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方法文章

基于DNA条形码的多重免疫荧光成像分析基因重编程小鼠黑色素瘤的福尔马林固定石蜡包埋样本

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DOI：

10.3791/68124

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2025年6月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University, 2Translational Tissue Engineering Center, Johns Hopkins University, 3Johns Hopkins Translational ImmunoEngineering Center, Johns Hopkins University, 4Department of Dermatology, Johns Hopkins University, 5Department of Oncology, Johns Hopkins University, 6Department of Pathology, Johns Hopkins University, 7Convergence Institute, Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center Johns Hopkins University School of Medicine, 8Bloomberg Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 9Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 10Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 11Departments of Neurosurgery and Ophthalmology, Johns Hopkins University School of Medicine, 12Departments of Materials Science & Engineering and Chemical & Biomolecular Engineering, Johns Hopkins University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案提供了针对基于DNA条形码成像的小鼠FFPE黑色素瘤组织，设计多重免疫荧光抗体组合的逐步操作指南。我们还描述了使用开源工具进行图像分析的流程，以获得关于小鼠黑色素瘤肿瘤免疫微环境的空间蛋白质组学见解。

摘要

本文介绍了一种基于索引共检测（Co-Detection-by-indEXing）的新兴DNA条形码多重成像技术，用于分析组织微环境中的空间蛋白质组学。成功的成像依赖于设计良好且经过充分验证的抗体组合，但目前针对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本的可用抗体组合极为有限。相较于新鲜冷冻样本，FFPE样本具有多项优势，例如来源广泛、易于操作和储存，并可制备组织微阵列（TMA）。本文提供了一种实验方案，用于开发抗体组合，以对经纳米颗粒处理的黑色素瘤小鼠模型的FFPE组织进行可视化与分析；该纳米颗粒可递送编码免疫信号的质粒DNA，从而实现肿瘤微环境的重编程。此外，我们还描述了一个基于开源计算工具的图像分析流程，用于组织标注、细胞分割、蛋白质组数据处理、细胞群体表型鉴定以及空间参数的量化分析。该方案适用于小鼠FFPE样本中抗体组合的设计，并有助于深入理解复杂组织微环境中空间蛋白质组学的特征。

引言

皮肤黑色素瘤是最常见的皮肤癌，其发病率和死亡率在全球范围内因诊断时间和初级保健的不同而有所差异1。在过去十年中，对黑色素瘤生物学特性的深入理解推动了用于治疗实体瘤的新癌症模型的开发2。近年来免疫疗法的兴起，催生了一种基于激活内源性免疫系统的革命性癌症治疗理念3,4。

肿瘤微环境（TME）极为复杂，包含多种免疫细胞、癌症相关成纤维细胞、周细胞、内皮细胞以及各种组织驻留细胞5。过去已采用多种技术用于研究TME，例如流式细胞术和单细胞测序，但这些方法需破坏肿瘤组织，因而会丢失空间信息。传统的显微镜成像技术，如免疫荧光（IF）和免疫组织化学（IHC），可在不破坏样本组织的情况下实现蛋白质生物标志物的可视化。然而，这些方法通常仅限于检测两到三种生物标志物，无法全面揭示复杂TME内部的空间与结构关系6。

为了解决这一问题，已开发出多种多重成像技术，用于在空间上可视化复杂的肿瘤微环境（TME）7,8,9,10。其中一种技术称为索引共检测法（CoDetection-by-inDEXing），现更名为PhenoCycler系统，该系统基于DNA寡核苷酸偶联抗体11。该系统可对人源样本实现超过100种生物标志物的单细胞成像与分析。然而，可用于可视化和分析小鼠样本（尤其是福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本）的现成抗体极为有限12。相较于新鲜冷冻（FF）保存，FFPE具有多项优势，包括更便于操作和储存、组织形态长期保存良好，以及最重要的一点——能够制备组织/肿瘤微阵列（TMA），从而在单张切片上同时观察多个样本。我们近期设计并开发了一套适用于小鼠FFPE样本的CODEX/PhenoCycler抗体 panel，并成功应用于基因重编程小鼠黑色素瘤样本的空间蛋白质组学可视化与分析13。

