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方法文章

开发用于测试气化大麻馏分的临床前吸入模型

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DOI：

10.3791/68094

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2025年5月30日

 ,  ,  , 
1Meakins-Christie Laboratories, 2Translational Research in Respiratory Diseases Program at the Research Institute of the McGill University Health Centre, McGill University, 3Department of Pathology, McGill University, 4Department of Bioresource Engineering, McGill University, 5Department of Medicine, McGill University, 6Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University

本文内容

摘要

大麻提取物蒸气吸入 cartridge 是由电池驱动的装置，可将含有高浓度大麻素的提取物雾化成气溶胶。由于目前尚无针对此类产品的标准化临床前模型，研究其生理效应面临挑战。为填补这一空白，已开发出一种用于吸入大麻提取物蒸气的标准化临床前小鼠模型。

摘要

尽管大麻 vape 产品日益流行，但相关研究仍显不足。大麻 vape 烟弹通常与电池驱动的设备配合使用，将含有高浓度大麻素（如 THC）的大麻花提取物雾化成气溶胶。这类产品通常被称为大麻馏出物。由于此类产品效力较强，在临床前研究中确定有效剂量方案仍存在挑战。目前尚无建立完善且标准化的临床前模型，可用于模拟人类使用模式来评估这些产品的安全性和有效性。因此，与人体实际暴露水平相当的 in vivo 大麻馏出物暴露方案仍未明确。为填补这一空白，已开发出一种使用计算机控制递送系统的标准化临床前小鼠模型，用于吸入雾化大麻馏出物。本方案详细描述了通过仅鼻暴露塔，按照标准化吸气模式向小鼠递送大麻 vape 馏出物的操作流程。同时提供了暴露后小鼠行为学结果的监测方法，以及利用半定量 ELISA 确认 THC 进入体循环的技术。该方案将有助于研究人员采用贴近真实世界的递送方式，探究大麻 vape 馏出物产品对肺部及全身的影响，从而为严格的安全性与治疗效果评估提供可能。

引言

随着全球范围内大麻合法化的推进，大麻的使用率正在上升。零售大麻市场的显著变化不仅提高了大麻的可及性，还推动了新型大麻消费产品的研发与生产1。其中，通过加热而非燃烧大麻产品的方式进行使用的电子烟设备正成为一种日益流行的消费方式2,3。这类电子烟设备包括使用电子烟技术加热并雾化大麻馏出物的大麻 vape 笔 cartridges。这些馏出物是从Cannabis sativa 花朵中提取而成，形成一种富含大麻素的粘稠液体，例如含有高浓度的Δ9-四氢大麻酚（THC），即大麻的主要精神活性成分4。此类设备使用简便且易于隐藏，对初次使用者具有较强吸引力5。在2018年将大麻娱乐性使用合法化的加拿大，调查数据显示，公众对吸食大麻电子烟的社会可接受度认知有所提高，同时大麻 vape 笔/ cartridge 的使用率也显著上升6。

大麻使用者可能认为，与吸食干花形式的大麻（如卷烟）相比，吸入大麻馏出物的气溶胶更为安全，这推动了其日益流行2。尽管使用大麻电子烟馏出物可能减少吸入燃烧产物的暴露，但这些产品并非无风险。一个令人关注的问题是商业电子烟弹中含有高剂量的大麻素。干大麻花的四氢大麻酚（THC）含量最高可达36%，而大麻馏出物烟弹中的THC浓度可高达96%7。大麻馏出物烟弹产生的气溶胶中THC浓度约为大麻烟雾的两倍8,9。目前尚不清楚如此高的THC浓度对呼吸道会产生何种影响。此外，THC的高浓度也为临床前小鼠研究中的有效剂量设定带来了挑战，因为过量THC暴露本身可能对小鼠产生不良影响10。因此，必须从最低暴露水平开始，逐步增加剂量，直至达到生理相关剂量，以确保这些暴露条件具有实际意义。

迄今为止，尚无研究探讨吸入式大麻蒸气馏出物的潜在影响。部分原因在于缺乏现有的标准化临床前模型。在这些产品仍属非法的地区，研究面临更多挑战，导致研究人员不得不自行制备馏出物，而这些自制产品可能无法准确反映市售产品的实际情况11。此外，市面上产品种类繁多，进一步增加了标准化的难度。为弥补这一空白，本研究采用加拿大消费者可合法获取的市售产品开展。所选产品及装置均为安大略大麻商店销量领先的商品。本实验方案的目标是建立一种简便易行的小鼠暴露方案，使其摄入的THC剂量与人体生理相关水平相当，从而为研究人员进一步开展关于蒸气化大麻馏出物对呼吸系统及全身影响的研究奠定基础。

