本方案描述了一种改良的大鼠原位左肺移植技术，重点在于降低手术难度并提高存活率。
本文内容
摘要
摘要
大鼠左肺原位移植模型是肺移植研究中的重要工具。尽管肺移植手术较为复杂，但套管技术的引入显著降低了其操作难度。大多数外科医生经过培训后均可掌握该技术，但由于学习曲线较长且模型存活率较低，其应用受到一定限制。为解决这些问题，我们提出了一种可重复性高的改良技术，包括供体肺的获取、修整与植入。与以往方法相比，我们的改进主要集中在供体肺获取时的解剖操作、供体肺的修整以及供体肺的植入过程。这些改进简化了手术流程，降低了操作难度，并提高了实验的可重复性。此外，手术过程中的冷缺血时间和热缺血时间也得到缩短，进一步提升了移植成功率。本研究为大鼠肺移植模型提供了更高效、更可重复的技术基础，有助于推动未来肺移植领域的相关研究。
引言
肺移植目前是治疗终末期肺部疾病的唯一有效手段，近年来发展迅速。迄今为止，全球已完成超过10万例肺移植手术1，但肺移植术后5年和10年的生存率分别仅为54%和32%2。与其他实体器官移植相比，肺移植术后的生存率仍有待提高3。肺移植后出现的各种严重并发症是影响受者生存率的关键因素，包括原发性移植物功能障碍、急性排斥反应、慢性肺移植物功能障碍以及肺部感染4,5。大鼠肺移植模型是研究这些问题的有力工具，但其广泛应用受到技术难度的限制。尽管已有多个实验室报道了该手术方法，但该技术学习曲线陡峭，术后并发症发生率高，且存活率低，限制了其在科研人员中的普及。
本研究介绍了一种改进的原位肺移植技术，旨在克服上述挑战。该方法在现有方案的基础上进行了关键性优化，包括套管制备、肺门结构解剖、供体肺固定以及优化的吻合技术。这些改进使得手术可由单名外科医生在最少设备条件下完成，降低了吻合难度，缩短了冷缺血和热缺血时间，最终提高了模型的成功率。该技术旨在为肺移植领域的基础研究提供更可靠且可重复的实验支持。
方案
所有动物实验均已获得广州来安科技有限公司动物伦理委员会的批准（批准号：G2024129）。实验采用6至8周龄、体重250至300克的雄性Lewis大鼠。大鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下（光照强度：25勒克斯），可自由获取食物和水。
1. 准备套管（图1）
- 准备14 G和16 G静脉导管及刀片（图1A）。
- 使用无菌刀片将静脉导管修剪成带尾端的套管。将每个套管分为本体部分（2–3 mm长度）和尾端部分（2–3 mm长度）（图1B）。
- 在套管本体表面制造浅表划痕，以增加缝合固定的摩擦力。
注意：保留16 G套管用于肺动脉（PA）和肺静脉（PV）的吻合，预留14 G套管用于支气管（Br）的连接（图1C）。导管和刀片均为一次性无菌器械。切割导管所用的手术平台经紫外线照射灭菌30分钟，并用75%酒精擦拭三次。
2. 供体肺的获取（图2）
- 通过腹腔注射戊巴比妥钠（80 mg/kg）麻醉供体大鼠，并进行皮下注射 使用美洛昔康（5 mg/kg）作为术前镇痛药。将大鼠仰卧位固定于手术台上，头部抬高，尾部降低，并过度伸展颈部。
- 将舌头向外上方牵拉，然后在颈部前方放置手术灯作为局部光源，以清晰显露声门开口（图2A).