本实验方案的总体目标是提供设计小鼠FFPE抗体 panel 的逐步指南，并描述抗体-条形码偶联、组织染色和成像的过程。此外，我们还介绍了一种利用开源工具（如QuPath和R语言程序包）进行详细图像分析的流程。按照本方案操作后，研究人员将学会如何设计定制偶联的抗体 panel，使用Phenocycler-Fusion设备进行多重成像，并获得关于黑色素瘤肿瘤微环境（TME）空间蛋白质组学的新见解。此外，本方案可被调整用于研究多种肿瘤免疫微环境，并可与现有的空间转录组学技术相结合。

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方案

所有动物实验均依照约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会制定的指南进行，并使用批准的方案编号MO18M388和MO21M384。

1. 抗体选择

  1. 根据目标组织及特定生物标志物的丰度设计抗体组合。依据文献中免疫荧光（IF）和免疫组化（IHC）染色的成功应用记录选择抗体克隆。确保获取这些抗体的无载体形式。
    注意：用于条形码偶联的抗体必须为不含载体的纯化抗体。避免使用任何基于蛋白质的防腐剂，如BSA、谷蛋白、甘油等。若无法获得无载体抗体，可向供应商定制抗体，或使用BSA去除试剂盒制备无载体抗体。叠氮化钠不会干扰抗体偶联。推荐使用IgG亚型而非IgM亚型。
  2. 利用传统的免疫荧光（IF）成像技术在目标组织上验证所选克隆11。采用双重IF成像确认某些克隆的特异性（例如，对FOXP3和CD4进行双重IF成像以确认调节性T细胞的染色效果）。
    注意：应尽可能使用与后续染色相同的组织进行IF验证。选择合适的抗原修复液。在本方案中，我们使用Akoya Biosciences提供的AR9缓冲液对所有小鼠黑色素瘤FFPE组织表位进行修复。根据表位需求，也可选用其他抗原修复液，如AR6或通用型修复液。

