乳液液滴在酶解过程中实时力测量

摘要

本方案采用双光镊实时测量乳液酶解过程中液滴间的相互作用力。该方法有助于研究乳液稳定性及液滴动力学，可应用于食品科学与制药领域。

摘要

本方案介绍了一种利用双光镊研究乳液稳定性及乳液液滴在酶消化过程中动态解体的独特方法。该过程包括制备乳液、引入酶以及构建力测量系统，以实时监测液滴间的相互作用力。通过使用双光镊技术，该方法可实现对乳液液滴的精确操控与观察，从而在酶促解体过程中测量液滴间的相互作用力。这一实验技术为理解消化过程中乳液的相互作用与稳定性提供了重要见解，尤其对食品科学、制药及其他涉及有机乳液的行业研究具有重要意义。该方法具有良好的适应性，可应用于多种光镊装置以及不同类型的乳液或酶体系，是研究各类领域中机械性能与解体过程的通用工具。此外，这种可视化方法具备实时监测力动态变化的优势，为研究乳液在多种应用场景中的行为开辟了新的途径。

引言

乳液是由两种互不相溶的液体组成的非均相体系，其中一种液体以液滴形式分散在另一种液体中。这类体系广泛存在于食品、制药¹、化妆品和石油化工等多个工业领域。乳液的稳定性和功能在很大程度上取决于液滴之间的相互作用，而这些相互作用可受到表面化学性质、环境条件以及酶的存在等多种因素的影响²。

在许多应用中，特别是在食品科学和药物递送领域，乳液会暴露于酶环境中^3,4。例如，在人体消化系统中，摄入的基于乳液的食物和药物会接触到多种酶，这些酶可能改变其结构和功能。了解酶消化过程中液滴相互作用的动力学对于设计稳定且有效的乳液基产品至关重要^5,6。

研究乳液稳定性的传统方法^2,7，例如光散射或流变学测量，能够提供有价值的宏观信息，但无法直接观察和量化单个液滴之间的相互作用⁸。这一局限性阻碍了对乳液酶解过程中发生的微观过程的理解。

光镊已成为操控微观物体以及在微米和纳米尺度上测量力的强大工具⁹。通过利用光的动量，光镊能够以极高的精度捕获和移动单个液滴。这一能力为在复杂环境中研究液滴-液滴相互作用开辟了新的可能性^10,11。

本实验方案介绍了一种独特的方法，将双光镊与实时力测量技术相结合，用于研究乳液液滴在酶消化过程中的相互作用。作为代表性示例，本方法采用由菜籽油或经乳清蛋白稳定的单个脂肪液滴组成的乳液体系，通过胰蛋白酶进行消化。该模型体系在食品科学与营养学中具有重要意义，因其可模拟常见食品乳液及其在消化道中的行为¹²。

该方法能够直接观察和量化乳滴在酶解过程中个体之间的相互作用力，为消化条件下乳液稳定性的动态变化提供了前所未有的洞察。本方法采用光镊系统，即一种先进的双光阱光镊装置，以高精度操控乳滴并测量乳滴间的相互作用力¹³。

该实验技术弥合了宏观乳液研究与分子水平研究之间的差距，为乳液在酶消化过程中的行为提供了独特的观察视角。通过该方法获得的见解对食品工程、药物制剂以及基础胶体科学等多个领域具有深远影响。尽管本文以特定的油-蛋白-酶体系为例进行说明，但所介绍的方法可广泛适用于各行业中多种有机乳液体系及消化酶的研究。

方案

图1展示了双光阱光镊液滴捕获的示意图。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 乳清蛋白分散液的制备

1. 在去离子水中配制5% (w/v)的乳清蛋白分散液。
   1. 使用电子天平准确称取2.5 g乳清蛋白粉末。
   2. 使用量筒量取47.5 mL去离子水。
2. 混合组分。
   1. 将称量好的蛋白粉末和量取的水转移至烧杯中。
   2. 向烧杯中加入一个磁力搅拌子。
3. 密封烧杯。
   1. 用封口膜覆盖烧杯口，以防止蒸发和污染。
4. 搅拌分散液。
   1. 将烧杯置于磁力搅拌器上，设定搅拌速度为1500 rpm（图2A），直至蛋白粉末完全溶解且溶液均匀分散。
5. 使蛋白水合
   1. 为确保乳清蛋白充分水合并尽量减少起泡，应在制备乳液前一天配制该分散液。
   2. 让5%乳清蛋白分散液在室温下持续搅拌过夜。
      警告：确保所有玻璃器皿和工具清洁且无污染物，以免影响蛋白分散效果。
      注：过夜水合步骤对蛋白最佳功能性和乳液稳定性至关重要。省略此步骤可能导致乳化效率降低。本方案部分描述了乳清蛋白分散液的初始制备步骤，该分散液将用于后续乳液制备中稳定菜籽油液滴。后续步骤通常包括水包油乳液的制备、光镊实验系统的搭建，以及胰蛋白酶的引入以开展消化研究。