- 通过声门将14 G静脉导管插入气道。
- 将呼吸机设置为压力控制模式，输入体重参数，调节压力至15 cmH₂O2连接呼吸机。
- 检查胸廓起伏是否与呼吸机频率一致，以确保静脉导管未误入气道。
- 捏压大鼠脚趾以确认大鼠已进入深度麻醉状态。固定四肢和头部，用碘伏和75%酒精对胸腹部进行三次消毒。 用镊子提起腹部皮肤，用剪刀从腹部、胸部和颈部前方剪开皮肤。
- 沿中线切开，剪开腹壁，通过暴露的腹腔静脉以1,000 IU/kg剂量注射肝素，持续3分钟，以确保全身肝素化。
- 从胸骨中线切开膈肌并切开胸腔。用止血钳固定两侧胸壁。移除胸腺，充分暴露胸腔器官的解剖结构。
- 依次剪断上腔静脉、下腔静脉以及左、右心耳。使用20 mL注射器将冷生理盐水缓慢（约1分钟）注入肺动脉根部，进行低压灌注，直至供体肺完全变白图2B).
- 用止血钳夹住供体肺的支气管，提起支气管，剪断与供体肺相连的组织，取出供体心脏和肺 整块 并将其浸泡于预冷的生理盐水（图2C).
注意：在供体肺处于吸气状态时夹闭支气管（Br），可确保供体肺的肺泡不会塌陷。
3. 供体肺的修饰（图3）
- 将心肺组织块置于冰上，在显微镜下操作。用止血钳夹住气管，并用橡皮泥固定。
- 用湿润的无菌镜头纸覆盖左、右肺，尽可能分离左肺和右肺，充分暴露肺门的解剖结构。
- 在显微镜下用镊子分离肺动脉（PA）、支气管（Br）和肺静脉（PV），并用6-0外科缝线在靠近肺组织处结扎支气管（图3A-C）。
- 分别从16 G、14 G和16 G静脉留置针套管制成的套环中取出肺动脉（PA）、支气管（Br）和肺静脉（PV）。使用8-0外科缝线将血管和支气管管壁固定于套环上（图3D-F）。
- 将修整后的供体肺组织保存在生理盐水中，重新置于冰上，等待移植。
4. 供体肺移植（图4）
- 通过腹腔注射戊巴比妥（70 mg/kg）麻醉受体大鼠。在大鼠眼球上涂抹眼膏，并采用与步骤2.1-2.3相同的方法进行气管插管。
- 剃除受体左侧胸背部的毛发，将受体置于恒温手术台上，呈右侧卧位，用碘伏和75%酒精对手术区域消毒三次。切口前注射利多卡因作为局部麻醉。
注意：由于操作空间狭窄，且整个手术在无特殊病原体环境中进行，因此不对动物进行铺巾，但应尽可能用无菌纱布覆盖手术切口。 - 在心尖搏动最明显的部位（第四肋间）切开皮肤和胸壁，进入胸腔。
- 使用眼睑拉钩撑开胸腔。用湿润的棉签轻轻将左肺推向一侧，暴露下肺韧带，然后锐性切断该韧带。
- 用镊子夹住左肺并将其牵拉至胸腔外。用止血钳夹住肺门并固定于胸前切口处。使用橡皮泥作为手术辅助工具，进一步稳定受体侧的止血钳（图4A）。
- 清除左肺周围组织，解剖肺门，分离肺动脉（PA）、支气管（Br）和肺静脉（PV）。
- 使用血管夹夹闭PA、Br和PV的近端（图4B）。
- 使用8-0手术缝线预先结扎受体的PA、Br和PV，以便在供体肺移植时快速完成吻合（图4C）。
- 在夹闭的受体左肺上修整出一个平台，以利于供体肺的放置。在受体PA、Br和PV的远端分别做小切口（图4D）。
- 用肝素化生理盐水冲洗PA和PV，防止血栓形成（图4E）。
- 将供体肺从冰中取出，放置于受体左肺的平台上。用镊子提起切口一侧，依次将PA、Br和PV的套管插入受体相应结构并结扎（图4F，G）。
注意：吻合顺序应如下进行：先吻合PA，然后是Br，最后是PV。 - 打开微型止血夹，观察供体肺逐渐由白色变为红色。检查吻合口，确保无出血（图4H）。
- 切除受体的左肺，将供体肺放回胸腔（图4I，J）。
- 适当增加呼吸机压力，确保供体肺肺泡充分扩张。
注意：在压力控制通气模式下，压力不应超过25 cmH2O。术中应根据受体状况调整呼吸机参数。若受体出现喘息样呼吸，提示存在缺氧，应及时调整呼吸机参数。 - 用无菌棉球将胸腔擦干，然后逐层关闭切口（图4K）。