2. 抗体偶联与验证

  1. 将经过验证的抗体分配至带有互补报告分子的条形码，这些报告分子分别连接至 ATTO550 (Cy3)、AF647 (Cy5) 或 AF750 (Cy7) 荧光染料。低丰度抗原通常产生较弱信号，建议将此类抗体偶联至自发荧光背景较低的通道，如 AF647 (Cy5)；而高表达抗原则可偶联至 ATTO550 (Cy3) 和 AF750 (Cy7)，以避免自发荧光干扰。
    注意：此关键步骤需考虑通道灵敏度和抗原丰度。由于FFPE组织的自发荧光较强，不建议在AF488通道中使用。
  2. 抗体条形码偶联（4.5 小时）：获取抗体偶联试剂盒。除还原溶液 1 需分装成一次性使用小瓶并于 -20 °C 保存外，其余试剂均于 4 °C 保存。
    1. 使用分光光度计测定抗体浓度。
    2. 开始抗体偶联时，将500 µL滤膜封闭液加入50 kDa分子量截留值（MWCO）的滤管中，以阻断抗体与滤膜的非特异性结合。在12,000 x g 室温（RT）孵育2分钟。使用200 µL移液器从柱中去除多余液体。
      注意：还原溶液1为一次性使用的小瓶装溶液，每次可满足三个抗体偶联反应的需要。溶液解冻后不可重复使用，剩余试剂应丢弃。在50 kDa截留分子量滤柱上不可使用滤膜，否则可能导致纯化和偶联效果不佳。
    3. 使用50 µg等量体积的抗体溶液，加入50 kDa截留分子量（MWCO）的滤膜管中。如需要，用PBS调节总体积至100 µL。在12,000 x g 4 °C下离心8分钟。在此期间，为三次抗体偶联反应配制还原主混合液，每份使用19.8 µL还原溶液1与825 µL还原溶液2。
    4. 弃去滤液，向每个滤芯顶部加入 260 µL 还原主混合液。涡旋震荡滤芯中的溶液 2–3 秒，在室温下孵育 30 分钟。
      注意：孵育时间不得超过30分钟，以避免抗体过度还原，否则会损伤抗体，导致偶联失败。
    5. 孵育30分钟后，以12,000 x g离心沉淀 g 4 °C 下离心 8 分钟，弃去柱底部的流穿液。向柱上部加入 450 µL 偶联溶液，12,000 x g 4 °C下离心8分钟。离心期间，准备CODEX条形码溶液。从-20 °C取出条形码后需迅速操作，因为条形码会开始降解。
      注意：条形码通常以冻干粉或冻干碎片形式提供，存放于小型玻璃小瓶中，并于 -20 °C 保存。每瓶可用于一次性偶联 50 µg 抗体。建议每次偶联的抗体种类不超过三种。
    6. 仔细找到玻璃小瓶底部的冻干条形码（也可能附着在瓶壁上）。轻敲玻璃小瓶，使固体沉降至底部。在用 10 µL 无核酸酶的分子生物学级水溶解时，准确定位冻干产物至关重要。加入 10 µL 无核酸酶水后，再向每个条形码中加入 210 µL 偶联溶液。通过上下吹打轻轻混匀，确保所有冻干物质完全溶解。放置备用。
    7. 完成步骤 2.2.5 的离心后，弃去滤液，并将步骤 2.2.6 中相应的条形码溶液加入各滤膜单元的顶部。保留 1 µg 初始未偶联抗体；该样品将在凝胶电泳验证时与 5 µL 偶联抗体样品一同上样。
    8. 用相应的抗体名称和条形码名称标记每根试管。盖紧管盖，涡旋混匀2-3秒。室温下孵育抗体-条形码偶联反应2小时。
    9. 孵育2小时后，取出5 µL偶联抗体，置于0.2 mL PCR管中保存，用于通过凝胶电泳验证偶联效果。
    10. 将剩余的偶联抗体溶液在12,000 x g条件下离心 g 4°C下离心8分钟。向柱子顶部加入450 µL纯化溶液，于12,000 x g离心 g 4 °C 条件下离心 8 分钟，弃去滤过液。重复此纯化步骤 2 次，每次加入 450 µL 纯化溶液，离心去除上清。
    11. 3之后rd 离心，弃去滤过液。顶部滤膜将含有条形码偶联的抗体。
    12. 为收集偶联抗体，使用相应的抗体名称和条形码标记用于承接滤柱的新外管。离心前将外管盖子剪掉。向每个滤柱单元中加入100 µL抗体储存液，并将新标记的外管倒置在滤柱上方。
    13. 倒置滤柱，使偶联抗体收集到外管中，3,000 x g 离心 g 室温下静置2分钟，应收集约120 µL偶联抗体溶液。转移至无菌微量离心管中，于4 °C保存18-24个月。
      注意：为避免偶联后出现高背景的细胞核染色，建议这些抗体至少在2天内不要使用。
  3. 按照已发表的实验方案，通过凝胶电泳进行偶联确认13.
    注意：此步骤仅用于确认将条形码与抗体进行化学偶联的反应是否成功。该步骤为可选，因为抗体的有效性验证只有在组织成功染色和成像后才能进行。

3. 小鼠 FFPE 标本制备

  1. 获取植入B16F10侧腹肿瘤的C57BL/6J雌性小鼠的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本。在植入后第9、11、16和18天，通过瘤内注射给予基于聚(β-氨基酯)的纳米颗粒（含4-1BBL和IL-12质粒），并联合腹腔注射抗PD1抗体14。于第20天处死小鼠，将肿瘤组织用10%福尔马林固定，石蜡包埋，并在约翰·霍普金斯大学肿瘤组织服务中心进行切片。
  2. 根据用户手册提供的成像区域规格，小心地将5 µm厚的组织切片置于载玻片的成像区域内。我们能够在单张载玻片上放置四个不同的肿瘤样本。
    注意：必须使用推荐的专用成像载玻片，例如Leica Apex粘附载玻片或Fisherbrand Superfrost Plus载玻片，以确保流式池能够牢固地附着于载玻片表面。

