体内关节成像是一种有价值的技術，可用於揭示白細胞在發炎關節中的遷移行為以及分子動態。本文中，我們介紹了一種利用II型膠原誘導關節炎（CIA）小鼠模型進行體內關節成像的詳細實驗方案。
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本文内容
摘要
摘要
白细胞是由骨髓产生的血液细胞，必须迁移至组织中以介导炎症反应。因此，调控这种迁移过程成为开发减轻炎症的新型治疗策略的关键环节。传统的终点式研究无法让我们充分解析白细胞的迁移行为 体内然而，成像技术的最新进展为活体动物中免疫细胞迁移提供了前所未有的洞察，极大地加深了我们对免疫细胞迁移分子调控机制的理解。
在此，我们提供一个详细的方案 体内 使用小鼠 II 型胶原诱导性关节炎（CIA）模型进行关节成像。将小鼠用溶于完全弗氏佐剂的 II 型胶原进行免疫，通过临床评分和足爪厚度测量监测关节炎进展。在关节炎高峰期，对白细胞进行可视化观察 体内 使用共聚焦显微镜对表达荧光蛋白的转基因小鼠，或对经静脉注射荧光标记抗体及高分子量Dextran以标记血管的野生型小鼠进行成像。通过精细的手术暴露关节，应用琼脂糖并正确固定腿部，可实现稳定的长时间成像，通常可持续数小时。该方法可实现实时分析炎症关节内白细胞的停滞、爬行及跨内皮迁移过程。
本方案对于研究关节炎及其他炎症性疾病中白细胞迁移的研究团队具有重要价值。它也可作为靶向免疫细胞迁移的治疗策略进行临床前评估的平台。
引言
由于白细胞是来源于骨髓的血液细胞，必须进入组织才能引发炎症1。调控这一过程是开发新型抗炎治疗手段的关键环节2。通常情况下，白细胞迁移至炎症组织发生在毛细血管后微静脉中，并遵循黏附级联反应：首先，自由流动的白细胞被血管壁捕获；随后，白细胞沿血管壁顺血流方向滚动，继而在内皮细胞上发生黏附停滞，脱离黏附状态后，在血管表面向各个方向爬行，以寻找适宜的位点进行跨内皮迁移（TEM），最终进入组织内的特定区域1,3。
这些不同的步骤受到多种分子信号的共同调控，包括选择素（介导滚动）、整合素（介导停滞和爬行）以及趋化因子（CAs，介导停滞、可能参与爬行及跨内皮迁移）3趋化因子（CAs）通过七次跨膜的G蛋白偶联趋化因子受体（CARs）激活白细胞，并在黏附级联反应中发挥关键作用，包括上调整合素亲和力（导致细胞停滞）以及诱导跨内皮迁移（TEM）。然而，TEM的具体机制尚未完全阐明。传统的终点检测研究以及 体外 实验尚未揭示CA-CAR信号如何动态调控白细胞的迁移行为 体内.
成像技术的最新进展为活体动物中免疫细胞迁移提供了前所未有的观察视角，极大加深....
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方案
所有动物实验均经圣玛丽安娜医科大学机构动物护理和使用委员会批准（批准号：TG240926-2 和 TG250801-2），并依照机构及国家相关指南进行。
1. 关节炎小鼠模型的制备
注意：关节炎的动物模型为理解该疾病的发病机制以及开发新疗法提供了有价值的工具14。尽管多种小鼠关节炎模型各有其独特的优势与局限性，但II型胶原诱导性关节炎（CIA）模型已被广泛应用于类风湿关节炎（RA）发病机制的研究中14。在本节中，我们描述了CIA关节炎模型的实验方案（所需试剂与仪器见图1）。
- 将牛II型胶原蛋白用0.05 M乙酸稀释至终浓度为4 mg/mL，于4 °C下振荡过夜以制备稀释液。
- 为制备乳剂，将胶原蛋白稀释液（4 mg/mL溶于0.05 M乙酸）与完全弗氏佐剂（CFA）按1:1比例加入玻璃注射器中混合，所得乳剂中胶原蛋白终浓度为2 mg/mL。手动剧烈混合约20分钟。此过程会产生热量，因此需将装有乳剂的玻璃注射器置于冰上冷却。制备过程中可用烧杯检查乳剂的稠度。
注意：剩余的胶原蛋白稀释液应储存于-80 °C，可用于第二次免疫。 - 将乳剂转移至配备26 x 1/2 G....