- 等待受体逐渐恢复自主呼吸后，撤除呼吸机并进行观察。当自主呼吸频率达到约每分钟100次时，拔除气管插管（图4L）。
注意：受体恢复自主呼吸后可考虑撤机的征象包括胡须活动、肢体活动以及呼吸机显示屏上出现不规则的呼吸曲线。 - 将受体单独饲养于笼中，自由摄食饮水，并维持环境温度在约22 °C。
- 连续3天对受体皮下注射美洛昔康（5 mg/kg），以缓解疼痛。
结果
我们记录了30只大鼠肺移植过程中每个步骤的操作时间。套管制备、供体肺获取、冷缺血和热缺血的时间如图所示。 表1采用我们改进的方法，在经过初步训练后，移植手术的成功率达到了100%。该技术可为肺移植术后并发症的后续研究提供支持。我们已应用此技术超过两年。下图展示了我们从套管制作开始的操作流程 (图1)供体肺提取 (图2C)供体肺修饰 (图3)，至供体肺植入 (图4) 手术结果的评估 (图5)移植后六个月，我们对受体进行了计算机断层扫描（CT）成像和病理学评估。CT成像结果显示，移植肺的通气情况良好，与假手术组（仅开胸但未进行肺移植）相似；在大体形态上未见显著差异 离体 假手术组与自体右侧肺移植组之间的肺组织在苏木精-伊红（HE）染色结果中均未发现明显病理改变。综上所述，本研究成功建立了大鼠左侧原位肺移植模型，该技术的成熟为构建肺移植后其他疾病模型奠定了基础。
图 1：套管制备。（A）不同尺寸的静脉留置针和套管切割刀片。（B）5 倍放大倍数下在显微镜下切割套管。比例尺 = 1 mm。（C）用于肺动脉（16 G）、肺静脉（16 G）和支气管（14 G）的套管。缩写：IV = 静脉注射；PA = 肺动脉；PV = 肺静脉；Br = 支气管。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：供体肺的获取。（A）供体气管插管。（B）供体肺灌注。（C）将灌注完毕的洁净供体肺置于冰上。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：供体肺的修整。（A）游离肺动脉（PA）。（B）游离并结扎支气管（Br）。（C）游离肺静脉（PV）。（D-F）依次将肺动脉（PA）、支气管（Br）和肺静脉（PV）固定于套管上。所有显微图像的放大倍数均为5倍。比例尺 = 1 mm。缩写：PA = pulmonary artery；PV = pulmonary vein；Br = bronchi。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：供体肺移植。（A）将受体固定在恒温手术台上；打开胸壁；将左肺牵开并固定于切口处。（B）游离并阻断肺门结构。（C）预先打好的手术结。（D）在肺动脉（PA）、支气管（Br）和肺静脉（PV）远端分别做小切口。（E）用肝素化生理盐水冲洗。（F,G）依次吻合肺动脉（PA）、支气管（Br）和肺静脉（PV）。（H）打开止血夹，恢复通气和血液循环。（I）切除受体的左肺。（J）将供体肺放回胸腔。（K）关闭胸腔。（L）等待受体苏醒。所有显微图像的放大倍数均为5倍。比例尺 = 1 mm。缩写：PA = pulmonary artery；PV = pulmonary vein；Br = bronchi。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：移植后评估。假手术组仅接受开胸手术而未进行移植。术后6个月对样本进行CT成像和病理学评估。移植组接受了同基因型移植，并在术后6个月进行CT成像和病理学评估。请点击此处查看该图的放大版本。
| 操作步骤 | 操作时间（分钟） |
| 套管准备 | 3.2±0.38 |