4. 石蜡包埋组织染色与成像

  1. 抗体浓度和曝光时间的验证与优化：为验证抗体-条形码偶联的成功，使用6-9种已偶联的抗体对目标组织进行染色。运行多重成像设备，并记录每种抗体的浓度和曝光时间。根据需要调整稀释比例和曝光时间，然后将6-9种新抗体与先前已验证的抗体一同运行，并记录任何调整。请按照以下步骤进行染色和成像。
  2. 组织染色与成像
    1. 染色前一天，将福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片置于60 °C烘箱中过夜烘烤。次日，在开始脱蜡和组织复水步骤前，于室温下冷却切片10分钟。
    2. 通过将组织在二甲苯溶液中孵育两次、每次5分钟，开始脱蜡过程。
    3. 为复水组织，依次将其转移至两轮100%乙醇溶液中，每轮5分钟。接着，将其依次转移至90%、70%、50%和30%的梯度乙醇溶液中，每种浓度各5分钟。最后，用蒸馏水洗涤组织两次，每次5分钟。
      注意：可使用毒性较低的二甲苯替代品（如Neoclear溶液）进行脱蜡步骤。脱蜡和复水操作应在通风橱中进行。
    4. 使用蒸馏水将10x AR9缓冲液稀释至1x。向Copl罐中加入50 mL 1x AR9缓冲液，确保切片完全浸没在抗原修复缓冲液中。
    5. 在压力锅中加入水，使液面达到Copl罐高度的一半，然后在高压条件下孵育20分钟。
      注意：可使用专用压力锅或Decloaking Chamber，设置为120 °C、10分钟，以获得更佳的抗原修复效果。
    6. 完成压力锅步骤后，将切片冷却45-60分钟。用蒸馏水冲洗切片两次，每次2分钟。然后将切片转移至含有1x PBS的容器中。
    7. 为减少自发荧光，在抗体染色前对组织进行漂白处理。使用推荐试剂和浓度新鲜配制漂白液（25 mL 1x PBS + 0.8 mL 1M NaOH + 4.5 mL H2O2）。将切片置于含漂白液的塑料容器中，并在两个LED灯之间室温孵育45分钟。更换新鲜漂白液，再重复孵育45分钟。
    8. 在漂白过程中开始配制抗体混合液，特别是当抗体组合中包含多种不同稀释比例的抗体时。取出全部四种阻断剂（G、S、J和N），并置于冰上，因为部分试剂从-20 °C取出后需要较长时间解冻。
    9. 光漂白后，用1x PBS洗涤组织两次，每次2分钟。将组织转移至含有复水缓冲液的容器中，再洗涤两次，每次2分钟。
    10. 将组织切片转移至染色缓冲液中，平衡30分钟。若尚未在漂白期间配制抗体混合液，可在此期间完成配制。
    11. 配制300 µL抗体混合液用于染色两张切片（通常情况下，若使用杂交塑料腔室，每张 切片需100-120 µL抗体混合液即可）。
    12. 在湿盒中加入抗体混合液，于4 °C过夜孵育以完成染色。
      注意：此处所有抗体在4 °C过夜染色时均显示阳性信号。然而，每种抗体的染色时间和温度可能不同，需进行优化。最常用的染色条件为室温3小时或4 °C过夜。如有需要，也可先在不同温度下对部分抗体进行初步染色，再于4 °C过夜孵育剩余抗体。若需进行顺序染色，后续需用PBS洗涤组织。
    13. 次日，进行染色后固定。移除塑料腔室，并将收集的抗体混合液储存于4 °C。在染色缓冲液中洗涤切片两次，每次2分钟。随后将切片转移至40 mL染色后固定液（4 mL 16%多聚甲醛 + 36 mL储存缓冲液）中，孵育10分钟。用PBS冲洗三次，每次2分钟。
    14. 将切片转移至冰甲醇中5分钟，然后用PBS冲洗三次，每次2分钟。在湿盒中向切片上加入终末固定液（1管20 µL + 1 mL PBS）。通常每张切片使用200 µL固定液即可。室温孵育20分钟。最后用PBS进行三次终末洗涤，每次2分钟。
      注意：固定液管不应提前从-20 °C取出；仅在使用前解冻。
    15. 若立即成像，使用无绒布擦拭组织周围的切片区域，并使用流动池组装设备压合流动池30秒。若延迟成像，将切片（不加流动池）置于储存缓冲液中，于4 °C保存。准备成像时，先将切片从储存缓冲液转移至PBS中10分钟，再安装流动池。
  3. 根据实验所需的循环次数，开始配制含添加剂的1x运行缓冲液。通过将1份DMSO与4份运行缓冲液混合，配制低DMSO缓冲液（1:4）；通过将9份DMSO与1份运行缓冲液混合，配制高DMSO缓冲液（9:1），以满足所需循环条件。预留约20 mL含添加剂的1x缓冲液用于制备报告分子板。关于所需含添加剂的1x缓冲液及高低DMSO缓冲液的用量计算，请咨询仪器管理员。
  4. 开始制备报告分子板。首先，根据总循环数配制所需的报告分子储备液。使用黑色或琥珀色1 mL微量离心管，并标记循环名称。向对应管中加入250 µL报告分子储备液和每种报告分子各5 µL。然后将溶液转移至黑色96孔板中，并用压敏封口膜密封。
  5. 启动设备，使用仪器管理员设置参数和曝光时间（参见表1），并采集图像。图1总结了染色前和染色后的流程。

