本方案提供了针对基于DNA条形码成像的小鼠FFPE黑色素瘤组织，设计多重免疫荧光抗体组合的逐步操作指南。我们还描述了使用开源工具进行图像分析的流程，以获得关于小鼠黑色素瘤肿瘤免疫微环境的空间蛋白质组学见解。
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方法文章
基于DNA条形码的多重免疫荧光成像分析基因重编程小鼠黑色素瘤的福尔马林固定石蜡包埋样本
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种基于索引共检测（Co-Detection-by-indEXing）的新兴DNA条形码多重成像技术，用于分析组织微环境中的空间蛋白质组学。成功的成像依赖于设计良好且经过充分验证的抗体组合，但目前针对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本的可用抗体组合极为有限。相较于新鲜冷冻样本，FFPE样本具有多项优势，例如来源广泛、易于操作和储存，并可制备组织微阵列（TMA）。本文提供了一种实验方案，用于开发抗体组合，以对经纳米颗粒处理的黑色素瘤小鼠模型的FFPE组织进行可视化与分析；该纳米颗粒可递送编码免疫信号的质粒DNA，从而实现肿瘤微环境的重编程。此外，我们还描述了一个基于开源计算工具的图像分析流程，用于组织标注、细胞分割、蛋白质组数据处理、细胞群体表型鉴定以及空间参数的量化分析。该方案适用于小鼠FFPE样本中抗体组合的设计，并有助于深入理解复杂组织微环境中空间蛋白质组学的特征。
引言
皮肤黑色素瘤是最常见的皮肤癌，其发病率和死亡率在全球范围内因诊断时间和初级保健的不同而有所差异1。在过去十年中，对黑色素瘤生物学特性的深入理解推动了用于治疗实体瘤的新癌症模型的开发2。近年来免疫疗法的兴起，催生了一种基于激活内源性免疫系统的革命性癌症治疗理念3,4。
肿瘤微环境（TME）极为复杂，包含多种免疫细胞、癌症相关成纤维细胞、周细胞、内皮细胞以及各种组织驻留细胞5。过去已采用多种技术用于研究TME，例如流式细胞术和单细胞测序，但这些方法需破坏肿瘤组织，因而会丢失空间信息。传统的显微镜成像技术，如免疫荧光（IF）和免疫组织化学（IHC），可在不破坏样本组织的情况下实现蛋白质生物标志物的可视化。然而，这些方法通常仅限于检测两到三种生物标志物，无法全面揭示复杂TME内部的空间与结构关系6。
为了解决这一问题，已开发出多种多重成像技术，用于在空间上可视化复杂的肿瘤微环境（TME）7,8,
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方案
所有动物实验均依照约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会制定的指南进行，并使用批准的方案编号MO18M388和MO21M384。
1. 抗体选择
- 根据目标组织及特定生物标志物的丰度设计抗体组合。依据文献中免疫荧光（IF）和免疫组化（IHC）染色的成功应用记录选择抗体克隆。确保获取这些抗体的无载体形式。
注意：用于条形码偶联的抗体必须为不含载体的纯化抗体。避免使用任何基于蛋白质的防腐剂，如BSA、谷蛋白、甘油等。若无法获得无载体抗体，可向供应商定制抗体，或使用BSA去除试剂盒制备无载体抗体。叠氮化钠不会干扰抗体偶联。推荐使用IgG亚型而非IgM亚型。 - 利用传统的免疫荧光（IF）成像技术在目标组织上验证所选克隆11。采用双重IF成像确认某些克隆的特异性（例如，对FOXP3和CD4进行双重IF成像以确认调节性T细胞的染色效果）。
注意：应尽可能使用与后续染色相同的组织进行IF验证。选择合适的抗原修复液。在本方案中，我们使用Akoya Biosciences提供的AR9缓冲液对所有小鼠黑色素瘤FFPE组织表位进行修复。根据表位需求，也可选用其他抗原修复液，如AR6或通用型修复液。
2. 抗体偶联与验证
- 将....