| 供体肺获取 | 9.85±0.60 |
| 冷缺血 | 29.96±2.77 |
| 热缺血 | 12.62±2.35 |
表1：各项操作步骤所需时间。袖套制备：制备三个袖套所需的总时间（包括肺动脉、肺静脉和支气管的袖套）；供体肺获取：从供体中取出肺脏所需的时间；冷缺血时间：供体肺置于冰上保存的持续时间；热缺血时间：从供体肺离开冰保存至再灌注之间的时间。缩写：PA = 肺动脉；PV = 肺静脉；Br = 支气管。
讨论
大鼠肺移植模型是肺移植基础研究领域常用的模型，能够很好地模拟人类肺移植的病理生理过程。大鼠还具有繁殖快、成本低的优点。Mizuta 等人6于1989年首次采用套管技术，大大降低了该模型的操作难度。然而，由于手术操作复杂，许多研究人员仍持观望态度。
在套管制备过程中，大多数研究人员制作的套管形状相似。Wu 等人7在套管中部制作了一个凹陷，以防止吻合过程中结滑脱，但他们需要两人协作完成吻合，这无疑会增加人力和材料成本。一些研究人员还对套管尾部进行了改良，使其更加光滑8，但在将套管植入受体前未去除尾部，这容易导致套管在受体中引起血管和气道扭曲或折叠。
关于袖套尺寸的选择，既往研究建议，当受体体重小于270 g时应使用18 G袖套，当受体体重大于270 g时应使用16 G袖套9。也有部分研究人员统一使用18 G袖套7,10。在供体肺的修整方面，Tian 等人8将供体肺置于自行设计的培养皿中，以固定肺血管和支气管（Br），从而便于将其固定在袖套上。然而，该方法需要特殊的血管夹，且在缩短供体肺冷缺血时间方面并无优势。在受体吻合过程中，近期有研究报道了一种摆动式吻合方法8。但该方法对器械和设备要求较高，初学者往往难以获得某些关键设备，并且在吻合过程中可能因张力过高而面临吻合时间延长甚至血管撕裂的风险。
一些研究者在吻合过程中首先进行肺静脉（PV）吻合。他们认为PV吻合是最困难的步骤。先完成PV吻合可确保供体肺有足够的活动空间。然而，由于PV比支气管（Br）和肺动脉（PA）更坚韧，这可能导致在吻合Br和PA时出现PV袖套脱落甚至静脉撕裂的风险10。一些研究者尝试通过采用右侧半卧位8,11或仰卧位来降低吻合过程中的张力。然而，垫高右侧胸部的方法会改变气管插管的角度，并增加气道压力7。上述研究者在袖套制作、供体肺修整及供体肺植入方面进行了创新。尽管该模型已被多位研究者改进，但尚未得到广泛推广和应用。
在本研究中，我们对套管制作、供体肺的修整以及供体肺的移植进行了改进，希望研究人员能够更快地掌握该模型。我们选用16 G静脉留置针套管作为肺动脉（PA）套管，因为16 G套管具有较好的韧性，易于与动脉吻合，且套管内部空间足够，可保证良好的血流。而18 G套管明显小于受体肺动脉的内径，不利于血流的顺畅通过；在吻合过程中，由于套管过小，与受体肺动脉管壁之间的摩擦力不足，增加了吻合难度，并容易导致套管滑脱。
关于Br和PV袖套尺寸的选择，大多数研究人员的观点相对一致。值得注意的是，为了尽量减少Br吻合口梗阻的发生，所选用的Br袖套应尽可能大。在袖套的处理方面，Hiroaki等人6在袖套表面制作了一些刻痕以增加摩擦力，也有研究人员使用无尾袖套12,13。在本研究中，我们采用带尾袖套，以便使用止血钳进行固定。在肺动脉（PA）、支气管（Br）和门静脉（PV）固定完毕后，将尾部剪除。该方法可节省在袖套上固定PA、Br和PV的时间，同时可避免吻合后袖套尾部在受体体内移动而损伤血管和供体肺组织。