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方案

以下实验步骤已获得麦吉尔大学机构动物护理委员会（协议编号 8087）批准，符合加拿大动物护理委员会（CCAC）的指导方针。

1. 仪器设备准备

注意：以下方案适用于由 flexiWare 8 软件支持的 SCIREQ inExpose 系统。

  1. 确保系统所有组件正确组装，以符合图1A所示示例。确保有一根封闭的管路插入吹气泵的缓冲室中，以防止系统泄漏，如图1B所示。
  2. 开启系统并 启动软件。选择实验会话模块。
  3. 选择新建研究，并定义待研究的实验组和受试对象。选择与所需暴露方案相对应的实验模板。
  4. 在会话属性窗口中，填写操作员部分，以追踪设备使用情况。
  5. 进行校准前，选择目标通道，并按照操作软件中描述的步骤执行。
  6. （关键步骤）进行系统流量测试时，选择目标泵，并按照操作软件中描述的步骤执行。确认系统气流方向指向转子流量计。该校准用于确保系统无泄漏。若系统未通过流量测试，需清洁组件和管路后重新尝试测试。
  7. 除非已准备好开始实验，否则取消启动数据记录的提示。

2. 呼出气溶胶谱图的构建

  1. 创建一个 2 L/min 的偏置气流剖面，以确保实验过程中受试者得到充分通气。具体操作方法请参考制造商提供的外部文档《技术说明 037：创建剖面指南》 。
  2. 为电子烟剖面创建一次吸气脉冲。具体操作请参考技术说明 037。在本方案中，对该技术说明进行了修改，以实现 78 mL 的吸气体积，每次吸气持续 2.4 秒，频率为每分钟 1、2 或 4 次吸气 ，如先前发表的研究所述12,13,14,15,16,17。

3. 动物准备

  1. 本实验方案使用10至12周龄、体重约20–30 g的雄性和雌性C57BL/6小鼠。将小鼠在系统中逐步适应3天。
    1. 适应过程开始时，先将小鼠放入软质固定装置中，随后以2 L/min的流速通入室内空气，持续时间应与实验暴露时间一致。适应时间可选择10 min、20 min或30 min，以匹配本文所述的实验暴露条件。这些步骤旨在尽量减少应激对目标结果的影响。
    2. 将动物放入软质固定装置时，完全拉回网状组件，手持整个固定装置置于动物前方，等待动物自行进入推杆组件内。
    3. 确认动物的鼻部可见于固定装置的推杆组件中后，在动物后方紧贴位置夹上长尾回形夹，以防止其从装置中移出。
      注意：较年轻或体型较小的动物在固定装置中活动能力较强，因此必须确认其鼻部始终位于推杆组件外部并清晰可见。
  2. 当实验涉及不同性别或基因型的小鼠时，建议使用不同颜色的长尾回形夹以区分动物。

4. 动物暴露

  1. 将六只固定好的动物放入暴露系统的鼻-only暴露塔中，并以2 L/min的流速启动偏置气流，通入室内空气，以确保足够的气流。
  2. 在屏幕右侧的任务面板中，右键单击E-cigarette Profile Created，然后选择Task Properties。
  3. 在“Puff Frequency”（抽吸频率）下，输入启动一次抽吸所需的频率。例如，设定为每分钟2次抽吸时，需输入30秒。点击OK，当软件提示确认此项更改时，再点击Yes 。若要将此抽吸方案保存以供将来使用，请在实验结束时按照提示将其保存为模板。
  4. 准备开始暴露时，双击已创建并修改好的E-Cigarette Profile。务必启动计时器，以记录暴露持续时间。
  5. 为评估随暴露时间延长的剂量效应，分别在1次抽吸/分钟的频率下进行10分钟、20分钟和30分钟的暴露。随后，为评估暴露强度增加的影响，保持暴露时间为10分钟，将抽吸频率依次提高至1次/分钟、2次/分钟和4次/分钟。
  6. 暴露结束后，在将动物放回笼具的同时，重新启动偏置气流。
  7. 为将动物从固定装置中取出，先取下长尾夹，然后将网状部分完全推回至推杆处，使动物可自行退出固定装置。若动物仍停留在固定装置内，可轻拉其尾巴，提示其可向后移动退出装置。