2. 水包油乳液的制备

1. 优化配方。
   1. 通过将15%的油与85%的蛋白质溶液按体积混合，制备乳液，以获得0.3的蛋白-脂质质量比。
2. 制备脂相。
   1. 菜籽油在室温下为液态。取30 mL菜籽油加入离心管中备用。
   2. 乳脂在室温下为固态。取约五勺乳脂放入离心管中。
   3. 将离心管放入烧杯中，并向烧杯中加入约40 mL去离子水。
   4. 使用数字加热板将烧杯加热至42 °C，并维持该温度30分钟，以确保完全熔化（图2B）。
      注意：乳脂的熔点约为30 °C至40 °C。实验室温度维持在26 °C。熔化的乳脂可在一定时间内保持液态，但若静置，将在室温下逐渐凝固。
3. 混合组分。
   1. 在5 mL离心管中加入0.6 mL油（菜籽油或熔化的乳脂）和3.4 mL已制备的乳清蛋白溶液。
4. 均质乳液。
   1. 使用高剪切混合器（HSM），设定转速为25,000 rpm，混合5分钟（图2C）。
   2. 可选步骤：将粗乳液通过高压均质机处理。典型条件：在500–1000 bar压力下进行2–3次循环。
5. 稀释乳液。
   1. 制备乳液的1:1000稀释液。使用移液器量取4 µL原始乳液，加入3996 µL去离子水中。充分混匀以确保稀释均匀。

3. 光镊的初始设置

1. 准备并清洗微流控流动池（参见材料表）。
   注意：该装置配备六个微流控通道。本实验仅使用一个通道——仅使用图3B中最左侧的通道。
   1. 为准备微流控通道，需清洗所有必要的设备和流动通道。用去离子水彻底冲洗所有设备，确保无残留物。
   2. 清洁时，用乙醇冲洗所需通道。将流速设为1.0 bar，并用乙醇冲洗。实验开始前1小时，将牛血清白蛋白（BSA）注入流动池。BSA可在表面形成一层"阻断"层，以减少乳液液滴或其他生物分子的非特异性吸附。
2. 将制备好的乳液引入实验通道中。
3. 实验前准备仪器。
   1. 打开光镊仪器。
   2. 在物镜下方加入约70 µL去离子水。
   3. 插入样品室，直至听到"咔嗒"声。
   4. 在样品室顶部滴加一滴浸油（图3C）。
   5. 缓慢降低聚光镜，使其轻轻接触样品室的上表面。
   6. 在打开激光前，关闭光镊仪器的防护罩。激光波长为1064 nm。
4. 定位Z平面并调节光路。
   1. 打开激光，将功率设为100%。
   2. 调节光镊系统上的下部旋钮（图3A），以定位激光光斑。从底部向上（顺时针调节）移动时，观察三次出现的激光光斑。将Z平面设定在第二组与第三组激光光斑之间。
      注意：三组激光光斑分别出现在流动池下表面、下层盖玻片上表面以及上层玻片下表面。激光应聚焦于盖玻片上表面与玻片下表面之间。
   3. 将激光功率降低至30%。
   4. 确认屏幕上出现7至11条干涉条纹（图3E）。若条纹数量过多或过少，请调节下部旋钮。
      注意：干涉条纹的数量反映了聚光镜与流动池之间间距的优化程度。当条纹数在7至11范围内时，聚光镜能够有效收集足够的光信号，从而确保测量信号（如力学响应）具有良好的信噪比。此间距还可保持安全距离，避免镜头与流动池接触，并减少光路中的散射或反射干扰。
5. 调节流动通道。关闭不必要的通道，确保仅所需实验通道处于开放状态。
6. 设置激光功率。通常将激光设为100%以捕获液滴，但可根据特定实验条件调整至所需强度。
7. 设置数据存储。配置文件保存目录，以确保实验数据能够立即被采集和保存。

4. 乳液的力-距离曲线测量

1. 将流速设置为 0.5 bar。屏幕上应可见液滴约 5 秒。然后，选择真空停止流动，并关闭通道阀门。
2. 捕获液滴。
   1. 使用操纵杆在通道内捕获两个大小相近的液滴。成功捕获液滴的示意图见图4。
   2. 调节两个液滴之间的距离至约 10 µm。若形成拉伸丝，则会观察到明显的力变化。
   3. 固定右侧光镊的 x 和 y 位置，以及左侧光镊的 y 位置。分别用洋红色和绿色方框标记两个液滴。
3. 测量功率谱密度（PSD）。
   1. 进入校准菜单。
   2. 在左侧屏幕中选择测量。若噪声水平过高，请重复测量直至获得满意结果。
   3. 选择应用以确认校准。
4. 清除原始数据并测量力-距离曲线。
   1. 此时，操纵杆应仅控制左侧光镊。以恒定速度（1.0 µm/s）缓慢移动左侧光镊靠近右侧液滴，直至距离为零。该过程可获得所需的力-距离曲线。
5. 选择数据并保存。
   1. 使用鼠标左键选择感兴趣的数据区间，从液滴间距 10 µm 开始至 0 µm 结束。在 0 µm 距离时，测得的力通常达到最大值。
6. 保存所选数据。
   1. 右键点击保存所选数据段至初始文件夹目录。