在供体肺的修整过程中，复杂的解剖结构会延长供体肺的冷缺血时间。本研究中，将预先裁剪好的无菌镜头纸覆盖于供体肺的表面和底部，然后将供体肺置于无菌培养皿上并放置于冰上进行修整。覆盖在供体肺表面的无菌镜头纸用预冷的生理盐水轻微浸润。这种方法不仅可保持供体肺的湿润状态，防止镊子操作时损伤肺组织，还能在分离肺门结构时为调整左右肺的位置提供足够的摩擦力，从而充分暴露肺门解剖结构，并快速从供体肺背侧分离肺动脉（PA）、支气管（Br）和肺静脉（PV）。在以往的研究中，通常将纱布放置于供体肺表面7,10,14。但由于纱布中间存在较大间隙，在分离过程中供体肺容易被镊子损伤，最终导致气胸。本方法可快速游离PA、Br、PV及其他结构，显著缩短供体肺的冷缺血时间。
在供体肺移植阶段，将受体左肺固定于胸腔前部，更贴近受体的解剖结构。此举显著降低了供体肺与受体血管及支气管之间的吻合张力，从而降低了手术难度及术后并发症的风险。此外，胸腔后部空间相对较大，有利于手术器械的操作以及供体肺的植入。相比之下，以往大多数研究将受体左肺固定于背侧7,8,12，该方法在吻合过程中会产生更大的张力，增加手术难度和术后并发症风险。同时，胸腔前部操作空间有限，可能限制手术器械的灵活性。
最后，该方法需要对受体肺进行广泛牵拉，这可能会增加机械性损伤的风险。此外，我们在吻合前保留了受体的左肺，并在其上修剪出一个平台，这有助于供体肺的更好放置，并在吻合过程中方便调整其位置。在以往的研究中，受体肺残端在吻合前被完全切除，肺动脉（PA）、肺静脉（PV）和支气管（Br）通过器械夹闭固定15，这种方法容易导致血管撕裂。在吻合前，应使用肝素化生理盐水冲洗血管，以清除血栓，预防血栓栓塞并发症，这一点在许多先前的研究中已有报道7,10,16。然而，许多研究人员并未注意到，在吻合过程中容易引入气泡，从而导致空气栓塞。在我们的操作中，使用精细的棉签清除受体血管和供体袖套中的较大气泡，有效防止了空气栓塞的发生；较小的气泡可被机体自行吸收，不会引起明显问题。
在吻合手术过程中，首先处理肺动脉（PA），随后处理支气管（Br），最后完成肺静脉的吻合。这一顺序性操作策略的采用，主要基于肺动脉具有更优的弹性，可在后续静脉吻合过程中因张力过大而导致血管损伤或袖套移位的风险降至最低。若优先吻合肺静脉（PV）或支气管，则可能因张力相关并发症而增加血管或支气管撕裂以及袖套移位的风险。通过系统化的培训方案和反复练习，该优化的手术顺序已显示出显著优势，可有效降低技术难度并提高手术成功率。值得注意的是，本研究方法实现了100%的吻合成功率，优于已有同类研究报道的结果。在移植手术过程中，操作者仅需单手牵拉切口边缘，将供体袖套插入受体管腔，并以单手打结固定。该技术实现了单手完成固定与打结操作，显著减少了对手术人员数量的需求，并提升了手术效率。因此，本研究改进了大鼠左肺原位移植的方法，缩短了手术时间，降低了操作难度，并提高了该动物模型的可重复性。
披露
本工作得到以下基金支持：国家自然科学基金（项目编号：82470103）、吴阶平医学基金会特别研究项目（编号：320.6750.2025-01-1）、中国医学教育协会（项目编号：ZJWYH-2023-YIZHI-003）、呼吸疾病国家重点实验室临床流行病学研究项目（项目编号：SKLRD-L-202504）、广州市临床特色技术项目（项目编号：2023C-TS10）以及广州医科大学科研能力提升计划重大临床研究项目（项目编号：GMUCR2024-01007）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 生理盐水 | Hopebio | HBPP008-100 | |
| 10 cm 无菌培养皿 | Beckman | 10 cm 塑料培养皿 | |
| 16 G 气管插管导丝 | vega | - | |
| Dumont 精细镊子 #7-弯型/11.5 cm | F.S.T | 11271-30 | |
| 眼科剪 10 cm 直头锐利 | Jingzhong | Y00030 | |