5. 组织标注与细胞分割

  1. 建立项目和工作区。
    1. 安装最新版本的数字病理分析软件（例如 QuPath 0.5.1 或更高版本）。点击 创建项目 为项目空间选择一个目标文件夹。
    2. 点击 添加图片 > 选择文件，然后导航至QPTIFF文件（由多重免疫荧光成像生成）。将图像类型设置为 荧光，保留所有其他默认设置，然后单击 导入.
    3. 如果使用 QuPath，双击新图像以打开工作区。点击 文件 > 保存 定期跟踪项目中所做的更改。使用切换标记可见性和视图设置 亮度 & 对比 （工具栏中部的半月形图标）。
      注意：右键单击图像列表中的图像可对其重命名。此操作在后续可视化表型分类时尤为重要。
  2. 标注完整组织切片、肿瘤内部区域和间质区域。
    1. 使用画笔工具和/或魔棒工具在整张组织切片周围绘制注释。将此注释定义为 Full_Tissue。排除覆盖的皮肤和/或任何不应被分析的区域。如需创建负向注释和/或缩小注释边界，请按住 替代 使用注释工具时按住键。
    2. 复制完整的组织注释。选择 注释 在“注释”选项卡下，然后转到 物体 > 注释... > 复制所选注释.
    3. 打开 SOX10 通道在复制的注释上，使用以下方法缩小注释边界以捕获肿瘤内部区域 Alt + 画笔/魔棒工具. 将此注释定义为肿瘤（图2).
    4. 选择完整的组织注释，前往 物体 > 注释... > 展开注释定义 扩张半径 1 μm，然后单击 运行.
    5. 将新注释重命名为 Full_Tissue_Expansion。选择 肿瘤标注，右键单击，然后选择 插入到层级结构中.
    6. 重新选择 肿瘤标注，前往 物体 > 注释... > 反转. 将此新注释定义为间质。对所有组织切片重复此操作。
  3. 运行细胞分割并导出结果。
    1. 前往 图像 切换以查找图像的像素宽度和高度（图3A).
    2. 在 https://github.com/qupath/qupath-extension-stardist/releases 下载 StarDist 扩展程序。将 qupath-extension-stardist-[version].jar 文件拖入 QuPath 窗口，然后点击 QuPath 窗口右上角的齿轮图标。在 扩展应用，定义 QuPath 用户目录 作为 StarDist 文件夹的位置。
    3. 从 https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis 下载 StarDist groovy 脚本文件和 StarDist 模型文件（StarDist 脚本最初由 Akoya Biosciences 整理）。
    4. 对于每个组织切片，选择两者 肿瘤 和 基质标注 （按住 Ctrl 键以选择多个注释）。在顶部设置栏中，单击 自动化 > 脚本编辑器 打开脚本界面。根据图像像素大小，选择相应的StarDist细胞分割脚本（groovy文件）。当提示选择细胞分割文件时，打开stardist_cell_seg_model.pb文件。
    5. 细胞分割完成后，保存图像。前往 测量 > 导出测量结果，然后选择 对应的图像. 将导出类型指定为细胞，分隔符指定为.csv，然后选择 输出文件 位置。单击 填充 包含感兴趣指标的列。需要导出的重要列包括 Image、Object ID、Parent、Centroid X、Centroid Y 和 Nucleus Area。
      注意：对象 ID 将在后续步骤中用于在数字病理分析软件中将分类结果重新映射回多重免疫荧光图像。父级列指示细胞所属的注释名称。X 和 Y 数据用于空间分析。
    6. 针对用于聚类/表型分析的每一种谱系标志物，选择一个均值进行导出。对于核标志物（如 SOX10 和 FOXP3），导出“细胞核：均值”选项；对于细胞质/膜标志物（如 CD45、CD3、CD4），导出“细胞质：均值”选项。

