的生物膜形成情况。每个植入物上的生物膜可通过优化方法进行定量，包括生物膜的可视化、菌落形成单位（CFU）测定，以及对生物发光菌株进行定量聚合酶链式反应（qPCR）分析 金黄色葡萄球菌，Xen 36。先前的研究表明，一种新型金属植入物具有良好的应用前景 体内 对……的抗菌功效 金黄色葡萄球菌 采用这种综合方法16该方法可在标准实验室条件下轻松实施，有望加快抗菌生物材料的研发进程。

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方案

所有动物实验程序均经加州大学旧金山分校（UCSF）机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并在咨询并获得由UCSF环境健康与安全部门管理的UCSF生物安全危害项目批准后，于BSL2设施中进行。实验使用雄性和雌性C57BL/6小鼠（12-16周龄，25-50 g）。所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 细菌制备

  1. 使用生物发光的Staphylococcus aureus Xen36 (ATCC49525) 作为病原体。
    注意：该菌株购自美国模式培养物集存库（Manassas, VA），其独特地利用一个经过优化并整合到宿主天然质粒中的luxABCDE操纵子。Xen36 还携带与lux操纵子相连的卡那霉素抗性基因。
  2. 取少量冷冻甘油保存的Xen36菌种，接种于5 mL含有200 µg/mL卡那霉素的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中。
  3. 将培养物置于37 °C摇床培养箱（200 rpm）中过夜培养。
  4. 将Xen36划线接种至含200 µg/mL卡那霉素的TSB琼脂平板（含1.5%琼脂的TSB）上，并在37 °C过夜培养。
  5. 挑取Xen36单菌落，接种于5 mL含200 µg/mL卡那霉素的TSB培养基中，在37 °C摇床培养箱（200 rpm）中过夜培养。
  6. 测定培养物在630 nm处的吸光度。
  7. 根据630 nm处的吸光度值，稀释培养物，制备浓度为1.0 x 108 CFU/mL的 Xen36菌液。
    注意：在630 nm处（以TSB为空白对照）测得的吸光度值为0.5时，大约相当于Xen36菌液浓度为1.0 x 108 CFU/mL。
  8. 稀释培养物，制备浓度为1.0 x 105 CFU/mL的 Xen36菌液。

2. 连接式植入物的制备

  1. 使用两根由市售外科级不锈钢（SUS316L）制成的棒状金属丝，每根长度为 8 mm，直径为 0.5 mm。
  2. 将一根 20 µL 枪头截成约 3 mm 长，把两根金属丝分别插入其两端，实现垂直连接。
    注意：将垂直连接好的金属丝插入 18 G 针头的尖端（图 1）。确保金属丝被枪头牢固固定，防止脱落。
  3. 在将金属丝植入小鼠体内前，需对其进行高压灭菌处理。

3. 建立成熟的皮下囊袋

注意：在细菌接种前 7 天，按如下方法建立气囊：

  1. 用2%异氟烷麻醉小鼠（C57BL/6） 通过 吸入（遵循机构批准的方案）。
    注意：通过观察呼吸频率、肌张力、脚趾夹捏反应、角膜反射及黏膜颜色来评估麻醉的适当程度。麻醉期间使用眼用软膏涂抹眼睛，以防止角膜干燥。
  2. 将麻醉后的小鼠转移至手术台，并剃除小鼠背部颈胸部区域的毛发。
  3. 用70%乙醇和聚维酮碘擦拭并消毒整个区域。
  4. 用无菌空气填充一支10 mL注射器，并在出口处连接一根27 G针头。
  5. 轻轻捏起并提起小鼠颈部基部，以在皮下组织与筋膜之间形成间隙。
  6. 将针头插入小鼠肩胛骨之间的中线位置，皮下注射3 mL无菌空气以形成气囊。图2).
    注意：注射空气时，用另一只手按住背部两侧，确保空气扩散至背部中央，在中间形成一个囊袋。
  7. 将小鼠放回使用加热垫保温的笼子中，并密切监测，直至其从麻醉中恢复。
  8. 每2天注射3 mL无菌空气，操作流程与第1天相同，每次注射前均需进行麻醉和皮肤准备，以维持囊腔膨胀并促进成熟囊袋的形成。
    注意：每次充气前，需抽吸囊袋内的空气，以确认针尖位置正确。小心地将注射器从针头处取下，保持针尖留在囊袋内。用3 mL无菌空气重新充气囊袋。