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结果
本文介绍了一种针对小鼠福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织设计抗体组合、进行多重免疫荧光成像以及对图像进行蛋白质组定量和空间关系分析的实验方案。经验证的抗体组合包含27种抗体，可用于标记黑色素瘤细胞（SOX10）、白细胞（CD45）、T细胞（CD3、CD4、CD8、FOXP3）、B细胞（CD20）、巨噬细胞及其亚型（F4/80、CD68、CD86、CD163、CD206）、树突状细胞（CD11c）、自然杀伤细胞（NK1.1）以及内皮细胞（CD31）。完整的抗体组合还包括其他免疫细胞群体的标记物（CD11b、CD38）、增殖活性（Ki67）、T细胞功能相关分子（T-bet、Eomesodermin、颗粒酶B）、抗原呈递相关分子（LMP2、beta-2 microglobulin、MHC II）以及免疫检查点分子（TIM3、LAG3、PD-L1）12。代表性凝胶电泳图像证实了DNA寡核苷酸条形码成功连接至无载体抗体，如图4所示。该步骤仅用于确认化学偶联反应的成功，而抗体.......
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讨论
成像的成功取决于经过精心设计和验证的抗体组合。对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行多重免疫荧光成像时面临诸多挑战，主要由于组织自发荧光较强，以及石蜡包埋导致抗原表位被掩盖而难以有效恢复。然而，鉴于FFPE样本相比新鲜冷冻（FF）样本具有多种优势，设计并验证适用于FFPE样本的抗体组合显得尤为重要。首先需确定在免疫荧光（IF）成像中能够产生阳性信号的抗体克隆；随后，必须将其与DNA条形码进行精确偶联。抗体偶联过程需要对抗体进行部分还原，以生成巯基（SH键），进而与条形码上的马来酰亚胺基团发生反应。并非所有抗体克隆都能耐受该还原步骤，某些反应可能对抗体造成不可逆损伤，即使偶联成功，最终仍可能导致成像失败。因此，尽管某些抗体在传统的IF验证中显示阳性信号，仍必须在实际研究的目标组织上验证每个抗体，并记录该组织所需的理想曝光时间，以评估抗体偶联的最终效果。在未来应用中，该技术可与连续切片或同一张切片上的现有空间转录组学分析相结合，从而获得更深入的研究洞察。该方法的一个局限性在于，需根据靶标分子和组织类型，对组合中的每一个抗体进行谨慎筛选和验证。
在图像分析方面，QuPath 提供了一.......
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披露
J.C.S. 感谢 Emerson Collective LLC 和美国国立卫生研究院提供的资金支持。J.J.G. 也感谢美国国立卫生研究院提供的资助。J.C.S. 与 Palleon Pharmaceuticals Inc. 存在合作关系，该关系涉及资助拨款。S.Y.T. 和 J.J.G. 与 OncoSwitch Therapeutics 存在涉及股权或股票的合作关系。S.Y.T.、J.J.G.、J.C.S. 和 K.M.L. 拥有一项待审批的专利。其他所有作者声明，他们不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能被认为会影响本文所呈现的研究。
致谢
J.C.S. 感谢皮肤病学基金会和皮肤病病理学职业发展奖对作者职业生涯的支持。作者感谢美国国家癌症研究所癌症数据科学实验室的 Hsin-Pei Lee 在计算分析技术方面提供的帮助。本研究获得了 Emerson Collective 和美国国立卫生研究院（R37CA246699、P41EB028239 和 R01CA228133）的资助。此外，约翰斯·霍普金斯大学肿瘤组织服务（OTS）核心设施得到了美国国立卫生研究院（P30CA006973）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16% 多聚甲醛（PFA） | Electron Microscopy Sciences | PN# 15710 | 组织染色过程中必需 |
| 50 kDa 分子量截留值滤膜 | Millipore | UFC505096 | 使用 25 kDa 和 100 kDa 滤膜会导致失败 |
| Akoya 条形码与报告分子 | Akoya Biosciences | Varied | 每种条形码可用于偶联 50 µg 无载体抗体，并附带两瓶报告分子 |