6. 蛋白质组学数据预处理与标准化

  1. 打开导出的 CSV 文件。对于将用于聚类/表型分析的每个标记物，截断列标题名称，仅保留标记物名称。例如，将“SOX10: Nucleus: Mean”重命名为“SOX10”，将“CD3: Cytoplasm: Mean”重命名为“CD3”。
  2. 安装最新版本的 R 和 RStudio。从 https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis 下载 Marker Normalization.R 文件并运行该脚本。首先需根据细胞核大小对细胞进行过滤。
  3. 对每个标记物进行最小-最大归一化处理，使表达范围内的最低 MFI 值设为 0，第 99.7th 百分位的 MFI 值设为 1。所有高于第 99.7th 百分位的强度值均被截断至 1。完成后，保存生成的包含归一化数据的新 CSV 文件。

7. 聚类与表型分析

  1. 根据标志物表达谱选择一种用于细胞聚类的算法。在 https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis 上提供了使用 Seurat v4.415 和 FlowSOM v2.13.9（聚类与可视化工具）16 进行聚类的 R 脚本。
  2. 根据关键谱系标志物的表达谱对细胞进行表型鉴定。本方案中使用了 14 种谱系标志物进行聚类和表型分析：SOX10、CD45、CD3、CD4、CD8、FOXP3、CD11C、F4/80、CD68、CD86、CD163、CD206、NK1.1 和 CD31。
    1. 将肿瘤细胞定义为 SOX10hi；将 CD4 T 细胞定义为 CD45mod-hi/CD4hi/CD8low/FOXP3low；将 CD8 T 细胞定义为 CD45mod-hi/CD8hi/CD4low；将调节性 T 细胞（Tregs）定义为 CD45mod-hi/CD4hi/CD8low/FOXP3hi；将其他 T 细胞定义为 CD45mod-hi/CD3hi/CD4low/CD8low。
    2. 将 M1 巨噬细胞定义为 CD45mod-hi/F4/80hi/CD68hi/CD86hi/CD163low/CD206low；将 M2 巨噬细胞定义为 CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86low/CD163hi/CD206low、CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86low/CD163low/CD206hi 或 CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86low/CD163hi/CD206hi；将其他巨噬细胞定义为 CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86low/CD163low/CD206low 或 CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86hi/CD163hi/CD206hi。
    3. 将树突状细胞定义为 CD45mod-hi/CD11chi/CD86mod-hi；将 NK 细胞定义为 CD45mod-hi/NK1.1hi；将其他免疫细胞定义为符合 CD45mod-hi 但不满足上述具体条件的细胞；将内皮细胞定义为 CD31mod-hi；剔除所有其他表达谱。