5. Tris 缓冲液和胰蛋白酶溶液的制备

1. 配制如下成分的 Tris 缓冲液：11.860 g/L Tris 碱，0.735 g/L 二水合氯化钙（CaCl₂·2H₂O）和 8.766 g/L 氯化钠（NaCl）。将最终体积调至 100 mL。先用盐酸（HCl）将 pH 值调至约 8.4，再用 pH 试纸确认最终 pH 值。
2. 通过将 100 mg 胰蛋白酶 1:250（来源于猪胰腺）溶解于 1000 mL Tris 缓冲液中来配制胰蛋白酶溶液。在 4 °C、500 rpm 条件下用磁力搅拌器搅拌混合物 15 分钟。随后，在 4 °C 下离心 15 分钟。

6. 胰蛋白酶作用与动态检测方案

1. 将胰蛋白酶溶液加入乳液中。
   1. 使用量程为 0.5 µL 至 10 µL 的移液器，吸取 4 µL 胰蛋白酶溶液，并小心地将其加入已制备的 4 mL 乳液中。
2. 进行实时动态监测。
   1. 加入胰蛋白酶溶液后，使用光镊技术对乳液进行动态监测。每 10 分钟进行一次测量，首次测量在加入胰蛋白酶溶液后 10 分钟进行。

7. 数据处理

1. 获取以 .h5 格式存储的实验数据，并使用数据处理环境进行必要的格式转换，生成表格数据文件。转换后的文件包含两个部分，分别记录力（Force）和距离（Distance）数据。
2. 采用曲线拟合技术对这两个部分的数据进行拟合，并将拟合结果以可视化曲线形式绘出，用于进一步分析。

结果

本研究采用光镊技术分析了含有菜籽油和乳清蛋白以及乳脂和乳清蛋白的乳液。首先测量了两种乳液之间的力-距离关系，以建立基线数据（图5A-F）。随后向每种乳液中加入胰蛋白酶，并每隔10分钟重新测量一次力-距离关系。

图5展示了不含胰蛋白酶的两种乳液液滴的力-距离（FD）曲线。随着液滴间距离减小，相互作用力非线性增加，并在液滴接触时形成一个峰值。在未添加胰蛋白酶的情况下，峰值力与液滴直径密切相关。较大的液滴表现出更高的相互作用力。例如，图5C中的液滴直径约为8 µm，其相互作用力超过100 pN；而直径约为3 µm的较小液滴的相互作用力约为10 pN，如图5A所示。

在加入浓度为 0.1 µg/mL 的胰蛋白酶溶液后 10 分钟进行...

讨论

该方法的核心创新在于双光镊与实时力学监测技术的同步运行（图3A），实现了在单液滴水平上的高精度动态分析。通过使用双光镊独立捕获两个液滴，并将其间距精确调节至初始的10 µm（见步骤4.2.2），该方法克服了传统单液滴操控的局限性。图1展示了用于捕获和操控液滴的双光镊原理。在酶消化过程中，以10分钟间隔获取的实时力-距离（FD）曲线测量结果（见步骤6.2.1）揭示了界面力学特性的动态演变过程（图6和图7），捕捉到传统终点检测方法无法观测到的瞬时反应动力学¹⁸。为确保测量准确性，通过PSD校准结合激光功率优化，将力的分辨率提升至pN量级¹⁹，优于缺乏此类参数严谨性的传统微操作方法。

尽管该方法在单液滴力学表征方面表现出色，但仍存在某些局限性。该系统对直径在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bluelake 软件	LUMICKS, 荷兰		光镊控制系统软件
CaCl2.H4O2
圆顶式LED数显加热磁力搅拌器	SCILOGEX	SCI280-Pro
电子天平	上海恒平仪器有限公司	FA1204
HCl
高速匀浆机	宁波科迈仪器有限公司	KM-S10
浸油
光致涡旋混匀装置	上海沪西工业有限公司	Vortex-5S
Microsoft Office Excel	Microsoft
乳脂	SM Mlekovita	Maslo Klarowane
NaCl
光镊平台	LUMICKS, 荷兰	m-trap
Origin 软件	Origin Lab	2024	用于绘制力与距离拟合曲线
移液枪	Eppendorf	10 μL,100 μL,1000 μL
菜籽油	Bunge Polska Sp.z o.o.	Kujawski
封口膜	Parafilm	4IN*125FT
Tris
胰蛋白酶	生工生物工程（上海）股份有限公司	A100458-0010	胰蛋白酶 1:250，来源于猪胰腺
乳清蛋白浓缩物	SM Mlekovita	WPC