| 抗体偶联试剂盒 | Akoya Biosciences | 7000009 | 该偶联试剂盒用于制备定制的条形码偶联抗体。每个试剂盒包含足够进行十次偶联反应的试剂。试剂盒由两个子试剂盒组成：一个储存在 4 °C，另一个储存在 -20 °C。4 °C 子试剂盒包含滤膜封闭液、还原液2、偶联液、纯化液和抗体储存液。-20 °C 子试剂盒包含还原液1。 |
| Beta2MG | Abcam | ab214769 | |
| CD11b | CST | #41028 | |
| CD11C | CST | #39143SF | |
| CD163 | CST | #68922BF | |
| CD20 | CST | #45839 | |
| CD206 | CST | #87887 | |
| CD3 | CST | #24581 | |
| CD31 | CST | #92841 | |
| CD38 | CST | #68336BF | |
| CD4 | Abcam | ab271945 | |
| CD45 | CST | #98819 | |
| CD68 | CST | #29176 | |
| CD8 | Invitrogen | #14-0808-82 | |
| CD86 | CST | #20018 | |
| 二甲基亚砜 | Avantor/VWR | BDH1115-4LP | |
| EOMES | Abcam | ab222226 | |
| Eppendorf PCR 管 | Eppendorf | E0030124286 | 用于储存 5 μL 偶联抗体，以通过凝胶电泳确认偶联效果 |
| 200 证明乙醇 | |||
| F4/80 | CST | # 25514 | |
| FoxP3 | CST | #72338 | |
| Gran-B | CST | #79903SF | |
| 加热烘箱 | |||
| 杂交室 | 用于使用抗体混合物对组织进行染色 | ||
| 过氧化氢 | Sigma | #216763 | 配制漂白液时必需 |
| Instant Pot 压力锅或 Decloaking Chamber ARC | Instant Pot 或 Biocare Medical | ||
| Ki-67 | Akoya Biosciences | ||
| LAG3 | CST | #80282BF | |
| LMP2 | Abcam | ab243556 | |
| 甲醇 | |||
| MHC-II | eBioscience | #14-5321-82 | |
| NK1.1 | CST | #24395SF | |
| 核染料 | Akoya Biosciences | 7000003 | |
| PDL1 | CST | #85095 | |
| 剪切鲑鱼精子 DNA（10 mg/mL） | Invitrogen | AM9680 | 在报告分子板制备步骤中可作为检测试剂（Akoya）的替代品。 |
| SOX-10 | Abcam | ab245760 | |
| PhenoCycler-Fusion 染色试剂盒 | Akoya Biosciences | 7000017 | PhenoCycler-Fusion 样本试剂盒包含使用 PhenoCycler 条形码偶联抗体对组织进行染色所需的缓冲液和试剂，以及用于全片成像的流动池。每个试剂盒足够进行 10 次 PhenoCycler-Fusion 实验。试剂盒包含一个储存在 4 °C 的子试剂盒、一个储存在 -20 °C 的子试剂盒，以及一包在室温下保存的 10 个流动池。储存在 4 °C 的子试剂盒包含水合缓冲液、染色缓冲液、储存缓冲液、N 阻断剂和 J 阻断剂。储存在 -20 °C 的子试剂盒包含 G 阻断剂、S 阻断剂和固定试剂。 |
| T-bet | CST | #53753 | |
| TIM-3 | CST | #72911 | |
| 超纯无 DNase/RNase 蒸馏水 | Invitrogen | 10977015 | 抗体偶联过程中溶解条形码时必需 |
参考文献
- Schadendorf, D., et al. Melanoma. Lancet. 392 (10151), 971-984 (2018).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathol. 31 (2), 214-234 (2018).
- Marzagalli, M., Ebelt, N. D., Manuel, E. R. Seminars in cancer b....
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