5. 低运动活性测试

  1. 暴露结束后立即转移动物至行为测试室，使用 ANY-Maze 软件进行旷场实验。为获取动物行为的基线记录，确保其仅暴露于偏置气流中。
  2. 确保房间光线充足，并尽量降低噪音水平，以避免对动物造成不必要的应激，从而影响其行为表现。
  3. 打开软件并选择 新建空白实验。在屏幕顶部的协议（Protocol）选项卡下，选择 添加项目，然后从下拉列表中点击 新建视频源，以添加实验所用的摄像头源。
  4. 在屏幕左侧菜单中，于跟踪（Tracking）部分下选择 装置，以定义放置动物的旷场区域。
  5. 在协议（Protocol）选项卡下，选择 矩形工具 绘制旷场区域，并将该区域的尺寸输入软件中。
  6. 在屏幕左侧菜单中，于跟踪（Tracking）部分下选择 动物颜色，以指定动物颜色相对于背景是较亮还是较暗。此信息有助于软件准确追踪动物的运动轨迹。
  7. 在左侧菜单中，于测试（Testing）部分下选择 阶段，以设定实验的测试时长。输入测试时长为 60 秒。
  8. 在实验（Experiment）选项卡下，定义实验处理条件及每种处理条件下的动物数量。
  9. 现在开始测试，点击 测试 选项卡。将动物放入旷场中，然后点击旷场录像上方的 绿色播放按钮 以启动测试。
  10. 测试完成后，在左侧菜单中，于分析与结果（Analysis and Results）部分下选择 结果、报告和数据，并选择 总移动距离，以将该信息包含在报告中。
  11. 为生成报告，点击 结果 选项卡，并以所需格式导出数据。

6. 血清样本的采集

  1. 暴露后30分钟，通过腹腔注射250 mg/kg的Avertin（2,2,2-三溴乙醇）对动物进行麻醉。为确保麻醉充分，使用钝头镊子夹捏脚趾间的皮肤以刺激足底退缩反射。当该反射完全消失时，表明动物已达到足够深的麻醉状态，可通过心脏穿刺放血法实施安乐死。选择30分钟时间点是为了在暴露后获得血清中THC-COOH的峰值浓度18。
  2. 通过心脏穿刺采集血液至采血管中，随后在10,000 × g 条件下离心10分钟，以分离血清。
  3. 使用血清样本按照制造商说明书及既往发表的方法进行THC法医学ELISA检测，以定量测定THC-COOH水平19。

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结果

最初的目标是确定一种暴露方案，能够将THC以生理上与人类相关的水平递送至血液中，以便与人类情况进行比较。因此，选择暴露参数的一个关键因素是采用能够模拟人类使用模式的特征20,21。雄性和雌性C57BL/6小鼠暴露于含有约85% THC的Pineapple Express Pax Era Pod，暴露时间分别为10分钟、20分钟和30分钟，频率为每分钟1次吸气，每次吸气体积为78 mL，持续时间为2.4秒。暴露结束后30分钟处死小鼠，以测定THC-COOH水平。THC-COOH是THC的次要代谢产物22。在小鼠中，血清THC在暴露后立即达到峰值，随后被CYP450酶羟基化生成11-OH-THC，后者迅速被氧化为THC-COOH23,24。THC-COOH随后在血清中积累，在暴露后约30分钟达到最...

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讨论

大麻蒸馏物电子烟产品含有高浓度的大麻素，包括本实验方案所用产品中高达85%的四氢大麻酚（THC）。由于目前大麻花的THC含量最高仅为36%7，在建立吸入暴露模型时，大麻蒸馏物电子烟产品的高 potency 带来了挑战。本研究的目的是确定一种暴露方案，能够在不引起因THC暴露过量所致不良反应的前提下，有效地向小鼠递送相关剂量的大麻素。

市面上可购买的大麻产品种类繁多，这使得不同研究之间的比较变得复杂；然而，选择四氢大麻酚（THC）含量相近的产品有助于提高实验的可重复性。尽管抽吸参数可适用于多种产品，但使用低效价产品可能需要延长暴露时间以确保可重复性，同时需验证实际递送至体内的系统剂量。此外，需要注意的是，本研究中同时暴露了六只小鼠。例如，以每分钟2次抽吸的频率进行10分钟暴露，该暴露量由六只小鼠共同分担，因此改变每次暴露所用小鼠的数量可能影响每只动物实际接收的剂量。在今后使用类似设备的研究中，明确报告每次暴露所用动物数量至关重要，因为这可能显著影响每只动物的实际有效剂量，进而影响研究的整体结果。此外，尽管已努力设计出可模拟人类使用模式的...

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披露

作者声明他们没有需要披露的与本工作相关的利益冲突。

致谢

本工作由加拿大卫生研究院（CIHR）项目资助 162273 支持。CJB 受魁北克健康研究基金会（FRQS）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,2,2-三溴乙醇Sigma-AldrichT48402-5GAvertin
inExposeSCIREQsales@scireq.comwww.scireq.com
Microtainer 血清分离管BD365967
Pax Era 电子烟笔PAX购自安大略大麻商店
菠萝爆炸味 Pax 烟弹Good Supply购自安大略大麻商店
SoftRestraintsSCIREQIX-XN1-SR-ALwww.scireq.com
THC 法医学 ELISA 检测试剂盒Neogen131019

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