4. 植入连接导线及细菌接种

  1. 首次空气注射后7天，按照步骤3.1所述方法对小鼠进行麻醉。
    注意：在手术过程中，需持续检查小鼠是否正常呼吸并维持麻醉状态。由经过训练的外科人员操作时，整个手术过程通常耗时10–15分钟。通过将输送2%异氟烷与氧气混合气体的导管置于小鼠鼻部附近来维持麻醉。
  2. 使用70%乙醇和聚维酮碘对整个手术区域进行擦拭消毒。
  3. 手术前皮下注射布比卡因。
  4. 在袋口顶部做一条3 mm的正中纵向切口。
  5. 将带有连接导线的18 G针头经切口插入袋内，并使用25 G脊髓针的内芯注射器推出导线（图3A，B）。
  6. 保持18 G针头尖端留在袋内，轻轻取出内芯，然后用注射器注入3 mL浓度为1.0 × 105 CFU/mL的Xen36菌液（图3C，D）。
  7. 小心取出所有针头，使用伤口夹关闭皮肤，并用外用皮肤粘合剂密封（图3E，F）。
  8. 确认无渗漏后，将小鼠放回铺有加热垫的独立笼具中，并按之前方法进行监测。
    注意：在14天的脓肿形成期间，每天监测小鼠是否有不适表现，包括抓挠注射部位、皮肤发红、食欲下降或活动减少。大多数情况下，除接种后最初几天外，未观察到明显的异常行为变化。若小鼠出现持续性痛苦迹象，如显著活动减少或持续颤抖且未见改善，则实施人道安乐死，以避免不必要的痛苦。

5. 从皮下脓肿中取出植入物

  1. 安乐死后 通过 异氟烷过量处死小鼠，剃除其背部颈区、胸区和腰区的毛发，并用70%乙醇和聚维酮碘对整个区域进行擦拭消毒图4A).
    注意：安乐死操作严格遵循美国兽医协会（AVMA）《动物安乐死指南》进行。死亡通过呼吸和心跳消失以及黏膜苍白来确认。
  2. 在腰部区域做一条2 cm的正中切口，并使用剪刀仔细剥离皮下组织。
  3. 延长切口并向上游延伸皮下分离，分离围绕脓肿的粘连组织（图4B - D).
  4. 切除整个皮下脓肿图4E).
  5. 切开脓肿，并小心地从脓肿内部取出导线（图4F).

6. 植入物表面形成生物膜的定量分析

  1. 结晶紫染色法
    1. 将从脓肿中取出的导线放入含有1 mL去离子水（DI水）的24孔板的各个孔中。
    2. 将导线转移至含有1 mL去离子水的新孔中，以去除导线表面松散附着的细菌。
    3. 用100%乙醇将生物膜固定在金属丝上1分钟，然后使其干燥。
    4. 将导线转移至含有1 mL 0.1%结晶紫试剂的新孔中。
    5. 染色15分钟后，用去离子水轻轻冲洗导线两次，以去除多余的染料。
    6. 将植入物放入含有250 µL 33%乙酸的1.5 mL微量离心管中，孵育15 min；溶解附着在植入物生物膜上的结晶紫，随后涡旋振荡1 min。
    7. 将200 µL悬浮液转移至96孔板中，在OD处测定吸光度630 nm 使用微孔板读板仪进行检测。所有测量均设三个重复。
  2. 菌落形成单位（CFU）计数
    1. 按照步骤6.1.2所述，去除导线表面松散附着的细菌。
    2. 将植入物放入含有200 µL 10倍胰蛋白酶的1.5 mL微量离心管中，于37 °C孵育1小时。
    3. 涡旋1分钟，然后在100 W条件下于水浴中超声5分钟，随后再次涡旋30秒，以使生物膜脱离并悬浮于溶液中。
    4. 将10 µL梯度稀释后的悬液接种至含200 µg/mL卡那霉素的TSB琼脂平板（含1.5%琼脂的TSB）上。
      注意：每种溶液均需进行三次重复实验。
    5. 在37 °C下孵育平板24小时后，计数平板上的菌落，并根据平均菌落数计算原始培养物中的细菌细胞数量17.
      注意：为确保彻底清除导线上的所有细菌（这对准确测量至关重要），需用结晶紫对导线进行染色，并在将悬液接种至平板后进行观察。在预实验中，上述机械与化学解离方法的联合使用已成功清除传统不锈钢导线表面的所有Xen36生物膜图5).
  3. 定量聚合酶链式反应（qPCR）分析
    1. 按照步骤6.1.2所述，去除导线表面松散附着的细菌。
    2. 将植入物放入含有600 µL TSB的1.5 mL微量离心管中。
    3. 使用无沉淀改良碱裂解法提取DNA16.
      注意：洗脱 DNA 的最终体积为 20 µL。
    4. 将DNA稀释1:10后于-20 °C保存。
    5. 进行qPCR检测 luxA 和 16S rRNA 基因16.
      注意：所有qPCR反应均设三个重复。每个反应体系总体积为10 µL，包含3 µL DNA模板、5 µL SYBR Green、1 µL无核酸酶水和0.5 µL上下游引物。luxA基因引物序列为5'- GAGCATCATTTCACGGAGTTTG -3'和5'- ATAGCGGCAGTTCCTACATTC -3'。16S rRNA基因引物序列为5'- GTGGAGGGTCATTGGAAACT -3'和5'- CACTGGTGTTCCTCCATATCTC -3'。PCR扩增条件如下：94 °C预变性2 min；随后进行40个循环，每个循环为94 °C变性15 s、60 °C退火30 s、72 °C延伸30 s；最后72 °C延伸5 min。
    6. 将三个循环阈值（Ct）的均值代入标准曲线进行作图，该标准曲线使用从连续稀释的纯Xen36培养物中直接纯化的DNA生成，用于估算植入物上的细菌载量图6).