8. 重新映射表型分类并执行质量控制

  1. 从 https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis 下载 Remapping Classifications.groovy 脚本（该脚本改编自 petebankhead 在 https://forum.image.sc/ 上发布的一篇帖子）。
  2. 打开已表型分型的 CSV 文件，并确保“图像”选项卡下的所有标签名称与将用于重映射的数字病理分析软件中图像文件的名称完全一致。若需在 CSV 文件中快速批量修改标签，可使用“全部替换”功能。
  3. 若使用 QuPath，通过点击 自动化 > 脚本编辑器 来运行分类重映射的 Groovy 脚本文件。
  4. 在“注释”选项卡中，点击“自动设置”按钮旁的 三个点，然后依次点击 从已有对象填充 > 所有类别（包括子类）> 是。
  5. 向下滚动标记列表，查看不同的表型分类，并根据需要调整配色方案。双击任意单元格可查看其表型（位于“分类”标签旁）和聚类信息（位于“名称”标签旁）。检查具有代表性的视野，评估表型分配的准确性，并根据需要调整表型策略（图 3B）。

9. 密度定量与空间分析

  1. 表型分析完成后，在数字病理分析软件的“注释”选项卡下获取注释区域面积。将面积单位转换为 mm2，然后用细胞计数除以注释区域面积，计算出密度值。
  2. 从 https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis 下载 SPIAT 空间分析.R 脚本并运行。收集关于平均最小距离（AMD）、邻域组成和标准化混合评分（NMS）的数据。
  3. 使用统计分析软件生成图表以展示结果。在为不同处理条件的平均最小距离生成单个热图时，需对来自不同组织切片的结果进行平均。

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结果

本文介绍了一种针对小鼠福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织设计抗体组合、进行多重免疫荧光成像以及对图像进行蛋白质组定量和空间关系分析的实验方案。经验证的抗体组合包含27种抗体，可用于标记黑色素瘤细胞（SOX10）、白细胞（CD45）、T细胞（CD3、CD4、CD8、FOXP3）、B细胞（CD20）、巨噬细胞及其亚型（F4/80、CD68、CD86、CD163、CD206）、树突状细胞（CD11c）、自然杀伤细胞（NK1.1）以及内皮细胞（CD31）。完整的抗体组合还包括其他免疫细胞群体的标记物（CD11b、CD38）、增殖活性（Ki67）、T细胞功能相关分子（T-bet、Eomesodermin、颗粒酶B）、抗原呈递相关分子（LMP2、beta-2 microglobulin、MHC II）以及免疫检查点分子（TIM3、LAG3、PD-L1）12。代表性凝胶电泳图像证实了DNA寡核苷酸条形码成功连接至无载体抗体，如图4所示。该步骤仅用于确认化学偶联反应的成功，而抗体...

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讨论

成像的成功取决于经过精心设计和验证的抗体组合。对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行多重免疫荧光成像时面临诸多挑战，主要由于组织自发荧光较强，以及石蜡包埋导致抗原表位被掩盖而难以有效恢复。然而，鉴于FFPE样本相比新鲜冷冻（FF）样本具有多种优势，设计并验证适用于FFPE样本的抗体组合显得尤为重要。首先需确定在免疫荧光（IF）成像中能够产生阳性信号的抗体克隆；随后，必须将其与DNA条形码进行精确偶联。抗体偶联过程需要对抗体进行部分还原，以生成巯基（SH键），进而与条形码上的马来酰亚胺基团发生反应。并非所有抗体克隆都能耐受该还原步骤，某些反应可能对抗体造成不可逆损伤，即使偶联成功，最终仍可能导致成像失败。因此，尽管某些抗体在传统的IF验证中显示阳性信号，仍必须在实际研究的目标组织上验证每个抗体，并记录该组织所需的理想曝光时间，以评估抗体偶联的最终效果。在未来应用中，该技术可与连续切片或同一张切片上的现有空间转录组学分析相结合，从而获得更深入的研究洞察。该方法的一个局限性在于，需根据靶标分子和组织类型，对组合中的每一个抗体进行谨慎筛选和验证。

在图像分析方面，QuPath 提供了一...