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结果
在第0天和第21天，将8周龄的雄性DBA/1J小鼠用牛II型胶原蛋白与完全弗氏佐剂（CFA）按1:1比例配制的乳剂进行免疫。在第0至42天期间，每隔1-3天进行一次关节炎临床评分和足爪厚度测量。通常在第28天左右开始出现关节炎症状，关节炎临床评分和足爪厚度在第35天左右达到峰值（图5A-C）。DBA/1J小鼠在第35天时胶原诱导性关节炎（CIA）的发生率通常超过90-100%（图5A）15。
相比之下，在第0天和第21天，对8周龄雄性C57BL6小鼠以1:1的比例注射含有鸡II型胶原和完全弗氏佐剂（CFA）的乳剂进行免疫。C57BL6小鼠在胶原诱导性关节炎（CIA）中的发病时间和关节炎高峰期与DBA/1J小鼠相似15。然而，C57BL6小鼠在CIA中的发病率和关节炎临床评分显著低于DBA/1J小鼠
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讨论
体内关节成像与传统的终点研究不同，能够前所未有地揭示活体小鼠中动态的生物学过程。例如，该技术使我们能够理解四种不同的趋化因子受体——C5aR1、BLT1、CCR1 和 CXCR2——如何协同作用，启动中性粒细胞向关节炎炎症关节的募集10,11。此外，体内成像还揭示了C5aR2在将C5a从组织运输至血管腔过程中的一种新功能作用12。
然而，在使用该方法时需考虑若干关键步骤和局限性，具体如下。（i）手术挑战：手术操作可能引发白细胞（尤其是中性粒细胞）向关节内募集。此外，由于血管生成，关节炎关节易于发生出血。为尽量减少因组织损伤和出血造成的干扰，实施手术时需要大量练习并采用精细的操作技术。（ii）分析滚动白细胞的局限性：白细胞迁移级联反应通常包括四个步骤：（1）沿血管壁顺血流方向滚动，（2）在内皮细胞上停止，（3）爬行以寻找合适的迁移位点，以及（4）穿越内皮进入炎症组织（即跨内皮迁移，TE.......
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披露
Y.M. 收到了中生北控生物科技股份有限公司的资助/研究支持。
致谢
Y.M. 的研究工作由日本促进科学振兴会（JSPS）科研资助项目 [资助编号 JP22K08531、JP25K02574]、日本医疗研究开发机构（AMED）[资助编号 25bm1423033]、持田纪念医药研究基金会、JCR 前沿研究促进资助项目以及三菱基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 29 G × 1/2" | Terumo | SS-10M2913 | |
| 0.1 M 乙酸 | 富士胶片 | 016-18835 | |
| 1 mL 塑料注射器 | 顶部 | 19531 | |
| 1 mm 注射器（用于润滑脂） | Terumo | SS-01T | |
| 18 G × 1 1/2" | Terumo | NN-1838R | |
| 26 G × 1/2" | Terumo | NN-2613S | |
| 680-250 kDa 葡聚糖 | Biotium | 80135 | |
| 琼脂糖 | invitrogen | 16520-100 | |
| 牛II型胶原蛋白 | 胶原蛋白研究中心 | K42 | |
| 黏土 | 德比卡 | 93186 | |
| 完全弗氏佐剂’完全弗氏佐剂（CFA） | Chondrex | 7001 | |
| 共聚焦显微镜 | 尼康 | A1 | |
| 盖玻片 | Matsunami Glass IND.,Ltd | C024401 | |
| 数字滑动卡尺 | Mitsutoyo | 500-180-30 | |
| Falcon管（15 mL） | 康宁 | NA | |
| Falcon管（50 mL） | 康宁 | NA | |
| FITC标记的抗小鼠Ly6G抗体 | Biolegend | 127606 | |
| 镊子 | Roboz | RS-5070 | |
| 镊子 | NAPOX | MA-48-2 | |
| 玻璃注射器和连接器 | Tsubasa Industry Co., Ltd | S7P | |
| 润滑脂 | 东丽道康宁有机硅 | NA | |
| 理发剪 | Wahl | WA5109 | |
| 理发剪 | Wahl | 9966 | |
| 脱毛剂è我 | Kracie | N/A | |
| 美托咪定 | 明治 | N/A | |
| 显微剪刀 | Roboz | RS-5610 | |
| 显微剪刀 | Roboz | RS-5630 | |
| 咪达唑仑 | Sandoz | N/A | |
| 湿润纱布 | 日本制纸克雷西亚株式会社 | S-200 | |
| NIS-Elements 图像分析 6.20.00 | 尼康 | NA | |
| Falcon管中的PBS（50 mL） | 岛津诊断公司 | 5913 | |
| PE标记的抗小鼠CD4抗体 | Biolegend | 100408 | |
| 塑料板 | 康宁 | 351029 | |
| Prism 10.3.1 | GraphPad | NA | |
| 载玻片 | Muto Pure Chemicals Co.,Ltd | 5115 | |
| 手术显微镜 | Olympus | VMZ | |
| 组织粘合 | 3M | 1469SB | |
| Vetorphale | 明治 | N/A |
参考文献
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Miyabe, Y., Lian, J., Miyabe, C., Luster, A. D. Chemokines in rheumatic diseases: pathogenic role and therapeutic implications. Nat Rev Rheumatol. 15 (12), 731-746....
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