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结果

本研究评估了一种综合性方法的可靠性，该方法采用一种新型的小鼠植入物相关感染模型，并对植入物表面的生物膜形成进行了优化的定量评估，此前的研究中已使用过该模型16。通过两个相同的植入物来检测其表面形成的生物膜，旨在验证在单个小鼠模型的单一皮下空间内，两个植入物能否在一致的感染条件下同时孵育。小鼠接受皮下囊袋制备手术（图2），7天后将连接的不锈钢丝植入成熟的囊袋中，并接种Staphylococcus aureus Xen36（图3）。接种后第14天，囊袋内形成一个包裹性脓肿，大小约为长2 cm、宽1 cm，其中包含植入的连接钢丝（图4）。从脓肿中取出钢丝后，通过结晶紫染色、菌落形成单位（CFU）计数和qPCR分析对每根钢丝表面形成的生物膜进行评估。结晶紫染色结果显示，两根钢丝表面的生物膜形成情况一致，两者之间无明显差异（

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讨论

本研究通过利用一种新型小鼠模型及优化的分析技术，对多种植入物上的生物膜形成进行了精确的定量评估。为了确保在同一受试动物体内两个植入物在完全相同的感染条件下孵育，通过反复注射空气在单只小鼠体内构建了一个成熟的皮下囊腔。该模型提供了一个封闭且稳定的环境，使两个相连的植入物即使在小鼠活动时也能在完全相同的感染条件下共同孵育。接种Staphylococcus aureus后，形成一个孤立的包裹性皮下脓肿，长度约2 cm，完全包绕两根金属丝，其特征与临床植入物相关感染高度相似。从脓肿中取出两根金属丝后，采用机械和化学解离方法从每根金属丝表面去除生物膜。将获得的细菌悬液用于定量分析每根金属丝表面生物膜中的细菌载量。在两种金属丝组之间进行了多个金属丝的个体间与个体内比较分析，以实现定量评估。此外，由于置于同一只小鼠内的两根金属丝同时暴露于均一的感染环境，因此对其进行对比测量可实现更精确的评估。本研究采用qPCR分析，以16S rRNA基因和编码荧光素酶的lux操纵子的相对表达水平作为生物发光型Staphylococcus aureus的定量评估指标。在本研究中，使用两根相同金属丝时，在多只小鼠的不同金属丝组之间或单...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本研究部分由美国国家科学基金会产业/大学合作研究中心项目（编号 IIP-1916629）——骨骼肌肉系统创新中心、小松精机株式会社以及 Rosies Base, LLC 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸THOMAS SCIENTIFIC12-16-15-00
Agilent BioTek 800 TS 吸光度读板仪AgilentBT800TS
Air-Tite 无菌皮下注射针头，针规：18 GFISHER SCIENTIFIC14817151 (CS)
BD 脊髓穿刺针：25 GFISHER SCIENTIFIC22043805
台式恒温振荡培养箱FISHER SCIENTIFIC
Branson 超声波清洗仪，115 Vac，60 HzFISHER SCIENTIFIC2489500
Branson Ultrasonics 2510R-MTH（超声破碎仪）RPI-T48500-500.0
Centrifuge sorvall pico 离心机FISHER SCIENTIFIC
CFX96 实时光学模块 qPCR 系统BIO-RAD
紧凑型灭菌器，30 LTHOMAS SCIENTIFIC LLC22A00N096 (EA/1)
结晶紫，1% 溶液 SCI_EDFISHER SCIENTIFIC10114-58-6
Falcon 24 孔细胞培养板FISHER SCIENTIFIC877125
Falcon 96 孔细胞培养板FISHER SCIENTIFIC8771001
Fisherbrand 数字涡旋混合器FISHER SCIENTIFICS
卡那霉素THOMAS SCIENTIFIC LLC 15160054
甘露醇盐琼脂 
FISHER SCIENTIFIC 
微生物培养箱Thermo Scientific51028063H
PBS，磷酸盐缓冲液
金黄色葡萄球菌 ATCC 49525 (Xen36)Perkin Elmer119243
SYBR Green I 核酸凝胶染料FISHER SCIENTIFIC
胰蛋白酶 10x (2.5%)FISHER SCIENTIFIC15090046
胰蛋白胨大豆肉汤 NETA SCIENTIFIC INC 
Zyppy 质粒小提试剂盒FISHER SCIENTIFIC501977785无沉淀改良碱裂解系统

参考文献

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