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披露

J.C.S. 感谢 Emerson Collective LLC 和美国国立卫生研究院提供的资金支持。J.J.G. 也感谢美国国立卫生研究院提供的资助。J.C.S. 与 Palleon Pharmaceuticals Inc. 存在合作关系，该关系涉及资助拨款。S.Y.T. 和 J.J.G. 与 OncoSwitch Therapeutics 存在涉及股权或股票的合作关系。S.Y.T.、J.J.G.、J.C.S. 和 K.M.L. 拥有一项待审批的专利。其他所有作者声明，他们不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能被认为会影响本文所呈现的研究。

致谢

J.C.S. 感谢皮肤病学基金会和皮肤病病理学职业发展奖对作者职业生涯的支持。作者感谢美国国家癌症研究所癌症数据科学实验室的 Hsin-Pei Lee 在计算分析技术方面提供的帮助。本研究获得了 Emerson Collective 和美国国立卫生研究院（R37CA246699、P41EB028239 和 R01CA228133）的资助。此外，约翰斯·霍普金斯大学肿瘤组织服务（OTS）核心设施得到了美国国立卫生研究院（P30CA006973）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% 多聚甲醛（PFA）Electron Microscopy SciencesPN# 15710组织染色过程中必需
50 kDa 分子量截留值滤膜MilliporeUFC505096使用 25 kDa 和 100 kDa 滤膜会导致失败
Akoya 条形码与报告分子Akoya BiosciencesVaried每种条形码可用于偶联 50 µg 无载体抗体，并附带两瓶报告分子
抗体偶联试剂盒Akoya Biosciences7000009该偶联试剂盒用于制备定制的条形码偶联抗体。每个试剂盒包含足够进行十次偶联反应的试剂。试剂盒由两个子试剂盒组成：一个储存在 4 °C，另一个储存在 -20 °C。4 °C 子试剂盒包含滤膜封闭液、还原液2、偶联液、纯化液和抗体储存液。-20 °C 子试剂盒包含还原液1。
Beta2MGAbcam ab214769
CD11bCST #41028
CD11CCST #39143SF
CD163CST #68922BF
CD20CST #45839
CD206CST #87887
CD3CST #24581
CD31CST #92841
CD38CST #68336BF
CD4Abcam ab271945
CD45CST #98819
CD68CST #29176
CD8Invitrogen #14-0808-82
CD86CST #20018
二甲基亚砜Avantor/VWRBDH1115-4LP
EOMESAbcam ab222226
Eppendorf PCR 管EppendorfE0030124286用于储存 5 μL 偶联抗体，以通过凝胶电泳确认偶联效果
200 证明乙醇
F4/80CST # 25514
FoxP3CST #72338
Gran-BCST #79903SF
加热烘箱
杂交室用于使用抗体混合物对组织进行染色
过氧化氢Sigma#216763配制漂白液时必需
Instant Pot 压力锅或 Decloaking Chamber ARCInstant Pot 或 Biocare Medical
Ki-67Akoya Biosciences
LAG3CST #80282BF
LMP2Abcam ab243556
甲醇
MHC-IIeBioscience #14-5321-82
NK1.1CST #24395SF
核染料Akoya Biosciences7000003
PDL1CST #85095
剪切鲑鱼精子 DNA（10 mg/mL）InvitrogenAM9680在报告分子板制备步骤中可作为检测试剂（Akoya）的替代品。
SOX-10Abcam ab245760
PhenoCycler-Fusion 染色试剂盒Akoya Biosciences7000017PhenoCycler-Fusion 样本试剂盒包含使用 PhenoCycler 条形码偶联抗体对组织进行染色所需的缓冲液和试剂，以及用于全片成像的流动池。每个试剂盒足够进行 10 次 PhenoCycler-Fusion 实验。试剂盒包含一个储存在 4 °C 的子试剂盒、一个储存在 -20 °C 的子试剂盒，以及一包在室温下保存的 10 个流动池。储存在 4 °C 的子试剂盒包含水合缓冲液、染色缓冲液、储存缓冲液、N 阻断剂和 J 阻断剂。储存在 -20 °C 的子试剂盒包含 G 阻断剂、S 阻断剂和固定试剂。
T-betCST #53753
TIM-3CST #72911
超纯无 DNase/RNase 蒸馏水Invitrogen10977015抗体偶联过程中溶解条形码时必需

参考文献

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