| 止血钳（弯型全齿） | Jingzhong | J31180 | |
| 肝素钠溶液 | Leagene | R10119 | |
| Introcan 针 14 G 蝶形针 | B.Braun | 4254210B | |
| Introcan 针 16 G 蝶形针 | B.Braun | 4254171B | |
| LED 双光纤冷光源灯 | RWD | 76312 | |
| 镜头清洁纸 | Kimberly | 34155 | |
| Lewis 大鼠 | 广州东恩基因科技有限公司（中国广州） | ||
| 医用棉签 | Winner/Wenjian | 10 cm × 50 支 | |
| 医用持针器 | Chenghe | - | |
| 医用无菌注射器 | Winner/Wenjian | 20 ml | |
| 医用手术剪 12.5 cm 直头锐利 | Pulun | PL1251 | |
| 医用胶带 | Wenxian | 1527 | |
| 医用组织镊 | RWD | J30607 | |
| 医用钛制眼睑拉钩 | Youdikang | - | |
| 微型弯镊 | Jingzhong | JzCrWA3050 0.3/140 mm | |
| 微型血管止血钳 12.5 cm 弯型 | Jinzhong | W40350 | |
| 微型血管止血钳 12.5 cm 直型 | Jinzhong | W40340 | |
| Micro-CT | Pinseng | SNC-100 | |
| 微型血管夹 | F.S.T | 18055-06 | |
| 多通道小动物麻醉机 | RWD | R550 | |
| 神经外科凝固套装，凝固套装 | F.S.T | 18010-00 | |
| 戊巴比妥钠 | Sigma | P3761 | |
| 尖头棉签 | 其他 | 1000 支 | |
| 大鼠/小鼠插管平台 | Puxin | - | |
| 大鼠/小鼠术中水浴系统 10-65 °C 温控，310 × 290 mm，220 V | Huayang | 36-0041 | |
| 上海金钟医用显微镊 显微精细镊 直弯微型手外科器械 显微器械 | Jingzhong | WA1020 | |
| 上海浦东金环医用可吸收外科缝线 带针无菌缝线植入线（4-0） | 上海浦东金环 | 473445 | |
| 小动物呼吸机 | Kent Scientific | RoVent Jr | |
| 小动物水浴保温系统 | HUAYON | TG-TP-BL | |
| 弹簧剪（大号） | Jing Zhong | JzCrWA1020 | |
| 不锈钢医用蚊式止血钳 | Jiate | LZ1021 | |
| 钢制扁柄弯型无齿 0.3 齿 | Zhenbang (Medical) | 带钩/平台用于打结的有齿钳 | |
| 钢制扁柄直型无齿 0.3 齿 | Zhenbang (Medical) | 带钩/平台用于打结的有齿钳 | |
| 无菌棉球 | Boshengtianai | 小号 | |
| 无菌纱布 | Hisern | 6 cm × 8 cm | |
| 带针缝线 | Lingqiao | 8-0 | |
| 带针缝线 | Lingqiao | 6-0 | |
| 镊子 Dumont #5 镊子，直型 | F.S.T | 11254-20 | |
| 超轻黏土 | Bokee | CQNT-24 | |
| 血管夹持器 | RWD | R34001-14 |
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